Del envío de células congeladas

Las células congeladas se recibirán en alícuotas de 1 ml sobre hielo seco. Mantenga las células congeladas hasta que se descongelen para el cultivo celular o colóquelas en almacenamiento de nitrógeno líquido si no comienza los cultivos de inmediato. Sin embargo, se recomienda que si va a almacenar las células para su uso posterior, haga crecer reservas frescas y congele múltiples ampollas. Las células se criopreservan en 45% RPMI-1640, 50% suero de ternera fetal y 5% DMSO (grado de cultivo de tejidos).

1. Coloque 10 ml de RPMI-1640, 15% suero de ternera fetal (FCS), ± antibióticos en un matraz T-25.
2. Permita que los medios se equilibren en una incubadora humidificada 37 ° C con 5% CO 2 en aire durante 30 minutos.
3. Descongele cada ampolla de células congeladas en un baño de agua 37 ° C o en un vaso de precipitados con agua tibia, una a la vez.
4. Limpie rápidamente el exterior de la ampolla con una almohadilla de preparación de isopropanol estéril, luego envuelva la almohadilla de preparación alrededor de la ampolla para proteger los dedos y agriete el sello de la ampolla dentro de una campana de seguridad biológica.
5. Retire los ml 1 ml de células congeladas con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y colóquelo en un matraz T-25 con 10 ml de medio. Etiquete claramente el matraz para identificar cada línea celular.
6. Coloque las células en una incubadora humidificada 37 ° C con 5% CO 2 en el aire.
7. Después de 24 horas, retire 5 ml de medio de la parte superior sin alterar los linfocitos depositados en el fondo del matraz y reemplácelos con 5 ml de medio precalentado.
8. Alimente las células con 5 - 6 ml de medio fresco cada 3 - 4 días y divida en nuevos cultivos según sea necesario.

Del envío de culturas vivas

1. Los cultivos de linfocitos vivos se recibirán en matraces T-25 llenos hasta el tope con RPMI-1640, 15% FCS, 1% Penicilina-Estreptomicina (Gibco). Las tapas estarán apretadas y selladas con parafilm.
2. Eliminar parafilm.
3. Coloque los cultivos en una incubadora humidificada a 37 ° C con 5% de CO2 en aire y deje que las células se asienten (20-30 minutos).
4. Con una pipeta esterilizada, retire todo el medio menos 10-15 ml y deséchelo.
5. Vuelva a colocar los tapones en los matraces aflojados ligeramente para permitir el intercambio de gases (verifique que los hilos de los tapones no tengan medios. Si es así, puede transferirlos a un nuevo matraz). Coloque los cultivos nuevamente en la incubadora con 5% CO 2in aire. Deberían recuperarse en uno o dos días.
6. Alimente las células con medio fresco cada 3-4 días resuspendiendo los agregados celulares y eliminando el 50-60% del volumen y reemplazándolo con medio fresco. Las células extraídas del matraz se pueden utilizar para iniciar nuevos cultivos según sea necesario.

Wendy Norris