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Pluripotente inducido

Células madre

 

1. iPSC Información de fondo para los no científicos

Las células madre son células “inmaduras” que aún no se han comprometido a convertirse en ningún tipo de célula. Son flexibles porque tienen el potencial de convertirse en muchos tipos diferentes de células maduras en el cuerpo, como las células que forman el corazón o los vasos sanguíneos y otros tejidos y órganos. En 2007, los investigadores descubrieron una estrategia para crear células madre en el laboratorio mediante la reprogramación de células adultas maduras que normalmente cultivamos con fines de investigación.1, 2 Estas células madre creadas artificialmente se denominan células madre pluripotentes inducidas (“iPSC”). Para el campo de la progeria, esto es un gran avance. Por primera vez, los científicos pueden crear células madre de progeria y hacer preguntas sobre cómo funcionan y se desarrollan las células madre en la progeria. Anteriormente no había ninguna fuente de células madre humanas de progeria y, por lo tanto, había un vacío de información sobre cómo funcionan las células madre de progeria en comparación con las células madre de personas sin progeria. Además, los científicos pueden reprogramar las células madre de progeria para crear, por primera vez, vasos sanguíneos maduros, células cardíacas y otros tipos de células de progeria. Hasta ahora, no había ninguna fuente de células cardíacas o de vasos sanguíneos de progeria humana.  Ahora podemos hacer preguntas clave Preguntas sobre la enfermedad cardíaca que conduce a una muerte prematura en la progeria debido a ataques cardíacos y accidentes cerebrovasculares. Podemos comparar estos descubrimientos con la enfermedad cardíaca y el envejecimiento en la población general y descubrir más sobre lo que influye en el envejecimiento en todos nosotros. Ya se han publicado varios estudios excelentes utilizando células madre de progeria.3-5  Nuestro objetivo en la Fundación para la Investigación de la Progeria es facilitar muchos más descubrimientos utilizando esta herramienta invaluable. Para obtener información básica sobre las células madre, visite este sitio web del gobierno de los EE. UU.: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Inducción de células madre pluripotentes de fibroblastos humanos adultos por factores definidos. Celúla. 2007;131:861-872.
    2. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. Líneas de células madre pluripotentes inducidas derivadas de células somáticas humanas. Ciencia. 2007;318:1917-1920.
    3. Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3rd, Izpisua Belmonte JC. Recapitulación del envejecimiento prematuro con iPSC del síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford. Naturaleza. 2011;472:221-225.
    4. Misteli T. iPSC derivadas de HGPS para la historia. Célula madre celular. 2011;8:4-6.

2. Objetivo de la generación y distribución de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) por parte de la Fundación para la Investigación de la Progeria

La misión de la Fundación para la Investigación de la Progeria es descubrir tratamientos y la cura del síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford y sus trastornos relacionados con el envejecimiento. En 2009, la PRF inició una colaboración con un equipo de científicos expertos de la Universidad de Toronto, Canadá, bajo la dirección del Dr. William Stanford, para generar células madre inducidas por progeria de alta calidad. El Dr. Stanford es el titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en Biología Integrativa de Células Madre. A partir de 2011, la PRF sigue colaborando con el Dr. Stanford en la Universidad de Ottawa, Canadá, donde es profesor de Medicina Celular y Molecular, Facultad de Medicina, y científico sénior en el Centro Sprott para la Investigación de Células Madre del Instituto de Investigación del Hospital de Ottawa.

Nuestro objetivo es proporcionar esta valiosa herramienta a los investigadores de todo el mundo. Esta nueva herramienta de investigación se utilizará para generar investigaciones nuevas e innovadoras sobre la progeria, así como su relación con las enfermedades cardíacas y el envejecimiento.  

