1 Información de antecedentes de iPSC para el no científico

Las células madre son células "inmaduras" que aún no se han comprometido a convertirse en ningún tipo de célula. Son flexibles porque tienen el potencial de convertirse en muchos tipos diferentes de células maduras en el cuerpo, como las células que forman el corazón o los vasos sanguíneos y otros tejidos y órganos. En 2007, los investigadores descubrieron una estrategia para crear células madre en el laboratorio reprogramando células adultas maduras que comúnmente cultivamos con fines de investigación.^{1, 2} . Estas células madre creadas artificialmente se denominan células madre pluripotentes inducidas ("iPSC"). Para el campo de la progeria, este es un gran avance. Por primera vez, los científicos ahora pueden producir células madre de progeria y hacer preguntas sobre cómo funcionan y se desarrollan las células madre en la progeria. Anteriormente, no existía una fuente de células madre de progeria humana y, por lo tanto, había un vacío de información sobre cómo funcionan las células madre de progeria en comparación con las células madre de personas sin progeria. Además, los científicos pueden reprogramar las células madre de progeria para crear, por primera vez, vasos sanguíneos, células cardíacas y otros tipos de células maduras de progeria. Hasta ahora, no había una fuente de progeria humana en el corazón o en las células de los vasos sanguíneos.  Ahora podemos pedir clave preguntas sobre la enfermedad cardíaca que conduce a la muerte prematura en la progeria por ataques cardíacos y accidentes cerebrovasculares. Podemos comparar estos descubrimientos con la enfermedad cardíaca y el envejecimiento en la población en general y descubrir más sobre lo que influye en el envejecimiento en todos nosotros. Ya se han publicado varios estudios excelentes con células madre de progeria.^{3 - 5}  Nuestro objetivo en The Progeria Research Foundation es facilitar muchos más descubrimientos utilizando esta valiosa herramienta. Para obtener una introducción a las células madre, consulte este sitio web del gobierno de EE. UU.: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Finalidad de la generación y distribución de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) por The Progeria Research Foundation

La misión de la Fundación de Investigación Progeria es descubrir tratamientos y la cura para el Síndrome de Progeria Hutchinson-Gilford y sus trastornos relacionados con el envejecimiento. En 2009, PRF entró en colaboración con un equipo experto de científicos de la Universidad de Toronto, Canadá, bajo la dirección de William Stanford, PhD, para generar iPSC de Progeria de alta calidad. El Dr. Stanford es el Presidente de Investigación de Canadá en Biología Integrativa de Células Madre. A partir de 2011, PRF continúa colaborando con el Dr. Stanford en la Universidad de Ottawa, Canadá, donde es Profesor de Medicina Celular y Molecular, Facultad de Medicina, y Científico Principal en el Centro Sprott para la Investigación con Células Madre del Instituto de Investigación del Hospital de Ottawa.

Nuestro objetivo es proporcionar esta valiosa herramienta a los investigadores de todo el mundo. Esta nueva herramienta de investigación se utilizará para generar investigaciones nuevas e innovadoras en progeria, así como su relación con las enfermedades cardíacas y el envejecimiento.  

3 Generación de células madre pluripotentes inducidas por el síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (iPSC)

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se derivaron usando transducción retroviral pseudotipada con VSVG de cuatro factores humanos, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc en fibroblastos. Las colonias de iPSC se derivaron de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). El procedimiento utilizado fue esencialmente como se describió anteriormente pero sin el uso del reportero EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4 Control de calidad: validación y caracterización

Las líneas que están disponibles actualmente se han sometido a varios pasos de validación (ver PDF descargables a continuación):

5. Material de partida original del que se derivaron estas células iPS

Las iPSC se derivaron de líneas celulares de fibroblasto no transformadas de PRF Cell & Tissue Bank.

El método de transducción utilizado para todas las líneas iPS fue Retrovirus MKOS.

ID de línea iPSC	Mutación	Género y Donación Edad	Tipo de celda de origen Haga clic aquí.	Datos de soporte
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Hombre 2yr 0mo	Fibroblastos Dérmicos HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Hombre 2yr 0mo	Fibroblastos Dérmicos HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Hombre 2yr 0mo	Fibroblastos Dérmicos HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exón 11, 1824 C> T	Hombre 8yr 5mo	Fibroblastos dérmicos HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exón 11, 1824 C> T	Hombre 8yr 5mo	Fibroblastos dérmicos HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Madre de HGADFN167 (no afectada)	Hembra 37yr 10mo	Fibroblastos Dérmicos HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Madre de HGADFN167 (no afectada)	Hembra 37yr 10mo	Fibroblastos Dérmicos HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Padre de HGADFN167 (no afectado)	40yr masculino 5mo	Fibroblastos dérmicos HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Padre de HGADFN167 (no afectado)	40yr masculino 5mo	Fibroblastos Dérmicos HGFDFN168	168 iPS1P

6 Únase a nuestra lista de correo electrónico para futuras actualizaciones de iPSC y nuevas líneas celulares

Seguimos generando líneas iPSC. Si desea recibir actualizaciones periódicas sobre las iPSC que se encuentran en el banco de células y tejidos de PRF, únase a nuestra lista de correo electrónico haciendo clic en esta página

7. ¿Preguntas?

