דף בחר

פלוריפוטנט מושרש

תאי גזע

 

קרן המחקר Progeria Cell & Tissue Bank תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים המושרשים על ידי אדם (iPSC)

  1. מכשירי iPSC של פרוגריה מידע רקע למי שאינו מדען 
  2. מטרתו של יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים הובאו על ידי הקרן לחקר פרוג'ריה  
  3. דור תאי גס של תסמונת פרוגריה של האצ'ינסון-גילפורד שנגרמו-פלוריפוטנטים (iPSCs) 
  4. בקרת איכות: אימות ואפיון 
  5. חומר התחלתי מקורי ממנו נגזרו מכשירי ה- iPSC
  6. הצטרף לרשימת הדוא"ל שלנו לעדכוני iPSC עתידיים וקווי תאים חדשים  
  7. שאלות? צור קשר.
  8. הזמנת קווי iPSC 
  9. הכנת HGPS ושליטה על iPSC תרבות הכנה 
  10. הכנת צלחות מטריגל 
  11. הפשרת תאי hESCs ו-iPSCs (לכל בקבוקון קריו)
  12. קציר ודאגה ל- hESC / iPSC 
  13. מעבר hESC/iPSC 
  14. הקפאת hESC/iPSC

1. מידע רקע על iPSC עבור הלא-מדען

תאי גזע הם תאים "לא בשלים" שטרם התחייבו להפוך לסוג תאים אחד. הם גמישים מכיוון שיש להם פוטנציאל להתפתח לסוגים רבים ושונים של תאים בוגרים בגוף, כמו תאים המרכיבים את הלב או את כלי הדם, ורקמות ואיברים אחרים. בשנת 2007 גילו החוקרים אסטרטגיה ליצירת תאי גזע במעבדה על ידי תכנות מחדש של תאים בוגרים בוגרים שאנו בדרך כלל מגדלים למטרות מחקר.1, 2 . תאי גזע אלה שנוצרו באופן מלאכותי נקראים תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה ("iPSCs"). עבור תחום פרוג'ריה זו פריצת דרך עצומה. לראשונה, מדענים יכולים כעת ליצור תאי גזע של פרוג'ריה ולשאול שאלות כיצד תאי גזע מתפקדים ומתפתחים בפרוג'ריה. בעבר לא היה מקור לתאי גזע פרוג'ריים אנושיים, ולכן היה חלל מידע אודות התפקוד של תאי גזע פרוג'ריה בהשוואה לתאי גזע מאנשים ללא פרוג'ריה. בנוסף, מדענים יכולים לתכנת מחדש את תאי הגזע של פרוג'ריה כדי ליצור לראשונה כלי דם בוגרים של פרוג'ריה, תאי לב וסוגי תאים אחרים. עד כה, לא היה מקור ללב פרוגריה אנושי או לתאי כלי דם.  כעת אנו יכולים לשאול מפתח שאלות על מחלת לב שמובילה למוות מוקדם בפרוג'ריה מהתקפי לב ושבץ מוחי. אנו יכולים להשוות תגליות אלו עם מחלות לב והזדקנות בקרב האוכלוסייה הכללית ולגלות עוד על מה שמשפיע על ההזדקנות בכולנו. כבר פורסמו כמה מחקרים מצוינים באמצעות תאי גזע פרוג'ריה.3-5  מטרתנו בקרן המחקר פרוג'ריה היא להקל על תגליות רבות נוספות באמצעות כלי רב ערך זה. לקבלת פריימר לתאי גזע, אנא עיין באתר הממשל האמריקני הזה: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. טקהאשי K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. אינדוקציה של תאי גזע פלוריפוטנטים מפיברובלסטים אנושיים בוגרים על ידי גורמים מוגדרים. תא. 2007; 131: 861-872.
    2. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים שהובאו מתאים סומטיים אנושיים. מדע. 2007; 318: 1917-1920.
    3. ליו GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3rd, Izpisua Belmonte JC. השבה מחדש של הזדקנות מוקדמת עם iPSCs מתסמונת הפרוגריה הפרושיה של האצ'ינסון-גילפורד. טבע. 2011; 472: 221-225.
    4. מכשירי iPSC שמקורם ב- Misteli T. HGPS לגילאים. תא גזע תא. 2011; 8: 4-6.