3. Generación de células madre pluripotentes inducidas por el síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (iPSC)

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se obtuvieron mediante la transducción retroviral pseudotipada por VSVG de cuatro factores humanos, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, en fibroblastos. Las colonias de iPSC se obtuvieron a partir de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). El procedimiento utilizado fue básicamente el descrito anteriormente, pero sin el uso del reportero EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Control de calidad: Validación y caracterización

Las líneas que están actualmente disponibles han pasado por varios pasos de validación (ver archivos PDF descargables a continuación):

 

    1. Pruebas de micoplasma para cada línea: el laboratorio del Dr. Stanford ha realizado análisis de micoplasma por PCR para cada línea celular. Además, después de la expansión y antes del envío de las células, las líneas se volverán a analizar para detectar micoplasma.
    2. Inmunotinción para los marcadores de pluripotencia Tra-1-60, Tra-1-81 y SSEA4.
    3. Tinción de fosfatasa alcalina como indicador de pluripotencia
    4. Formación del cuerpo embrionario y posterior inmunotinción para marcadores de las tres capas germinales. Los marcadores analizados fueron βIII-tubulina (ectodermo), actina de músculo liso (mesodermo) y Gata4 o AFP (endodermo).
    5. Análisis de cariotipo.
    6. Reexpresión de la lámina A en células diferenciadas
    7. Ensayos de teratoma

Validación adicional en proceso:
Algunas líneas han completado los ensayos de teratoma, como se muestra en los datos complementarios. Para todas las demás líneas, los ensayos de teratoma están en proceso y el estado se actualizará a medida que se completen estos ensayos.

5. Material de partida original del que se derivaron estas células iPS

Las iPSC se derivaron de líneas celulares de fibroblastos no transformados del PRF Cell & Tissue Bank.

El método de transducción utilizado para todas las líneas iPS fue Retrovirus MKOS.

Identificación de línea iPSCMutaciónGénero y edad de donaciónTipo de célula de origen haga clic aquí.Datos de apoyo
HGADFN003 IPS 1B LMNAExón 11,
1824 C>T
Macho 2 años 0 meses Fibroblastos dérmicos
HGADFN003
003 iPS1B
HGADFN003 IPS 1C Exón 11 de LMNA,
1824 C>T
Macho 2 años 0 meses Fibroblastos dérmicos
HGADFN003
003 iPS1C
HGDFN003
IPS 1D
Exón 11 de LMNA,
1824 C>T
Macho 2 años 0 meses Fibroblastos dérmicos
HGADFN003
003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J Exón 11 de LMNA, 1824 C>TMacho 8 años 5 mesesFibroblastos dérmicos HGADFN167167 caballos 1J
HGADFN167 IPS 1Q Exón 11 de LMNA, 1824 C>TMacho 8 años 5 mesesFibroblastos dérmicos HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090 IPS 1B Madre de HGADFN167 (no afectada)Mujer 37 años 10 mesesFibroblastos dérmicos
HGMDFN090
090 iPS1B
HGMDFN090 IPS 1C Madre de HGADFN167 (no afectada)Mujer 37 años 10 mesesFibroblastos dérmicos
HGMDFN090
090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2Padre de HGADFN167 (no afectado)Hombre de 40 años
5 meses
Fibroblastos dérmicos HGFDFN168168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1PPadre de HGADFN167 (no afectado)Hombre de 40 años
5 meses
Fibroblastos dérmicos
HGFDFN168
168 iPS1P

6. Únase a nuestra lista de correo electrónico para recibir futuras actualizaciones de iPSC y nuevas líneas celulares.

Seguimos generando líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Si desea recibir actualizaciones periódicas sobre las células madre pluripotentes inducidas que se encuentran en el banco de células y tejidos de la PRF, únase a nuestra lista de correo electrónico haciendo clic en aquí

7. ¿Preguntas?

Comuníquese con Leslie Gordon, MD, PhD, Directora Médica, si tiene alguna pregunta o necesidad, al lgordon@progeriaresearch.org o 978-535-2594

8. Pedido de líneas de células iPS

En 2014, PRF instituyó una política de no realizar cambios en nuestro MTA. Esto es el resultado de 12 años de acuerdos contractuales con 70 equipos de investigación que trabajan en instituciones de 14 países. PRF y sus asesores legales han tenido en cuenta los problemas que han surgido durante ese período y han editado el acuerdo en consecuencia, lo que ha dado como resultado lo que consideramos términos justos y razonables.

Para instituciones del gobierno federal de EE. UU. o si tiene preguntas, comuníquese con Wendy Norris a: wnorris@brownhealth.org o 401-274-1122 x 48063.