Póngase en contacto con Leslie Gordon, MD, PhD, Director Médico, con cualquier pregunta o necesidad, en lgordon@progeriaresearch.org o 978-535-2594

8. Pedido de líneas celulares iPS

En 2014, PRF instituyó una política de no cambios en nuestra MTA. Este es el resultado de años de acuerdos contractuales de 12 con equipos de investigación de 70 que trabajan en instituciones en países de 14. PRF y su asesor han tenido en cuenta los problemas que surgieron en ese período de tiempo y han editado el acuerdo en consecuencia, lo que resulta en términos que consideramos justos y razonables.

Para instituciones del gobierno federal de EE. UU. O preguntas, comuníquese con Wendy Norris en: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Paso 1: complete una solicitud y un acuerdo de transferencia de material

Solicitud y Acuerdo para Instituciones No Gubernamentales

Acuerdo de transferencia de material para instituciones no gubernamentales

Paso 2: Devuelva la solicitud completa y el acuerdo de transferencia de materiales a Wendy Norris a wnorris@lifespan.org. Una vez aprobado, recibirá un correo electrónico confirmando su pedido y la fecha de envío anticipada. 

Paso 3: El laboratorio del Dr. Stanford actualmente distribuye líneas en crioviales congelados. Su laboratorio le enviará un correo electrónico cuando se haya enviado el cultivo, con información de envío y seguimiento. Los investigadores sin experiencia están orientados a obtener formación en cursos especializados esenciales para el trabajo con células madre embrionarias humanas / iPSC.

La Instalación de Células Madre Pluripotentes Humanas (dirigida por el Dr. Stanford) en el Instituto de Investigación del Hospital de Ottawa ofrece capacitación virtual individual sobre los conceptos básicos de las técnicas de cultivo de iPSC específicas para las líneas celulares de Progeria iPSC. Las opciones y el formato de capacitación son flexibles según el nivel de experiencia de los científicos.  Para obtener más información, envíe un correo electrónico a hpscf@ohri.ca.

Paso 4: La Universidad de Ottawa le facturará directamente por cada línea iPSC más los costos de mensajería, si corresponde.

9. Preparación de medios de cultivo celular HGPS y control iPS

Las iPSC y ESC deben alimentarse con mTeSR Plus de Stem Cell Technologies (cat # 5825). Siga las recomendaciones de almacenamiento del proveedor.

10. Preparación de placas de Matrigel

Note: Todos los pasos relacionados con matrigel deben realizarse lo más rápido posible y mantenerse lo más frío posible.

1. Descongele la botella de matrigel a las 4°C. Verifique el certificado de análisis de ese lote para encontrar su concentración de proteína.
2. Agregue suficiente medio DMEM/F12 frío al matrigel descongelado para alcanzar una concentración final de 5 mg/mL.
3. Haga alícuotas de 1 ml del matrigel preparado del paso 2 en tubos falcon de 15 ml previamente enfriados.
4. Congelar y almacenar todas las alícuotas a -20°C.
5. Para hacer placas de matrigel, retire una alícuota de matrigel (1mL) de -20°C y agregue 10 ml de DMEM/F12 frío. Mezcle bien hasta que el gránulo se descongele (sin crear burbujas y siempre mantenga la solución fría).
6. Transfiera a un tubo de 50 mL, luego agregue 20 mL de DMEM/F12 frío (1 mL de una alícuota de Matrigel se diluye en 30 mL de DMEM/F12), mezcle bien.
7. Placa (1 ml/pocillo para placa de 6 pocillos, 0.5 ml/pocillo para placa de 12 pocillos, 0.25 ml/pocillo para placa de 24 pocillos). Asegúrese de que la solución cubra toda la superficie agitando suavemente la placa. No vuelva a congelar ningún matrigel sobrante.
8. Si usa la placa inmediatamente, déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 hora (o 30 minutos a 37°C), observar matrigel bajo el microscopio. Matrigel debe estar bien disperso y no "grumoso".
9. Si usa placas en otro momento, envuelva el borde de la placa con parafilm y guárdelo a 4°C hasta por 2 semanas.

