1。 iPSC非科学家的背景信息

干细胞是尚未致力于成为任何一种细胞类型的“未成熟”细胞。 它们之所以柔韧，是因为它们有可能在体内发育成许多不同类型的成熟细胞，例如组成心脏或血管的细胞以及其他组织和器官。 2007年，研究人员在实验室中发现了一种通过重编程我们通常出于研究目的而生长的成熟成年细胞来创建干细胞的策略。^1，2 。 这些人工创建的干细胞被称为诱导多能干细胞（“ iPSC”）。 对于早衰领域，这是一个巨大的突破。 现在，科学家们首次可以制造早衰干细胞，并提出有关早衰干细胞如何发挥功能和发育的问题。 以前没有人类早衰干细胞的来源，因此与没有早衰症的人的干细胞相比，早衰干细胞的功能尚无任何信息。 此外，科学家可以对Progeria干细胞进行重新编程，以首次创建成熟的Progeria血管，心脏细胞和其他细胞类型。 到目前为止，还没有人类早衰的心脏或血管细胞来源。  我们现在可以询问钥匙 有关导致心脏病和中风的早衰导致心脏病死亡的心脏病的问题。 我们可以将这些发现与普通人群的心脏病和衰老进行比较，并发现更多有关影响我们所有人衰老的信息。 已经有一些使用早衰干细胞的出色研究。^3-5  我们在Progeria Research Foundation的目标是使用这种宝贵的工具促进更多的发现。 有关干细胞的引物，请访问以下美国政府网站： https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Progeria研究基金会诱导多能干细胞（iPSC）产生和分布的目的

早衰研究基金会的任务是发现哈钦森-吉尔福德早衰综合症及其与衰老相关的疾病的治疗方法和治愈方法。 在2009中，PRF与加拿大多伦多大学的科学家专家团队在William Stanford博士的指导下进行了合作，以生成高质量的早衰iPSC。 Stanford博士是加拿大综合干细胞生物学研究主席。 从2011开始，PRF继续与加拿大渥太华大学的Stanford博士合作，在那里他是细胞和分子医学教授，医学院，渥太华医院研究所Sprott干细胞研究中心的高级科学家。

我们的目标是为全世界的研究人员提供这种宝贵的工具。 这种新的研究工具将用于在早衰症中产生新的创新研究，以及它与心脏病和衰老的关系。  

3。 Hutchinson-Gilford早衰综合症诱导的多能干细胞（iPSC）的产生

诱导多能干细胞（iPSC）是使用VSVG拟真型逆转录病毒转导的四个人类因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc转化为成纤维细胞而衍生的。 iPSC集落源自小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。 所使用的程序基本上如前所述，但未使用EOS报告程序（Nature Protocols 4：1828-1844，2009）。 

4。 质量控制：验证和表征

当前可用的行已经过几个验证步骤（请参见下面的可下载PDF）：

5.源自这些iPS细胞的原始原材料

iPSC源自PRF细胞和组织库非转化成纤维细胞系。

用于所有iPS品系的转导方法是逆转录病毒MKOS。

iPSC线路ID	突变	性别与捐赠年龄	原始细胞类型 点击这里.	支持数据
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11， 1824 C> T	男X​​NUMXyr 2mo	皮肤成纤维细胞 HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11， 1824 C> T	男X​​NUMXyr 2mo	皮肤成纤维细胞 HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11， 1824 C> T	男X​​NUMXyr 2mo	皮肤成纤维细胞 HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA外显子11，1824 C> T	男X​​NUMXyr 8mo	皮肤成纤维细胞HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA外显子11，1824 C> T	男X​​NUMXyr 8mo	皮肤成纤维细胞HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	HGADFN167的母亲（不受影响）	女37yr 10mo	皮肤成纤维细胞 HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	HGADFN167的母亲（不受影响）	女37yr 10mo	皮肤成纤维细胞 HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	HGADFN167的父亲（不受影响）	男X​​NUMXyr 5mo	皮肤成纤维细胞HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	HGADFN167的父亲（不受影响）	男X​​NUMXyr 5mo	皮肤成纤维细胞 HGFDFN168	168 iPS1P