2. מטרת ייצור והפצה של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) על ידי קרן המחקר פרוג'ריה

המשימה של הקרן לחקר פרוג'ריה היא לגלות טיפולים והתרופה לתסמונת הפרוג'ריה של האצ'ינסון-גילפורד והפרעות הקשורות בהזדקנות. ב- 2009, PRF התקשרה בשיתוף פעולה עם צוות מומחים של מדענים מאוניברסיטת טורונטו, קנדה, בניהולו של ויליאם סטנפורד, PhD, לייצר מכשירי iPSC של פרוגריה באיכות גבוהה. ד"ר סטנפורד הוא יו"ר המחקר בקנדה בביולוגיה אינטגרטיבית של תאי גזע. החל מ- 2011, PRF ממשיך לשתף פעולה עם ד"ר סטנפורד באוניברסיטת אוטווה, קנדה, שם הוא פרופסור לרפואה סלולרית ומולקולרית, הפקולטה לרפואה, ומדען בכיר במרכז ספוט למחקר גזע של מכון המחקר בבית החולים אוטווה.

מטרתנו היא לספק כלי חשוב זה לא יסולא בפז לחוקרים ברחבי העולם. כלי מחקר חדש זה ישמש להפקת מחקר חדש וחדשני בפרוג'ריה, כמו גם ביחסו למחלות לב והזדקנות.  

3. דור תאי גס של תסמונת פרוגריה של האצ'ינסון-גילפורד שנגרמו-פלוריפוטנטים (iPSCs)

תאי גזע המושרה-פלוריפוטנטית (iPSCs) נגזרו באמצעות התמרה רטרו-ויראלית מדומה VSVG של ארבעה גורמים אנושיים, Oct4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc לפיברובלסטים. מושבות iPSC נגזרו על פיברובלסטים עכברים-עובריים (MEF). הנוהל ששימש היה למעשה כמתואר לעיל אך ללא שימוש בכתב ה- EOS (פרוטוקולי טבע 4: 1828-1844, 2009). 

4. בקרת איכות: אימות ואפיון

הקווים הזמינים כרגע עברו מספר שלבי אימות (ראה קובצי PDF להורדה בהמשך):

 

    1. בדיקת מיקופלזמה לכל שורה: המעבדה של ד"ר סטנפורד ביצעה ניתוח מיקופלזמה על ידי PCR עבור כל קו תאים. בנוסף, לאחר הרחבה ולפני תאי משלוח, הקווים ייבדקו מחדש למיקופלזמה.
    2. חיסון ללא חיסון עבור סמני פלוריפוטנציות Tra-1-60, Tra-1-81 ו- SSEA4.
    3. מכתים אלקליין פוספטאז כאינדיקטור לפלוריפוטנציה
    4. היווצרות גוף עוברי ובריחת חיסון לאחר מכן לסמנים של שלוש שכבות הנבט. סמנים שנבדקו היו ßIII-Tubulin (Ectoderm), Actin-Muscle Smooth (Mesoderm) ו- Gata4 או AFP (Endoderm)
    5. ניתוח קריוטיפ.
    6. ביטוי מחדש של למינציה A בתאים מובחנים
    7. מבחני טרטומה

אימות נוסף בתהליך:
כמה שורות סיימו בדיקות טרטומה כפי שמוצג בנתונים תומכים. עבור כל הקווים האחרים, מבחני טרטומה נמצאים בתהליך והסטטוס שלהם יעודכן עם השלמת מבחנים אלה.

5. חומר התחלה מקורי ממנו נגזרו תאי iPS אלה

iPSCs נגזרו מקווי תאים של פיברובלסטים שלא עברו שינוי של PRF Cell & Tissue Bank.

שיטת ההולכה ששימשה לכל קווי ה- iPS הייתה Retrovirus MKOS.