Matrigel - BD / Fisher, cat # CB-40230

DMEM / F12 - Life Technologies, cat # 11330-057

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11. Descongelar células ES o iPS (por criovial)

1. Saque una placa de matrigel de 4 °C y caliéntela a temperatura ambiente durante una hora, o haga una placa de matrigel nueva (consulte el protocolo de preparación de la placa de matrigel).
2. Caliente 4 ml de mTeSR Plus en un tubo falcon de 15 ml.
3. Retire las células del tanque de nitrógeno líquido y agítelas en un baño a 37 °C hasta que solo quede un pequeño trozo de hielo. El vial debe descongelarse en 1-2 minutos. Este paso debe hacerse rápidamente.
4. Tubo de células de etanol y tubo de medios halcón y colocar en la campana.
5. Utilice un 1 ml punta de boca ancha para lentamente agregue las células a 4 ml de medio precalentado (evite mezclar la suspensión de células).
6. Girar a 130 rcf durante 5 minutos.
7. Retire el sobrenadante.
8. Añadir 2mL de medio PSC, y con punta de boca ancha romper los grumos suavemente. Transfiera los medios a un pocillo de una placa de 6 pocillos y agregue 2 uL de inhibidor de ROCK (Y27632, concentración final de 10 uM). Coloque la placa en un pocillo recubierto con matrigel (de una placa de 6 pocillos).
9. Agite las células suavemente para distribuirlas uniformemente y colóquelas en una incubadora hipóxica (5% O₂, 10% CO₂). Evite perturbar la placa durante las 24 horas posteriores a la siembra.

   NOTA: Es muy importante evitar la descomposición excesiva de grumos o el pipeteo agresivo. Esto puede reducir significativamente la tasa de supervivencia. Las células deben permanecer en trozos de 100 a 300 células grandes en el momento de la siembra. Mientras sea cuidadoso, intente trabajar rápidamente una vez que las células se hayan descongelado para minimizar el tiempo que están en contacto con el crioprotector.

10. Retire el medio después de 24 horas y agregue 2 ml de medio PSC (para una placa de 6 pocillos, 1 ml para 12 pocillos y 0.5 ml para una placa de 24 pocillos). Consulte Recolección y cuidado del protocolo hESC/iPSC.

PSC media

mTeSR Plus de Stem Cell Technologies (cat # 5825). Siga las recomendaciones de almacenamiento del proveedor.

¿Qué es el ROCK Inhibitor Y27632?

El inhibidor de ROCK Y27632 es un inhibidor selectivo de la quinasa p160 ROCK asociada a Rho. El tratamiento con el inhibidor de ROCK Y27632 previene la apoptosis inducida por disociación de células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC), lo que aumenta la tasa de supervivencia y mantiene la pluripotencia durante el subcultivo y la descongelación de hESC y hiPSC. También se ha demostrado que el inhibidor de ROCK Y27632 mejora la tasa de supervivencia de las células madre durante la crioconservación. Tenga en cuenta que las alícuotas del inhibidor de roca son sensibles a la luz y a los ciclos de congelación y descongelación repetitivos. Asegúrese de usar estas alícuotas dentro de la vida útil recomendada por el proveedor.

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12. Recolección y cuidado de hESC/iPSC

1. El día después de descongelar las células, obsérvelas bajo el microscopio para determinar la tasa de supervivencia. NOTA: es normal observar una gran cantidad de celdas sueltas. Siempre que algunas células estén adheridas, las colonias pueden surgir de ellas dentro de 3 a 7 días.
2. Retire los medios de los pocillos y pipetee 2 ml (para una placa de 6 pocillos, 1 ml para 12 pocillos y 0.5 ml para una placa de 24 pocillos) de medio PSC fresco y tibio por pocillo. Regrese la placa a la incubadora.
3. Las células se alimentan hasta un 60-70% de confluencia (siga las recomendaciones del proveedor).
4. A partir del día 2, las células deben observarse y limpiarse de cualquier célula diferenciada que pueda estar creciendo.
5. Para limpiar las células, utilice la campana extractora y raspe las células diferenciadas con una punta de pipeta.
6. Una vez que las celdas estén limpias, cambie los medios como se hizo en los pasos anteriores.

(Consulte Congelar hESC/iPSC o Aprobar hESC/iPSC)

NOTA:

Se determinó que los medios de PSC eran más eficientes en un entorno hipóxico. También hemos observado que se produce una menor diferenciación cuando las células se cultivan en incubadoras hipóxicas frente a normóxicas. Por último, las células sembradas tienen una mejor tasa de supervivencia cuando se utiliza una incubadora hipóxica.

