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Célula fibroblasto

Protocolos culturales

 

Protocolo para subcultivo y congelación de fibroblastos

Medios de crecimiento

DMEM – ThermoFisher #11960-044 (alto contenido de glucosa sin L-glutamina)

Suero fetal bovino con suero fetal bovino 15% – ThermoFisher #10437-028

1% (1X) Penicilina-estreptomicina – ThermoFisher #15140-122

1% (1X) GlutaMAX – ThermoFisher #35050-061

Tripsina

Tripsina EDTA C 0,25% (ThermoFisher #25200-056)

Solución salina equilibrada de Hank

HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) cloruro de calcio, (-) cloruro de magnesio, (-) sulfato de magnesio

DMSO para congelar

DMSO de grado de cultivo celular – Sigma #D2438

Descongelación de líneas celulares PRF

  1. Descongele las células rápidamente en un baño de agua a 37 °C.
  2. Limpie el exterior del vial con etanol 70%.
  3. Transfiera las células descongeladas a un matraz T25 que contenga 5 ml de medio de crecimiento.
  4. Coloque el matraz en una incubadora a 37 °C durante la noche.
  5. Al día siguiente, observe bajo el microscopio para asegurarse de que las células se hayan adherido.
  6. Retire el medio y reemplácelo con medio de crecimiento nuevo.

Subcultivo de líneas celulares PRF

  1. Las células deben dividirse cuando confluyen.
  2. Para dividir las células (los volúmenes dados suponen que las células están en un T25):
    a) Utilizando una técnica estéril, retire el medio y enjuague el matraz con 2-3 ml de HBSS estéril. Retire y deseche el HBSS.
    b) Agregue 1 ml de tripsina e incube durante 2-3 minutos. Las células deben examinarse con un microscopio invertido para determinar si han comenzado a redondearse, levantarse y flotar. Si las células no se desprenden después de 3 minutos, puede incubar otros 1-2 minutos.
    c) Apriete la tapa e incline suavemente el matraz de un lado al otro para desalojar todas las células. Si es necesario, puede golpear el matraz suavemente en un costado para aflojar las células.
    d) Añada 4 ml de medio nuevo al matraz tan pronto como las células floten para inactivar la tripsina. Enjuague los lados del matraz varias veces con el medio nuevo para lavar todas las células del plástico y colocarlas en la solución. Retire todo el líquido que contenga células y transfiéralo a un matraz cónico de 15 ml (o 50 ml si está juntando 3 o más matraces).
    e) Utilizando técnica estéril, extraer una alícuota para realizar el recuento en un hemocitómetro.
    f) Mientras se cuentan las células, el resto de la solución debe centrifugarse en la centrífuga clínica durante 5 minutos a 1000 rpm.
  3. Después de calcular el recuento de células, coloque las células en placas a una proporción de 2,5 x 105 células por matraz filtrante T25.
  4. Las células deben alimentarse cada 2-3 días con medio de crecimiento fresco.

Congelación:

Las células deben congelarse a una concentración no inferior a 5 x 105 células/ml/criovial en un medio de cultivo que contenía 10% DMSO y 30% FBS y posteriormente se colocaron en una cámara de congelación con isopropanol a -80˚C durante la noche. Se transfirieron al nitrógeno líquido al día siguiente.

Protocolo para subcultivo y congelación de fibroblastos

Para obtener más información, póngase en contacto con:

Dra. Leslie B. Gordon, doctora en medicina

Profesor de Investigación Pediátrica Warren Alpert Facultad de Medicina de la Universidad de Brown y Departamento de Pediatría, Hospital Infantil Hasbro, Providence, RI Departamento de Anestesia, Hospital Infantil de Boston y Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA Director Médico, The Progeria Research Foundation

Teléfono: 978-535-2594
Teléfono: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Wendy Norris
Banco de células y tejidos PRF
Teléfono: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
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