מזהה קו iPSCמוטציהמגדר ותרומותסוג תא מקור לחץ כאן.נתונים תומכים
HGADFN003 iPS 1B LMNAExon 11,
1824 C> T		זכר 2yr 0mo פיברובלסטים דרמטיים
HGADFN003		003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C LMNA Exon 11,
1824 C> T		זכר 2yr 0mo פיברובלסטים דרמטיים
HGADFN003		003 iPS1C
HGDFN003
iPS 1D		LMNA Exon 11,
1824 C> T		זכר 2yr 0mo פיברובלסטים דרמטיים
HGADFN003		003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J LMNA Exon 11, 1824 C> Tזכר 8yr 5moפיברובלסטים דרמטיים HGADFN167167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q LMNA Exon 11, 1824 C> Tזכר 8yr 5moפיברובלסטים דרמטיים HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B אם ל- HGADFN167 (לא הושפעה)נקבה 37yr 10moפיברובלסטים דרמטיים
HGMDFN090		090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C אם ל- HGADFN167 (לא הושפעה)נקבה 37yr 10moפיברובלסטים דרמטיים
HGMDFN090		090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2אבי HGADFN167 (לא הושפע)זכר 40yr
5mo		פיברובלסטים דרמטיים HGFDFN168168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1Pאבי HGADFN167 (לא הושפע)זכר 40yr
5mo		פיברובלסטים דרמטיים
HGFDFN168		168 iPS1P

קווי תא PRF זמינים

6. הצטרף לרשימת הדוא"ל שלנו לקבלת עדכונים עתידיים של iPSC וקווי תאים חדשים

אנו ממשיכים לייצר קווי iPSC. אם ברצונך לעדכן תקופתיים על מכשירי iPSC המתקיימים בבנק PRF Cell & Tissue Bank, אנא הצטרף לרשימת הדוא"ל שלנו על ידי לחיצה כאן

7. שאלות?

אנא צרו קשר עם לסלי גורדון, דוקטורנט, דוקטורט, מנהל רפואי, בכל שאלה או צורך, בכתובת lgordon@progeriaresearch.org או 978-535-2594

8. הזמנת שורות תאים של iPS

ב- 2014, PRF הנהיגה מדיניות ללא שינויים ב- MTA שלנו. זו תוצאה של 12 שנים של הסדרים חוזיים עם צוותי מחקר 70 העובדים במוסדות במדינות 14. PRF ובא כוחה לקחו בחשבון את הנושאים שעלו באותה תקופה וערכו את ההסכם בהתאם, וכתוצאה מכך, לדעתנו, תנאים הוגנים וסבירים.

לקבלת מוסדות ממשלתיים פדרליים או שאלות, אנא צרו קשר עם וונדי נוריס בכתובת: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

שלב 1: השלם הסכם העברת יישומים וחומר

בקשה והסכם למוסדות לא ממשלתיים

הסכם העברה מהותי עבור מוסדות לא ממשלתיים

שלב 2: החזר את הבקשה המלאה ואת הסכם העברת החומר לוונדי נוריס בכתובת wnorris@lifespan.org. לאחר האישור, תקבל דוא"ל המאשר את הזמנתך ותאריך המשלוח הצפוי. 

שלב 3: המעבדה של ד"ר סטנפורד מפיצה כיום קווים בקפואים קפואים. המעבדה שלו תשלח אליך דוא"ל עם משלוח התרבות, עם מידע על משלוח ומעקב. חוקרים חסרי ניסיון מופנים לקבל הכשרה בקורסים מיוחדים החיוניים לעבודת תאי גזע עובריים אנושיים / iPSCs.

מתקן תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים (בהנהלת ד"ר סטנפורד) במכון המחקר של בית החולים אוטווה מציע הכשרה וירטואלית אחד על אחד על יסודות של טכניקות תרבות iPSC הספציפיות לקווי התאים Progeria iPSC. אפשרויות ההדרכה והפורמט גמישים בהתאם לרמת הניסיון של המדענים.  למידע נוסף, אנא שלח דוא"ל לhpscf@ohri.ca.

שלב 4: אוניברסיטת אוטווה תעביר לך חשבונית ישירות עבור כל קו iPSC בתוספת עלויות שליח, אם בכלל.

9. הכנת HGPS ובקרת מדיה לתרבית תאים של iPS

יש להאכיל iPSC ו- ESC עם mTeSR Plus מטכנולוגיות תא גזע (חתול# 5825). אנא עקוב אחר המלצות הספק לאחסון.

10. הכנת צלחות מטריגל

הערות: יש לבצע את כל הצעדים הכרוכים במריץ במהירות האפשרית ולהישאר קר ככל האפשר.