Paso 1: Completar una solicitud y un acuerdo de transferencia de material

Solicitud y Convenio para Instituciones No Gubernamentales

Acuerdo de Transferencia de Material para Instituciones No Gubernamentales

Paso 2: Devuelva la solicitud completa y el acuerdo de transferencia de material a Wendy Norris a wnorris@brownhealth.orgUna vez aprobado, recibirá un correo electrónico confirmando su pedido y la fecha de envío prevista. 

Paso 3: El laboratorio del Dr. Stanford está distribuyendo actualmente líneas en crioviales congelados. Su laboratorio le enviará un correo electrónico cuando se haya enviado el cultivo, con información sobre el envío y el seguimiento. Se recomienda a los investigadores sin experiencia que obtengan capacitación en cursos especializados esenciales para el trabajo con células madre embrionarias humanas/iPSC.

El Centro de Células Madre Pluripotentes Humanas (dirigido por el Dr. Stanford) del Instituto de Investigación del Hospital de Ottawa ofrece capacitación virtual individual sobre los aspectos básicos de las técnicas de cultivo de células madre pluripotentes humanas específicas para las líneas celulares de células madre pluripotentes humanas que causan progeria. Las opciones y el formato de la capacitación son flexibles según el nivel de experiencia de los científicos.  Para obtener más información, envíe un correo electrónico a hpscf@ohri.ca.

Paso 4: La Universidad de Ottawa le facturará directamente cada línea de iPSC más los costos de mensajería, si los hubiera.

9. Preparación de medios de cultivo de células HGPS y iPS de control

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y las células madre embrionarias (ESC) deben alimentarse con mTeSR Plus de Stem Cell Technologies (cat# 5825). Siga las recomendaciones del proveedor para el almacenamiento.

10. Preparación de las placas de Matrigel

Nota:Todos los pasos que involucran matrigel deben realizarse lo más rápido posible y mantenerse lo más fríos posible.

  1. Descongele la botella de Matrigel a las 4°C. Verifique el certificado de análisis de ese lote para encontrar su concentración de proteína.
  2. Agregue suficiente medio DMEM/F12 frío al matrigel descongelado para alcanzar una concentración final de 5 mg/mL.
  3. Prepare alícuotas de 1 ml del matrigel preparado del paso 2 en tubos Falcon de 15 ml previamente enfriados.
  4. Congelar y almacenar todas las alícuotas a -20°DO.
  5. Para hacer placas de matrigel, retire una alícuota de matrigel (1 ml) de -20°C y añadir 10 ml de DMEM/F12 frío. Mezclar bien hasta que el pellet se descongele (sin crear burbujas y manteniendo siempre la solución fría).
  6. Transfiera a un tubo de 50 ml, luego agregue 20 ml de DMEM/F12 frío (1 ml de alícuota de matrigel se diluye en 30 ml de DMEM/F12), mezcle bien.
  7. Placa (1 ml/pocillo para placa de 6 pocillos, 0,5 ml/pocillo para placa de 12 pocillos, 0,25 ml/pocillo para placa de 24 pocillos). Asegúrese de que la solución cubra toda la superficie agitando la placa suavemente. No vuelva a congelar el Matrigel sobrante.
  8. Si utiliza la placa inmediatamente, déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 hora (o 30 minutos a 37°C) Observar el matrigel bajo el microscopio. El matrigel debe estar bien disperso y no “grumoso”.
  9. Si utiliza placas en otro momento, envuelva el borde de la placa con parafilm y guárdela a 4°C por hasta 2 semanas.

Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Tecnologías de vida, cat. TP5T11330-057

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11. Descongelación de células ES o iPS (por criovial)

  1. Saque una placa de matrigel de 4 °C y caliéntela a temperatura ambiente durante una hora, o prepare una placa de matrigel nueva (consulte el protocolo de preparación de placa de matrigel).
  2. Calentar 4 ml de mTeSR Plus en un tubo Falcon de 15 ml.
  3. Saque las células del tanque de nitrógeno líquido y agítelas en un baño a 37 °C hasta que solo quede un pequeño trozo de hielo. El vial debería descongelarse en 1 o 2 minutos. Este paso debe realizarse rápidamente.
  4. Tubo de celda de etanol y tubo de medio Falcon y colocar en la campana.
  5. Utilice 1 ml Punta de boca ancha para lentamente Agregue células a 4 ml de medio precalentado (evite mezclar la suspensión celular).
  6. Centrifugado a 130 rcf durante 5 minutos.
  7. Retire el sobrenadante.
  8. Agregue 2 ml de medio PSC y con una punta de boca ancha Romper los grumos con cuidado. Transfiera el medio a un pocillo de una placa de 6 pocillos y agregue 2 µL de inhibidor de ROCK (Y27632, concentración final de 10 µM). Coloque en la placa un pocillo recubierto con Matrigel (de una placa de 6 pocillos).
  9. Agite suavemente las células para distribuirlas uniformemente y colóquelas en una incubadora hipóxica (5%O2, 10% CO2) Evite alterar la placa durante 24 horas después de la siembra.

