永生细胞
文化协议
永生细胞培养方案
我们感谢哈佛大学的Martin Dorf博士慷慨地为PRF细胞和组织库提供了永生的细胞系并将其提供给他们。 谢谢。
使用以下方案将PRF细胞系永生化：
逆转录病毒感染
A.产生病毒： 转染前12-24小时，将包装的HEK293细胞以100-60％融合度铺在80毫米平板上。 将每个板用12μg逆转录病毒构建体pBABE-puro（SV40T）和12μgpCL-Ampho逆转录病毒包装载体共转染。 转染后8-10小时吸出培养基，并用10ml完全培养基代替。 将培养物再温育48-72小时以获得最佳病毒滴度。
B.感染靶细胞： 在感染前100-12小时将靶细胞铺在18mm平板上。 收集包装细胞的培养基，并通过0.45-μm的醋酸纤维素或聚磺酸滤器过滤。 一旦细胞汇合至40-60％，则添加8 ml含病毒的培养基，最终浓度为10μg/ ml聚乙烯。 依次进行三轮感染，间隔约12小时。 温育24小时后更换培养基。
C.稳定细胞系的选择： 感染后72小时，对细胞进行胰蛋白酶处理，以1：3的比例分裂，并在存在100μg/ ml嘌呤霉素的情况下转移到两个3 mm平板中，再加上一个不含抗生素的对照平板。 每2或3天更换培养基约2至4周，以产生稳定的细胞系。
成长媒体
DMEM- Invitrogen＃11960-044（不含L-谷氨酰胺的高葡萄糖）
15％FBS胎牛血清
1％（1x）青霉素-链霉素（Invitrogen＃15140-122）
1％（1X）L-谷氨酰胺（Invitrogen＃25030-081）
0.75μg/ ml嘌呤霉素（InvivoGen＃ant-pr-1）
胰蛋白酶
胰蛋白酶EDTA C .25％（Invitrogen＃25200-056）
汉克的平衡盐溶液
HBSS-（Invitrogen＃14170（1X）（-）氯化钙，（-）氯化镁，（-）硫酸镁）
DMSO冷冻
细胞培养级DMSO
细胞将以大约5 x 10的浓度在干冰上冷冻到达5细胞/小瓶
解冻成纤维细胞的协议
- 在37°C水浴中快速解冻细胞。
- 用70％乙醇擦拭小瓶的外部。
- 将解冻的细胞转移至含有25 ml无嘌呤霉素的生长培养基的T5烧瓶中。
- 将烧瓶放在37°C培养箱中过夜。
- 第二天，在显微镜下观察以确保细胞已附着。
- 取出培养基并换上新鲜的生长培养基。
传代PRF细胞系
1）细胞建立并生长后，开始使用含有0.75μg/ ml嘌呤霉素的培养基。 继续将细胞维持在含有0.75μg/ ml嘌呤霉素的培养基中。
2）汇合时应拆分单元格。
3）拆分单元格（给出的容量是假设单元格位于T25中）：
A.使用无菌技术，除去培养基，并用2-3 ml无菌HBSS冲洗烧瓶。 卸下并丢弃HBSS。
B.加入1 ml胰蛋白酶并孵育2-3分钟。 应该在倒置显微镜下检查细胞，以确定它们是否已经开始聚集，举起和漂浮。 如果在3分钟后仍未分离细胞，则可以再孵育1-2分钟
C.拧紧瓶盖，并从一侧向另一侧轻轻倾斜烧瓶，以移出所有细胞。 如果需要，可轻拍烧瓶侧面以放松细胞。
D.细胞浮起以使胰蛋白酶失活后，立即向烧瓶中添加4 ml新培养基。 用新培养基冲洗烧瓶的底部几次，以洗去所有塑料上的细胞，然后浸入溶液中。 取出所有含有液体的细胞，然后转移到15ml锥形瓶（如果您合并50或更多烧瓶，则转移到3 ml）。
E.使用无菌技术，取出一份用于在血细胞计数器上计数的等分试样。
F.在计数细胞时，应将其余溶液在临床离心机中以5 rpm的速度离心1000分钟。
4）计算完细胞数后，以2.5 x 10接种细胞5 每个T 25滤顶烧瓶的细胞数。
5）应每隔2-3天用含有0.75μg/ ml嘌呤霉素的新鲜生长培养基喂养细胞。
冷冻：
单元格的冻结频率不得少于5x 105 细胞/ ml /冷冻 在成长型媒体中 包含10％DMSO和30％FBS 没有嘌呤霉素 然后将其置于-80°C的异丙醇冷冻室中过夜。 第二天转移到液氮中。
有关更多信息，请联系：
莱斯利·戈登（Leslie B.Gordon），医学博士
布朗大学沃伦·阿尔珀特医学院小儿科教授和哈斯布罗儿童医院儿科，普罗维登斯，RI麻醉科，波士顿儿童医院和哈佛医学院，马萨诸塞州波士顿，Progeria研究基金会医学总监
电话：978-535-2594
传真: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
温迪·诺里斯（Wendy Norris）
电话：401-274-1122 48063点¯x
wnorris@lifespan.org
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