6。 加入我们的电子邮件列表，以获取将来的iPSC更新和新的细胞系

我们正在继续生成iPSC线。 如果您想定期更新PRF细胞和组织库中保存的iPSC，请点击以下链接加入我们的电子邮件列表 点击此处

7.有问题吗？

如有任何疑问或需求，请联系医学总监莱斯利·戈登（Leslie Gordon），医学博士 lgordon@progeriaresearch.org 或978-535-2594

8.订购iPS细胞系

在2014中，PRF制定了不更改MTA的政策。 这是12与70国家机构中的14研究团队签订了多年合同协议的结果。 PRF及其律师已考虑到该时期出现的问题，并据此对协议进行了编辑，从而得出了我们认为公平合理的条件。

有关美国联邦政府机构或有任何疑问，请通过以下方式与Wendy Norris联系： wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

步骤1：完成申请和材料转让协议

民间机构申请书和协议书

非政府机构的材料转让协定

步骤2： 将填妥的申请表和材料转让协议返回给 Wendy Norris，地址为 wnorris@lifespan.org。 一旦获得批准，您将收到一封确认订单和预计发货日期的电子邮件。 

步骤3： 斯坦福大学的实验室目前正在冷冻冷冻小管中分配细胞系。 当文化被运送后，他的实验室会通过电子邮件向您发送运送和跟踪信息。 缺乏经验的研究人员将被指导接受对人类胚胎干细胞/ iPSCs工作必不可少的专门课程的培训。

渥太华医院研究所的人类多能干细胞设施（由斯坦福博士指导）提供有关早衰 iPSC 细胞系特有的 iPSC 培养技术基础知识的虚拟一对一培训。 根据科学家的经验水平，培训选项和形式是灵活的。  欲了解更多信息，请发送电子邮件至 hpscf@ohri.ca.

步骤4：渥太华大学将直接为每条iPSC线开具发票给您，再加上快递费用（如果有）。

9. HGPS和控制iPS细胞培养基的制备

iPSC 和 ESC 需要使用来自 Stem Cell Technologies 的 mTeSR Plus（目录号 5825）。 请遵循供应商的存储建议。

10. 准备基质胶板

备注：涉及基质胶的所有步骤应尽快完成，并保持低温。

1. 4 点解冻基质胶瓶°C. 检查该批次的分析证书以查找其蛋白质浓度。
2. 将足够的冷 DMEM/F12 介质添加到解冻的基质胶中，以达到 5mg/mL 的最终浓度。
3. 在预冷的 1mL falcon 管中制作 2mL 等分试样，从步骤 15 中制备的基质胶。
4. 将所有等分试样冷冻并储存在 -20°C.
5. 要制作基质胶板，请从 -1 中取出一等份基质胶 (20mL)°C 并加入 10mL 冷的 DMEM/F12。 充分混合直至颗粒解冻（不产生气泡，并始终保持溶液冷却）。
6. 转移到 50mL 管中，然后加入 20mL 冷的 DMEM/F12（1mL 的 matrigel 等分试样在 30mL DMEM/F12 中稀释），充分混合。
7. 板（1 孔板 6mL/孔，0.5 孔板 12mL/孔，0.25 孔板 24mL/孔）。 轻轻摇动板，确保溶液覆盖整个表面区域。 不要重新冷冻任何剩余的基质胶。
8. 如果立即使用盘子，让盘子在室温下放置 1 小时（或 30 下 37 分钟）°C)、显微镜下观察基质胶。 Matrigel 应该分散良好，而不是“结块”。
9. 如果在其他时间使用盘子，用封口膜包裹盘子的边缘并储存在 4°C 长达 2 周。

