Célula linfoblasta
Protocolos culturales
Protocolo para el cultivo de linfocitos transformados
Protocolo para el cultivo de linfoblastos
Medio de crecimiento
RPMI 1640 – Termo-Fisher # 11875
Suero fetal bovino (FBS) 15% – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Penicilina-estreptomicina (opcional) – ThermoFisher #15140-122
Notas generales
- El medio de crecimiento siempre debe estar equilibrado en la incubadora a 37 °C, 5% CO2 Durante 30 minutos antes de usar
- Utilice siempre frascos con tapas ventiladas.
- Incubar siempre el matraz en posición vertical.
- No se deben utilizar más de 20 ml en un matraz T25.
Descongelación de células congeladas
Las células congeladas se recibirán en alícuotas de 1 ml en hielo seco. Mantenga las células congeladas hasta que se descongelen para el cultivo celular o colóquelas en un lugar con nitrógeno líquido si no va a comenzar los cultivos de inmediato. Sin embargo, se recomienda que, si va a almacenar las células para su uso posterior, haga crecer nuevas reservas y congele varias ampollas. Las células se criopreservan en 45% RPMI-1640, 50% FBS y 5% DMSO (grado de cultivo de tejidos).
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- Coloque 10 ml de suero bovino fetal (FBS) RPMI-1640, 15%, ± antibióticos en un matraz T-25 con tapa ventilada.
- Deje que el medio se equilibre en una incubadora humidificada a 37 °C con CO 5%.2 En el aire durante 30 minutos. Los matraces deben incubarse en posición vertical.
- Descongele cada ampolla o vial de células congeladas en un baño de agua a 37 °C o en un vaso con agua tibia, uno a la vez.
- Limpie rápidamente el exterior de la ampolla o el vial con etanol 70%. Si las células están en una ampolla de vidrio, rompa la ampolla con cuidado y asegúrese de proteger los dedos del vidrio roto.
- Extraiga 1 ml de células congeladas con una pipeta estéril y colóquelas en un matraz T-25 con 10 ml de medio. Etiquete claramente el matraz para identificar cada línea celular.
- Coloque el matraz en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% CO2 en el aire. Los matraces deben incubarse en posición vertical.
- Después de 24 horas, retirar 5 ml de medio de la parte superior sin alterar los linfocitos asentados en el fondo del matraz y reemplazar con 5 ml de medio precalentado.
- Continuar con el protocolo de cultivo de células linfoblastas.
Cultivo de linfoblastos
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- De tres a cuatro días después de la descongelación, cuente las células. Las células no son adherentes y crecen en grupos. Desmenuce los grupos pipeteando suavemente.
- Contar células.
- Lo ideal es que la concentración de células no supere los 2 x 106 células/ml.
- Dependiendo de la concentración de células, vuelva a alimentar, divida o congele las células.
- Vuelva a alimentar agregando 5-6 ml de medio de crecimiento equilibrado.
- Sembrar nuevos cultivos a una proporción no inferior a 2 x 105 células/ml.
- Las células deben congelarse a aproximadamente 5 x 106 células/ml. Seguir el protocolo de congelación de células.
Congelación de linfoblastos
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- Las células deben congelarse a aproximadamente 5 x 106 células/ml.
- Transfiera el volumen apropiado de células a un tubo cónico de 15 o 50 ml.
- Centrifugar a 4°C a 100 xg durante 10 minutos.
- Retirar el medio y resuspenderlo en un volumen apropiado de medio de congelación frío.
- Transfiera 1 ml de células a cada criovial.
- Coloque los crioviales en la cámara de congelación y coloque la cámara en el congelador a -80 °C durante la noche.
- Transfiera los crioviales a nitrógeno líquido al día siguiente.
Para obtener más información, póngase en contacto con:
Dra. Leslie B. Gordon, doctora en medicina
Profesor de Investigación Pediátrica Warren Alpert Facultad de Medicina de la Universidad de Brown y Departamento de Pediatría, Hospital Infantil Hasbro, Providence, RI Departamento de Anestesia, Hospital Infantil de Boston y Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA Director Médico, The Progeria Research Foundation
Teléfono: 978-535-2594
Teléfono: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
Wendy Norris
Teléfono: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org