    NOTA: Es muy importante evitar la descomposición excesiva de los grumos o el pipeteo agresivo, ya que esto puede reducir significativamente la tasa de supervivencia. Las células deben permanecer en grupos de entre 100 y 300 células en el momento de la siembra. Si bien debe ser cuidadoso, intente trabajar rápidamente una vez que las células se descongelen para minimizar el tiempo de contacto con el crioprotector.

  10. Retire el medio después de 24 horas y agregue 2 ml de medio PSC (para una placa de 6 pocillos, 1 ml para una de 12 pocillos y 0,5 ml para una de 24 pocillos). Consulte el protocolo de recolección y cuidado de células madre embrionarias y células madre in vitro.

    Medios de comunicación del PSC

    mTeSR Plus de Stem Cell Technologies (cat# 5825). Siga las recomendaciones del proveedor para el almacenamiento.

    ¿Qué es el inhibidor de ROCK Y27632?

    El inhibidor de ROCK Y27632 es un inhibidor selectivo de la quinasa asociada a Rho p160 ROCK. El tratamiento con el inhibidor de ROCK Y27632 previene la apoptosis inducida por disociación de las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), lo que aumenta la tasa de supervivencia y mantiene la pluripotencia durante el subcultivo y la descongelación de las hESC y las hiPSC. También se ha demostrado que el inhibidor de ROCK Y27632 mejora la tasa de supervivencia de las células madre durante la criopreservación. Tenga en cuenta que las alícuotas del inhibidor de ROCK son sensibles a la luz y a los ciclos repetitivos de congelación y descongelación. Asegúrese de utilizar estas alícuotas dentro de la vida útil recomendada por el proveedor.

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    12. Recolección y cuidado de células madre embrionarias humanas e iPSC

    1. Al día siguiente de descongelar las células, obsérvelas bajo el microscopio para determinar la tasa de supervivencia. NOTA: es normal observar una gran cantidad de células no adheridas. Mientras algunas células estén adheridas, pueden surgir colonias a partir de ellas en un plazo de 3 a 7 días.
    2. Retire el medio de cultivo de los pocillos y pipetee 2 ml (para una placa de 6 pocillos, 1 ml para una de 12 pocillos y 0,5 ml para una de 24 pocillos) de medio PSC fresco y tibio por pocillo. Devuelva la placa a la incubadora.
    3. Las células se alimentan hasta que 60-70% confluye (siga las recomendaciones del proveedor).
    4. A partir del día 2, se deben observar las células y limpiarlas de cualquier célula diferenciada que pueda estar creciendo.
    5. Para limpiar las células, utilice la campana extractora y raspe las células diferenciadas con la punta de una pipeta.
    6. Una vez limpias las celdas, cambie el medio como se realizó en los pasos anteriores.

    (Ver Congelación de hESC/iPSC o Transferencia de hESC/iPSC)

    NOTA:

    Se determinó que los medios PSC son más eficientes en un entorno hipóxico. También hemos observado que se produce una menor diferenciación cuando las células se cultivan en incubadoras hipóxicas en comparación con las normóxicas. Por último, las células sembradas tienen una mejor tasa de supervivencia cuando se utiliza una incubadora hipóxica.