  1. להפשיר בקבוק מטריגל ב-4°ג. בדוק את תעודת הניתוח על אותו מגרש כדי למצוא את ריכוז החלבון שלו.
  2. הוסף מספיק מדיית DMEM/F12 קרה למטריג'ל המופשר כדי להגיע לריכוז סופי של 5mg/mL.
  3. הכינו מנות של 1 מ"ל של המטריגל המוכן משלב 2 בצינורות בז 15 מ"ל מצוננים מראש.
  4. הקפיאו ואחסנו את כל המנות ב-20-°C.
  5. להכנת צלחות מטריגל, הסר מנה אחת של מטריגל (1 מ"ל) מ-20°C והוסיפו 10 מ"ל של DMEM/F12 קר. מערבבים היטב עד שהגלולה מפשירה (מבלי ליצור בועות, ותמיד שומרים על התמיסה קרה).
  6. העבירו לצינור של 50 מ"ל, ולאחר מכן הוסיפו 20 מ"ל של DMEM/F12 קר (1 מ"ל של מנת מטריגל מדולל ב-30 מ"ל של DMEM/F12), מערבבים היטב.
  7. צלחת (1 מ"ל/באר עבור צלחת 6 באר, 0.5 מ"ל/באר עבור צלחת 12 באר, 0.25 מ"ל/באר עבור צלחת 24 באר). ודא שהתמיסה מכסה את כל שטח הפנים על ידי ניעור הצלחת בעדינות. אין להקפיא מחדש את שאריות המטריגל.
  8. אם משתמשים בצלחת מיד, הניחו לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת (או 1 דקות ב-30°ג), התבונן במטריג'ל מתחת למיקרוסקופ. מטריג'ל צריך להיות מפוזר היטב ולא "גושי".
  9. אם משתמשים בצלחות במועד אחר, עטפו את קצה הצלחת בפרפילם ואחסנו ב-4°C עד שבועיים.

Matrigel - BD / פישר, חתול # CB-40230

DMEM / F12 - טכנולוגיות לייף, חתול # 11330-057

ד"ר ויליאם סטנפורד - 2022

11. הפשרת תאי ES או iPS (לכל בקבוקון בקבוקון)

  1. קחו צלחת מטריגל מ-4 מעלות צלזיוס וחממו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, או הכינו צלחת מטריגל טרייה (ראה פרוטוקול הכנת צלחת מטריגל).
  2. מחממים 4 מ"ל של mTeSR Plus בשפופרת פלקון של 15 מ"ל.
  3. הסר תאים ממיכל החנקן הנוזלי וסובב באמבט 37 מעלות צלזיוס עד שנותר רק גוש קרח קטן. הבקבוקון אמור להפשיר תוך 1-2 דקות. שלב זה חייב להיעשות במהירות.
  4. צינור תאי אתנול וצינור המדיה בז, והניח במכסה המנוע.
  5. השתמש ב-1 מ"ל קצה פה רחב עד לאט הוסף תאים ל-4 מ"ל של מדיה שחוממת מראש (הימנע מערבוב תרחיף תאים).
  6. סובב ב-130 rcf למשך 5 דקות.
  7. הסר את הסופרנטנט.
  8. הוסף 2 מ"ל של מדיה PSC, ועם קצה פה רחב לפרק גושים בעדינות. העברת מדיה לבאר אחת של צלחת 6 היטב להוסיף 2uL של מעכב ROCK (Y27632, ריכוז סופי של 10uM). צלחת לתוך מטריגל אחד מצופה היטב (של צלחת 6 באר).
  9. סלעים את התאים בעדינות לפיזור שווה של התאים, ומניחים באינקובטור היפוקסי (5% O2, 10% CO2). הימנע מהפרעה בצלחת במשך 24 שעות לאחר הזרעה.

    הערה: חשוב מאוד להימנע מפירוק מוגזם של גושים או פיפטציה אגרסיבית. זה יכול להפחית משמעותית את שיעור ההישרדות. התאים צריכים להישאר בנתחים של 100-300 תאים גדולים בזמן הזריעה. בעודך עדין, נסה לעבוד במהירות לאחר שהתאים מופשרים כדי למזער את הזמן שהם במגע עם חומר מגן קריו.

