תא מונצח
פרוטוקולי תרבות
פרוטוקול תרבות תאים מונצח
אנו מודים לד"ר מרטין דורף באוניברסיטת הרווארד על שייצרו בנדיבות את קווי התאים המונצחים לבנק PRF Cell & Tissue Tissue. תודה.
קווי תאים של PRF הונצחו באמצעות הפרוטוקול הבא:
זיהום רטרווירוס
הפקת וירוס: 12-24 שעות לפני transfection, תאי HEK293 אריזות היו מצופה על צלחת 100 מ"מ ב 60-80% confluency. כל צלחת הועברה בשילוב עם מבנה רטרו-ויראלי 12μg pBABE-puro (SV40T) ו- 12μg pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector. מדיום התרבות נשאב 8-10 שעות לאחר transfection, והוחלף ב 10 מ"ל של מדיום שלם. התרבות הודגרה למשך 48-72 שעות נוספות כדי להשיג כייל נגיפי אופטימלי.
ב. זיהום תאי יעד: תאי היעד היו מצופים על צלחת 100 מ"מ 12-18 שעות לפני ההדבקה. המדיום מתאי האריזה נאסף וסונן דרך פילטר אצטט 0.45 מיקרומטר או פילטר פוליסולפוני. לאחר שהתאים היו מחוברים 40-60%, נוספה מדיום המכיל וירוס 8 מ"ל עם ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל פוליבירן. שלושה סבבי זיהום בוצעו ברצף, בהפרש של ~ 12 שעות. המדיום הוחלף לאחר דגירה של 24 שעות.
ג. בחירת קווי תאים יציבים: 72 שעות לאחר ההדבקה, התאים עוברו טריפסינציה, פוצלו בשעה 1: 3 והועברו לשתי צלחות של 100 מ"מ בנוכחות 3 מיקרומטר / מ"ל פורומיצין, בתוספת לוח בקרה אחד ללא אנטיביוטיקה. מדיום התרבות הוחלף כל יומיים או שלושה במשך כשבועיים עד ארבעה שבועות כדי לייצר שורות תאים יציבות.
מדיה צמיחה
DMEM- Invitrogen # 11960-044 (גלוקוז גבוה ללא L- גלוטמין)
סרום שור עוברי עוברי 15%
1% (1x) פניצילין-סטרפטומיצין (Invitrogen # 15140-122)
1% (1X) ל-גלוטמין (Invitrogen # 25030-081)
0.75 מיקרוגרם / מ"ל פורומיצין (InvivoGen # ant-pr-1)
טריפסין
טריפסין EDTA C. 25% (Invitrogen # 25200-056)
תמיסת המלח המאוזנת של האנק
HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) סידן כלורי, (-) מגנזיום כלורי, (-) מגנזיום סולפט)
DMSO להקפאה
תרבות תאים DMSO
תאים יגיעו קפואים על קרח יבש בריכוז של בערך 5 x 105תאים / בקבוקון
פרוטוקול להפשרת פיברובלסטים
- להפשיר תאים במהירות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- נגב את החלק החיצוני של הבקבוקון בעזרת אתנול 70%.
- העבירו את התאים שהופשרו לבקבוק T25 המכיל 5 מ"ל של אמצעי גידול ללא פורומיצין.
- הניחו את הבקבוק בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, התבונן תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נקשרו.
- הסר חומרי הדפסה והחלף בחומרי צמיחה טריים.
שורות תאי PRF תת-תרבותיות
1) כאשר התאים הוקמו וגדלים, התחל להשתמש בתקשורת המכילה 0.75 μg / ml פורומיצין. המשך לשמור על התאים בתקשורת המכילה 0.75 מיקרוגרם / מ"ל פורומיצין.
2) יש לפצל תאים כאשר הם מאוחדים.
3) לפיצול תאים (אמצעי אחסון שניתנו בהנחה שתאים נמצאים ב- T25):
א. בטכניקה סטרילית, הסר את המדיה ושטף את הבקבוק בעזרת 2-3 מ"ל של HBSS סטרילי. הסר והשלך את HBSS.
ב. הוסף טריפסין 1 מ"ל ודגור במשך 2-3 דקות. יש לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע אם הם החלו להתעגל, להרים ולצוף. אם התאים לא מנותקים לאחר 3 דקות, אתה יכול לדגור עוד 1-2 דקות
ג. מהדקים את הכובע ומכניסים את הבקבוק בעדינות מצד לצד כדי לנתק את כל התאים. ניתן להקיש קלות על הבקבוק על הצד כדי לשחרר תאים במידת הצורך.
ד. הוסף בקבוק 4 של מדיה חדשה ברגע שהתאים צפים כדי להפעיל את הטריפסין. יש לשטוף את צדדי הבקבוק מספר פעמים עם המדיה החדשה בכדי לשטוף את כל התאים מהפלסטיק ולתמיסה. הסר את כל התאים המכילים נוזלים והעביר לחוטם 15ml (או 50 מ"ל אם אתה מאחד בקבוקי 3 או יותר).
ה. בטכניקה סטרילית, הסר גמישות לספירה על hemacytometer.
F. בזמן שאתה סופר תאים, את שאר הפיתרון יש להסתובב בצנטריפוגה הקלינית למשך 5 דקות ב- 1000 rpms.
4) לאחר חישוב ספירת התאים שלך, צלח תאים בגודל 2.5 x 105 תאים לכל בקבוק עליון מסנן T 25.
5) יש להאכיל תאים בכל 2-3 יום עם מדיום גידול טרי המכיל 0.75 מיקרוגרם / מ"ל פורומיצין.
קְפִיאָה:
יש להקפיא תאים במהירות של לא פחות מ- 5x 105 תאים / מ"ל / קריוביאל בתקשורת צמיחה המכיל 10% DMSO ו- 30% FBS ללא פורומיצין ואז הושם בתא הקפאת איזופרופנול בטמפרטורה של -NUMX מעלות הלילה. מעבירים לחנקן הנוזלי למחרת.
למידע נוסף אנא צרו קשר:
לסלי ב. גורדון, ד"ר, דוקטורט
פרופסור למחקר רפואת ילדים בית הספר לרפואה של וורן אלפרט באוניברסיטת בראון ובמחלקה לרפואת ילדים, בית החולים לילדים של הסברו, פרובידנס, מחלקת הרדמה ב- RI, בית החולים לילדים בבוסטון ובית הספר לרפואה בהרווארד, בוסטון, מנהל רפואה MA, הקרן למחקר פרוג'ריה.
טלפון: 978-535-2594
פקס: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
ונדי נוריס
טלפון: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org
הרשמה
בשביל שלנו
עלון!
אנחנו ביחד
WILL
מצא את התרופה!