    Normóxico: 37°C, 21% O2, 5%-CO2

    Hipóxico: 37°C, 5%O2, 10% CO2

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    13. Pasando hESC/iPSC

    1. Agregue 2 ml de medio PSC a una placa recubierta de Matrigel de 6 pocillos y reserve.
    2. Tome la placa que va a pasar y retire el medio del pocillo y lávelo una vez con 1 ml de PBS (-/-).
    3. Añade 1 ml de la solución de EDTA al pocillo y déjalo reposar a temperatura ambiente durante 3 o 4 minutos. No muevas la placa porque las células pueden empezar a desprenderse.
    4. Retire la solución de EDTA y agregue 1 ml de medio PSC. No deje EDTA sobre las células durante más de 4 minutos, ya que esto hará que las células se despeguen.
    5. Raspe las células con un raspador de células y divídalas entre los 6 pocillos de su placa que contiene el medio PSC. Evite romper excesivamente los fragmentos de la colonia y trate de raspar con cuidado. Intente mantener las células en trozos grandes. Utilice una punta de pipeta de boca ancha para romper los grumos si es necesario. La ruptura excesiva de células puede causar la muerte celular o una diferenciación espontánea excesiva después del pase.
    6. Incubar a 37°C después de distribuir uniformemente las células en cada pocillo (agitación en forma de L o 8). Evite alterar la placa durante 24 horas después del pase.

    NOTA:Una vez que se hayan raspado las células, conviene transferirlas a la nueva placa lo antes posible porque se volverán a adherir rápidamente (en 5 minutos).

    Si se deja EDTA sobre las células durante más de 4 minutos, las células pueden comenzar a desprenderse. Si esto sucede, simplemente recoja las células en un frasco Falcon de 15 ml con 4 ml de medio PSC. Centrifugue las células a 130 rcf durante 5 minutos. Resuspenda el pellet con 1 ml de medio y divídalo uniformemente entre una placa de 6 pocillos recubierta de Matrigel (160 µL por pocillo).

    Solución de EDTA: agregue 500 µL de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a 500 mL de DPBS (-/-). Agregue 0,9 g de NaCl. Filtre la solución para esterilizarla y guárdela a 4 °C durante un máximo de 6 meses.

    Del artículo:

    Pasaje y expansión de colonias de células madre pluripotentes humanas mediante disociación sin enzimas en condiciones de cultivo definidas químicamente

    Jeanette Cervezas,1 Daniel R. Gulbranson,2,3 Nicole George,4Lauren I. Siniscalchi,1 Jeffrey Jones,4,5 James A. Thomson,2,3,6 y Guokai Chen1,2

    14. Congelación de células madre embrionarias humanas o células madre iPSC

    1. Encienda Bio-Cool (congelador de velocidad controlada) y ajuste la temperatura a -7 °C.
    2. Retire las células de la incubadora y observe la confluencia y la morfología bajo el microscopio.
    3. Si los pocillos son confluentes con 70%, retire el medio antiguo y lávelo una vez con PBS (-/-), luego agregue 1 ml de solución de EDTA (ver paso con solución de EDTA) por pocillo.
    4. Incubar a temperatura ambiente durante 3-4 minutos.
    5. Aspire la solución de EDTA y agregue 1 ml de medio mFreSR frío (cat#05855, Stem Cell Technologies).
    6. Utilice un raspador de células para levantar las células con cuidado. Mantenga las células en trozos grandes tanto como sea posible y evite pipetear hacia arriba y hacia abajo.
    7. Transfiera las células/mFreSR a un criotubo utilizando una punta de boca ancha. Mantenga los viales en hielo hasta que estén listos para el paso 8.
    8. Coloque los tubos en Bio-Cool e incube durante 10 minutos.
    9. Consigue nitrógeno líquido.
    10. Después de 10 minutos, siembre las células sumergiendo una espátula en nitrógeno líquido y tocando el costado del criovial durante aproximadamente 10 a 30 segundos o hasta que vea que se forma un cristal en el costado del criovial.
    11. Inicie el programa 1 presionando el botón “PROG” y recorra el programa presionando el botón nuevamente y debería ver la velocidad de 0,5 °C/min. Luego presione “RUN”.
    12. Una vez que la temperatura alcanza los -65 °C, los tubos criogénicos se pueden transferir y almacenar en nitrógeno líquido.

    Alternativas

    Otra opción es colocar los tubos criogénicos en un recipiente congelador (Biocision-CoolCell) y conservarlos a -80 °C durante la noche. Pasar los tubos criogénicos a nitrógeno líquido (fase líquida o de vapor) al día siguiente.

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