  10. הסר את המדיה לאחר 24 שעות והוסף 2 מ"ל של מדיה PSC (עבור 6 באר, 1 מ"ל עבור 12 באר ו-0.5 מ"ל עבור צלחת 24 באר). ראה קציר וטיפול בפרוטוקול hESC/iPSC.

    מדיה PSC

    mTeSR Plus מטכנולוגיות תא גזע (חתול# 5825). אנא עקוב אחר המלצות הספק לאחסון.

    מהו ROCK Inhibitor Y27632?

    ROCK Inhibitor Y27632 הוא מעכב סלקטיבי של הקינאז p160 ROCK הקשור ל-Rho. טיפול עם ROCK Inhibitor Y27632 מונע אפופטוזיס המושרה על ידי דיסוציאציה של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC), מגביר את שיעור ההישרדות ושמירה על פלוריפוטנטיות במהלך תת-טיפוח והפשרה של hESCs ו-hiPSCs. מעכב ROCK Y27632 גם הוכח כמשפר את שיעור ההישרדות של תאי גזע במהלך שימור הקפאה. שימו לב כי מנות מעכבי סלע רגישות לאור ולמחזורי הפשרה חוזרים של הקפאה. הקפד להשתמש במנות אלה בתוך חיי המדף המומלצים של הספק.

    ד"ר ויליאם סטנפורד - 2022

    12. קציר וטיפול ב-hESC/iPSC

    1. יום אחרי שהתאים הופשרו, תסתכל עליהם מתחת למיקרוסקופ כדי לקבוע את שיעור ההישרדות. הערה: זה נורמלי לראות מספר גבוה של תאים לא מחוברים. כל עוד כמה תאים מחוברים, מושבות יכולות להיווצר מהם תוך 3 - 7 ימים.
    2. הסר מדיה מהבארות ופפטט 2 מ"ל (עבור 6 באר, 1 מ"ל עבור 12 באר ו-0.5 מ"ל עבור צלחת 24 בארות) של מדיה PSC טרייה וחמה לכל באר. החזר את הצלחת לאינקובטור.
    3. תאים מוזנים עד 60-70% מחוברים (עקוב אחר המלצות הספק).
    4. החל מיום 2, יש לצפות ולנקות תאים מכל תאים מובחנים שעשויים לגדול.
    5. כדי לנקות תאים, השתמש במנדף הקטיף וגרד תאים מובחנים בעזרת קצה פיפטה.
    6. לאחר ניקוי התאים, החלף מדיה כפי שנעשה בשלבים לעיל.

    (ראה הקפאת hESC/iPSC או העברת hESC/iPSC)

    הערה:

    מדיה PSC נקבעה כיעילה יותר בסביבה היפוקסית. ראינו גם שפחות התמיינות מתרחשת כאשר מגדלים תאים באינקובטורים היפוקסיים לעומת נורמוקסיים. לבסוף, לתאי זרע יש שיעור הישרדות טוב יותר בעת שימוש באינקובטור היפוקסי.

    נורמוקסית: 37°C, 21% O2, 5% CO2

    היפוקסי: 37°C, 5%O2, 10% CO2

    ד"ר ויליאם סטנפורד - 2022

    13. עובר את hESC/iPSC

    1. הוסף 2 מ"ל של מדיה PSC לצלחת מצופה מטריגל 6 היטב והניח בצד.
    2. קח את הצלחת למעבר והסר את המדיה מהבאר ושטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS (-/-).
    3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת EDTA לבאר והשאיר למשך 3-4 דקות בטמפרטורת החדר. אל תזיז את הצלחת מכיוון שתאים יכולים להתחיל להתנתק.
    4. הסר תמיסת EDTA והוסף 1 מ"ל של מדיה PSC. אל תשאיר את EDTA על התאים במשך יותר מ-4 דקות מכיוון שהדבר יגרום לתאים להתרומם.
    5. גרד תאים באמצעות מגרד תאים וחלק את התאים בין 6 בארות הצלחת שלך המכילה מדיה PSC. הימנע מפירוק מוגזם של חלקי המושבה, ונסו להיות עדינים עם גרידה. נסה לשמור על תאים בנתחים גדולים. השתמש בקצה פיפטה רחב כדי לשבור גושים במידת הצורך. פירוק מוגזם של תאים עלול לגרום למוות של תאים או להתמיינות ספונטנית מוגזמת בעקבות מעבר.
    6. דגירה בגיל 37°C לאחר פיזור שווה של תאים בכל באר (רועד בצורת 8 דמויות או L). הימנע מהפרעה בצלחת במשך 24 שעות לאחר המעבר.