Normóxico: 37°C, 21%O₂, 5% CO₂

Hipóxico: 37°C, 5%O₂, 10% CO₂

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13. Pasando hESC/iPSC

1. Agregue 2 ml de medio PSC a una placa recubierta de matrigel de 6 pocillos y reserve.
2. Tome la placa que se va a pasar y retire los medios del pocillo y lave una vez con 1 ml de PBS (-/-).
3. Agregue 1 ml de la solución de EDTA al pozo y déjelo durante 3-4 minutos a temperatura ambiente. No mueva la placa porque las células pueden comenzar a desprenderse.
4. Retire la solución EDTA y agregue 1 ml de medio PSC. No deje EDTA en las celdas durante más de 4 minutos, ya que esto hará que las celdas se despeguen.
5. Raspe las células con un raspador de células y divida las células entre los 6 pocillos de su placa que contiene medios PSC. Evite romper excesivamente las piezas de la colonia y trate de ser cuidadoso con el raspado. Trate de mantener las células en trozos grandes. Use una punta de pipeta de boca ancha para deshacer los grumos si es necesario. La ruptura excesiva de las células puede provocar la muerte celular o una diferenciación espontánea excesiva después del paso.
6. Incubar a 37°C después de distribuir uniformemente las células en cada pocillo (figura 8 o agitación en forma de L). Evite la alteración de la placa durante las 24 horas posteriores al paso.

NOTA: Una vez que se hayan raspado las células, desea transferirlas a la nueva placa lo antes posible porque las células se volverán a unir rápidamente (en 5 minutos).

Si se deja EDTA en las células durante más de 4 minutos, las células pueden comenzar a desprenderse. Si esto sucede, simplemente recopile las células en un halcón de 15 ml con 4 ml de medio PSC. Haga girar las células a 130 rcf durante 5 minutos. Vuelva a suspender el sedimento con 1 ml de medio y divídalo uniformemente entre una placa recubierta de matrigel de 6 pocillos (160 ul por pocillo).

Solución de EDTA: agregue 500 ul de EDTA 0.5 M (pH 8.0) en 500 ml de DPBS (-/-). Añadir 0.9 g de NaCl. Filtre la solución para esterilizarla y guárdela a 4°C hasta por 6 meses.

Del papel:

Pasaje y expansión de colonias de células madre pluripotentes humanas por disociación libre de enzimas en condiciones de cultivo químicamente definidas

Cervezas Jeanette,¹ Daniel R. Gulbranson,^2,3 Nicole George,⁴Lauren I. Siniscalchi,¹ Jeffrey Jones,^4,5 James A. Thomson,^2,3,6 y Guokai Chen^1,2

14. Congelación hESC/iPSC

1. Encienda Bio-Cool (congelador de velocidad controlada) y ajuste la temperatura a -7 °C.
2. Retire las células de la incubadora y observe la confluencia y la morfología bajo el microscopio.
3. Si los pocillos tienen una confluencia del 70 %, retire los medios viejos y lávelos una vez con PBS(-/-), luego agregue 1 ml de solución de EDTA (consulte el paso con solución de EDTA) por pocillo.
4. Incubar a temperatura ambiente durante 3-4 minutos.
5. Aspire la solución de EDTA y agregue 1 ml de medio mFreSR frío (n.° de catálogo 05855, Stem Cell Technologies).
6. Utilice un raspador de células para levantar las células suavemente. Mantenga las células en trozos grandes tanto como sea posible y evite pipetear hacia arriba y hacia abajo.
7. Transferir células/mFreSR a un criotubo usando una punta de boca ancha. Mantenga los viales en hielo hasta que estén listos para el paso 8.
8. Coloque los tubos en Bio-Cool e incube durante 10 minutos.
9. Obtenga nitrógeno líquido.
10. Después de 10 minutos, siembre las células sumergiendo una espátula en nitrógeno líquido y tocando el costado del crio-vial durante aproximadamente 10-30 segundos o hasta que vea que se forma un cristal en el costado del crio-vial.
11. Inicie el programa 1 presionando el botón “PROG” y pasando por el programa presionando el botón nuevamente y debería ver la tasa de 0.5°C/min. , luego presione “EJECUTAR”.
12. Una vez que la temperatura alcanza los -65 °C, los criotubos se pueden transferir y almacenar en nitrógeno líquido.

Alternativas

Otra opción es colocar los criotubos en un recipiente de congelación (Biocision-CoolCell) y almacenarlos a -80 °C durante la noche. Mueva los tubos criogénicos a nitrógeno líquido (fase líquida o vapor) al día siguiente.

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