基质胶– BD /鱼，猫＃CB-40230

DMEM / F12 – Life Technologies，产品目录号＃11330-057

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11. 解冻ES或iPS细胞（每个冷冻瓶）

1. 将基质胶板从 4°C 中取出并在室温下加热一小时，或制作一个新的基质胶板（参见制备基质胶板协议）。
2. 在 4mL falcon 管中加热 15mL mTeSR Plus。
3. 从液氮罐中取出细胞并在 37°C 浴中旋转，直到只剩下一小块冰块。 小瓶应在 1-2 分钟内解冻。 这一步必须快速完成。
4. 乙醇细胞管和猎鹰培养基管放在引擎盖上。
5. 使用 1mL 广口尖慢慢地 将细胞添加到 4mL 预热的培养基中（避免混合细胞悬浮液）。
6. 以 130 rcf 旋转 5 分钟。
7. 去除上清液。
8. 加入 2mL PSC 培养基，并用宽口吸头 轻轻地打散团块. 将培养基转移到 6 孔板的一个孔中，加入 2uL ROCK 抑制剂（Y27632，最终浓度为 10uM）。 板入一个基质胶涂层孔（6 孔板）。
9. 轻轻摇动细胞，使细胞分布均匀，置于低氧培养箱（5%O₂，10％CO₂）。 播种后 24 小时内避免平板干扰。

   注意: 避免过度分解团块或强力移液非常重要。 这可以显着降低存活率。 在播种时，细胞应保持在 100-300 个细胞大块中。 在温和的同时，在细胞解冻后尝试快速工作，以尽量减少它们与冷冻保护剂接触的时间。​

10. 24 小时后取出培养基，加入 2mL PSC 培养基（6 孔，1 孔 12mL，0.5 孔板 24mL）。 请参阅 hESC/iPSC 协议的收获和护理。

PSC媒体

来自 Stem Cell Technologies 的 mTeSR Plus（货号 5825）。 请遵循供应商的存储建议。

什么是ROCK抑制剂Y27632？

ROCK Inhibitor Y27632 是 Rho 相关激酶 p160 ROCK 的选择性抑制剂。 ROCK Inhibitor Y27632 处理可防止人胚胎干细胞 (hESC) 和人诱导多能干细胞 (iPSC) 的解离诱导的细胞凋亡，从而在 hESC 和 hiPSC 的传代和解冻过程中提高存活率并保持多能性。 ROCK Inhibitor Y27632 还被证明可以提高干细胞在冷冻保存期间的存活率。 请注意，岩石抑制剂等分试样对光和重复冻融循环很敏感。 确保在供应商建议的保质期内使用这些等分试样。

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12. hESC/iPSC 的收获和护理

1. 细胞解冻后的第二天，在显微镜下观察它们以确定存活率。 注意：观察到大量未连接的单元格是正常的。 只要有一些细胞附着，菌落就可以在 3-7 天内从它们中产生。
2. 从孔中取出培养基，每孔吸管 2 mL（6 孔，1 孔 12mL，0.5 孔板 24mL）新鲜和温暖的 PSC 培养基。 将板返回培养箱。
3. 细胞被喂食直到 60-70% 汇合（遵循供应商的建议）。
4. 从第 2 天起，应观察细胞并清除可能正在生长的任何分化细胞。
5. 要清洁细胞，请使用采摘罩并用移液器吸头刮掉分化的细胞。
6. 清洁细胞后，按照上述步骤更换培养基。

（见冷冻 hESC/iPSC 或通过 hESC/iPSC）

注意:

