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Células de fibroblastos

Protocolos de cultura

 

Protocolo para subcultivar y congelar fibroblastos

Medios de crecimiento

DMEM - ThermoFisher # 11960-044 (glucosa alta sin L-glutamina)

15% FBS Suero fetal bovino - ThermoFisher # 10437-028

1% (1X) Penicilina-Estreptomicina - ThermoFisher # 15140-122

1% (1X) GlutaMAX - ThermoFisher # 35050-061

Tripsina

Trypsin EDTA C 0.25% (ThermoFisher # 25200-056)

Solución de sal equilibrada de Hank

HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) cloruro de calcio, (-) cloruro de magnesio, (-) sulfato de magnesio

DMSO para congelar

Grado de cultivo celular DMSO - Sigma #D2438

Descongelar líneas celulares PRF

  1. Descongele las células rápidamente en un baño de agua 37˚C.
  2. Limpie el exterior del vial con etanol 70%.
  3. Transfiera las células descongeladas a un matraz T25 que contenga 5 ml de medio de crecimiento.
  4. Coloque el matraz en la incubadora 37˚C durante la noche.
  5. Al día siguiente, observe bajo el microscopio para asegurarse de que las células se hayan adherido.
  6. Retire los medios y reemplácelos con medios de crecimiento frescos.

Subcultivo de líneas celulares PRF

  1. Las células deben dividirse cuando confluentes.
  2. Para dividir celdas (los volúmenes dados suponen que las celdas están en un T25):
    a) Utilizando una técnica estéril, retire el medio y enjuague el matraz con 2-3 ml de HBSS estéril. Retire y deseche HBSS.
    b) Agregue 1 ml de tripsina e incube durante 2-3 minutos. Las células deben examinarse con un microscopio invertido para determinar si han comenzado a redondearse, elevarse y flotar. Si las células no se desprenden después de 3 minutos, puede incubar otros 1-2 minutos.
    c) Apriete la tapa e incline suavemente el matraz de lado a lado para desalojar todas las células. El matraz se puede golpear ligeramente a un lado para aflojar las células si es necesario.
    d) Agregue 4 ml de medio nuevo al matraz tan pronto como las células estén flotando para inactivar la tripsina. Enjuague los lados del matraz varias veces con el nuevo medio para eliminar todas las células del plástico y colocarlas en la solución. Retire todo el líquido que contenga las células y transfiéralo a un recipiente cónico de 15 ml (o 50 ml si está agrupando 3 o más matraces).
    e) Utilizando técnica estéril, retirar una alícuota para contar con un hemocitómetro.
    f) Mientras cuenta las células, el resto de la solución debe centrifugarse en la centrífuga clínica durante 5 minutos a 1000 rpm.
  3. Después de calcular su recuento celular, coloque las celdas en 2.5 x 105 celdas por matraz superior del filtro T25.
  4. Las células deben alimentarse cada 2-3 días con medio de crecimiento fresco.

Congelación:

Las celdas deben congelarse a no menos de 5 x 105 células / ml / criovial en medio de crecimiento que contiene DMSO al 10% y FBS al 30% y posteriormente se colocan en una cámara de congelación de isopropanol a -80ºC durante la noche. Transfiera al nitrógeno líquido al día siguiente.

Protocolo para subcultivar y congelar fibroblastos

Para más información póngase en contacto:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Profesor de Investigación en Pediatría Warren Alpert Medical School of Brown University y Departamento de Pediatría, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Department of Anesthesia, Children's Hospital Boston y Harvard Medical School, Boston, MA Director médico, The Progeria Research Foundation

Teléfono: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Wendy Norris
PRF Cell and Tissue Bank
Teléfono: 401-274 1122-x 48063
wnorris@lifespan.org