解冻PRF细胞系

1. 在37˚C水浴中快速解冻细胞。
2. 用70％乙醇擦拭小瓶的外部。
3. 将解冻的细胞转移到含有25 ml生长培养基的T5烧瓶中。
4. 将烧瓶放在37˚C培养箱中过夜。
5. 第二天，在显微镜下观察以确保细胞已附着。
6. 取出培养基并换上新鲜的生长培养基。

传代PRF细胞系

1. 汇合时应分裂细胞。
2. 拆分单元格（给出的容量是假设单元格位于T25中）：
   a）使用无菌技术，除去培养基并用2-3 ml无菌HBSS冲洗烧瓶。 卸下并丢弃HBSS。
   b）加入1 ml胰蛋白酶并孵育2-3分钟。 应该在倒置显微镜下检查细胞，以确定它们是否已经开始聚集，举起和漂浮。 如果3分钟后细胞仍未分离，则可以再孵育1-2分钟。
   c）拧紧瓶盖，并从一侧向另一侧轻轻倾斜烧瓶，以移出所有细胞。 如果需要，可以轻拍烧瓶的侧面以放松细胞。
   d）一旦细胞漂浮以使胰蛋白酶失活，立即向烧瓶中加入4 ml新培养基。 用新培养基冲洗烧瓶的底部几次，以洗去所有塑料上的细胞，然后浸入溶液中。 取出所有含有细胞的液体，并转移到15ml锥形瓶中（如果合并50个或更多烧瓶，则转移到3ml）。
   e）使用无菌技术，取出等分试样以在血细胞计数器上计数。
   f）在计数细胞时，应将其余溶液在临床离心机中以5 rpm旋转1000分钟。
3. 计算完细胞数后，将细胞按2.5 x 10⁵ 每个T25过滤器顶部烧瓶的细胞数。
4. 应每隔2-3天用新鲜的生长培养基喂养细胞。

冷冻：

单元格的冻结数量不得少于5 x 10⁵ 在含有10％DMSO和30％FBS的生长培养基中，每毫升细胞/毫升/每毫升，然后将其置于-80°C的异丙醇冷冻室中过夜。 第二天转移到液氮中。

继代培养和冷冻成纤维细胞的协议