PSC 培养基被确定为在缺氧环境中更有效。 我们还观察到，当细胞在缺氧培养箱中与常氧培养箱相比时，分化较少。 最后，使用缺氧培养箱时，种子细胞的存活率更高。

常氧： 37°C, 21% 氧气₂，5％CO₂

缺氧：37°C、5%O₂，10％CO₂

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13. 通过 hESC/iPSC

1. 将 2mL 的 PSC 介质添加到 6 孔基质胶涂层板中并放在一边。
2. 将要传代的盘子从井中取出，用 1mL 的 PBS(-/-) 清洗一次。
3. 向孔中加入 1mL EDTA 溶液，在室温下放置 3-4 分钟。 不要移动板，因为细胞会开始分离。
4. 去除 EDTA 溶液并加入 1mL PSC 培养基。 不要将 EDTA 留在细胞上超过 4 分钟，因为这会导致细胞脱落。
5. 使用细胞刮刀刮除细胞，然后在含有 PSC 培养基的板的 6 个孔中划分细胞。 避免过度分解菌落碎片，并尽量轻柔地刮擦。 尝试将细胞保持在大块中。 如果需要，使用广口移液器吸头打碎团块。 细胞过度分解可能导致细胞死亡或传代后过度自发分化。
6. 37岁孵化°C 将细胞均匀分布在每个孔中后（8 字形或 L 形摇动）。 传代后 24 小时内避免板干扰。

注意：一旦细胞被刮掉，您希望尽快将它们转移到新板中，因为细胞会很快重新附着（在 5 分钟内）。

如果 EDTA 留在细胞上超过 4 分钟，细胞就会开始分离。 如果发生这种情况，只需将细胞收集在 15mL 猎鹰和 4mL PSC 培养基中。 以 130 rcf 旋转细胞 5 分钟。 用 1mL 培养基重悬沉淀，并在 6 孔基质胶涂层板（每孔 160uL）中均匀分配。

EDTA 溶液：将 500uL 的 0.5M EDTA (pH 8.0) 添加到 500mL 的 DPBS (-/-) 中。 加入 0.9 克氯化钠。 过滤溶液进行消毒，并在 4°C 下储存长达 6 个月。

从论文：

在化学定义的培养条件下通过无酶解离对人多能干细胞的传代和集落扩增

珍妮特·比尔斯（Jeanette Beers）,¹ 丹尼尔·古布兰森,^2,3 妮可·乔治（Nicole George）,⁴劳伦·西尼斯卡奇,¹ 杰弗里·琼斯,^4,5 詹姆斯·汤姆森,^2,3,6 和 陈国凯^1,2

14. 冷冻 hESC/iPSC

1. 打开 Bio-Cool（可控速率冷冻机）并将温度调节至 -7°C。
2. 从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察汇合和形态。
3. 如果水井 70% 汇合，则取出旧介质并用 PBS(-/-) 洗涤一次，然后每孔加入 1 mL EDTA 溶液（参见使用 EDTA 溶液通过）。
4. 在室温下孵育3-4分钟。
5. 吸出 EDTA 溶液并加入 1 mL 的冷 mFreSR 培养基（cat#05855，干细胞技术）。
6. 使用细胞刮刀轻轻提起细胞。 尽可能将细胞保持在大块中，并避免上下移液。
7. 使用宽口尖端将细胞/mFreSR 转移到冷冻管中。 将小瓶放在冰上，直到准备好进行第 8 步。
8. 将试管置于 Bio-Cool 中并孵育 10 分钟。
9. 获取液氮。
10. 10 分钟后，将抹刀浸入液氮中并接触冷冻小瓶的侧面约 10-30 秒或直到您在冷冻小瓶的侧面看到晶体形式，从而为细胞播种。
11. 按下“PROG”按钮启动程序 1，再次按下按钮完成程序，您应该会看到 0.5°C/min 的速率。 ，然后按“运行”。
12. 一旦温度达到 -65°C，就可以将冷冻管转移并储存在液氮中。

备择方案

另一种选择是将冷冻管放入冷冻容器 (Biocision-CoolCell) 并在 -80°C 下储存过夜。 第二天将冷冻管移至液氮（液相或气相）。

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