    הערה: לאחר גירוד התאים אתה רוצה להעביר אותם לצלחת החדשה בהקדם האפשרי כי התאים יתחברו מחדש במהירות (תוך 5 דקות).

    אם EDTA נשאר על התאים במשך יותר מ-4 דקות, התאים יכולים להתחיל להתנתק. אם זה קורה, פשוט אסוף את התאים בבז 15 מ"ל עם 4 מ"ל של מדיה PSC. סובב תאים ב-130 rcf למשך 5 דקות. השהה מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של מדיה וחלק באופן שווה בין צלחת מצופה מטריגל 6 באר (160uL לבאר).

    פתרון EDTA: הוסף 500uL של 0.5M EDTA (pH 8.0) לתוך 500mL של DPBS (-/-). הוסף 0.9 גרם של NaCl. סנן את התמיסה לעיקור ואחסן אותה ב-4 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.

    מתוך העיתון:

    מעבר והתפשטות מושבה של תאי גזע אנושיים על ידי ניתוק ללא אנזים בתנאי תרבות מוגדרים כימית

    ז'נט בארס,1 דניאל ר. גולברנסון,2,3 ניקול ג'ורג ',4לורן סיניסקאלצ'י,1 ג'פרי ג'ונס,4,5 ג'יימס א. תומסון,2,3,6 ו גוקוקי חן1,2

    14. הקפאת hESC/iPSC

    1. הפעל את Bio-Cool (מקפיא קצב מבוקר) והתאם את הטמפרטורה ל-7°C.
    2. הסר תאים מהאינקובטור וצפה בריכוז ובמורפולוגיה מתחת למיקרוסקופ.
    3. אם בארות 70% מתכנסות, הסר חומר ישן ושטוף פעם אחת עם PBS (-/-) ואז הוסף 1 מ"ל של תמיסת EDTA (ראה מעבר עם תמיסת EDTA) לכל באר.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3-4 דקות.
    5. שאפו את תמיסת ה-EDTA והוסיפו 1 מ"ל של מדיית mFreSR קרה (חתול # 05855, Stem Cell Technologies).
    6. השתמש במגרד תאים כדי להרים את התאים בעדינות. שמור תאים בנתחים גדולים ככל האפשר והימנע מפיפטינג למעלה ולמטה.
    7. העברת תאים/mFreSR ל-criotube באמצעות קצה פה רחב. שמור את הבקבוקונים על קרח עד שאתה מוכן לשלב 8.
    8. מניחים צינורות ב-Bio-Cool ודגגרים במשך 10 דקות.
    9. קבל חנקן נוזלי.
    10. לאחר 10 דקות, זרעו את התאים על ידי טבילת מרית בחנקן נוזלי ונגיעה בצד בקבוקון ה-Cryo-Vial למשך כ-10-30 שניות או עד שתראה צורת גביש בצד ה-Cryo-Vial.
    11. התחל את תוכנית 1 על ידי לחיצה על כפתור "PROG" ומעבר על התוכנית על ידי לחיצה נוספת על הלחצן ואתה אמור לראות את הקצב של 0.5°C/min. , ולאחר מכן הקש "RUN".
    12. ברגע שהטמפרטורה מגיעה ל-65 מעלות צלזיוס ניתן להעביר את צינורות הקריו ולאחסן אותם בחנקן נוזלי.

    חלופות

    אפשרות נוספת היא להניח את ה-cryo-tubes במיכל הקפאה (Biocision-CoolCell) ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. העבר את צינורות הקריו לחנקן נוזלי (שלב נוזלי או אדים) ביום שלמחרת.

    ד"ר ויליאם סטנפורד - 2022

    הרשמה

    בשביל שלנו

    עלון!

    הירשם עכשיו

    אנחנו ביחד

    WILL

    מצא את התרופה!

    תרומות