Tripsina

Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Solución de sal equilibrada de Hank

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) cloruro de calcio, (-) cloruro de magnesio, (-) sulfato de magnesio)

DMSO para congelar

Cultivo celular Grado DMSO

Las células llegarán congeladas en hielo seco a una concentración de aproximadamente 5 x 10⁵células / vial

Protocolo para descongelar fibroblastos

1. Descongele las células rápidamente en un baño de agua 37 ° C.
2. Limpie el exterior del vial con etanol 70%.
3. Transfiera las células descongeladas a un matraz T25 que contenga 5 ml de medio de crecimiento sin puromicina.
4. Coloque el matraz en una incubadora 37 ° C durante la noche.
5. Al día siguiente, observe bajo el microscopio para asegurarse de que las células se hayan adherido.
6. Retire los medios y reemplácelos con medios de crecimiento frescos.

Subcultivo de líneas celulares PRF

1) Cuando las células estén establecidas y en crecimiento, comience a usar medios que contengan 0.75 μg / ml de puromicina. Continuar manteniendo las células en medios que contengan 0.75 μg / ml de puromicina.

2) Las celdas deben dividirse cuando confluentes.

3) Para dividir celdas (los volúmenes dados suponen que las celdas están en un T25):

A. Usando una técnica estéril, retire los medios y enjuague el matraz con 2-3 ml de HBSS estéril. Retire y deseche HBSS.

B. Añadir 1 ml de tripsina e incubar durante 2-3 minutos. Las células deben revisarse bajo un microscopio invertido para determinar si han comenzado a redondearse, elevarse y flotar. Si las células no se desprenden después de 3 minutos, puede incubar otros minutos 1-2

C. Apriete la tapa y gire suavemente el matraz de lado a lado para desalojar todas las celdas. El matraz se puede golpear ligeramente en el costado para aflojar las células si es necesario.

D. Agregue 4 ml de nuevos medios al matraz tan pronto como las células estén flotando para inactivar la tripsina. Enjuague los lados del matraz varias veces con los nuevos medios para lavar todas las células del plástico y colocarlas en la solución. Retire todas las células que contengan líquido y transfiéralas a un 15ml cónico (o 50 ml si está juntando 3 o más matraces).

E. Usando una técnica estéril, retire una alícuota para contar con un hemocitómetro.

F. Mientras cuenta las células, el resto de la solución debe centrifugarse en la centrífuga clínica durante 5 minutos a 1000 rpm.

4) Después de calcular el recuento de células, coloque las células en placa a 2.5 x 10⁵ células por matraz superior del filtro T 25.

5) Las células deben alimentarse cada día 2-3 con medio de crecimiento fresco que contenga 0.75 μg / ml de puromicina.

Congelación:

Las celdas deben congelarse a no menos de 5x 10⁵ células / ml / criovial en medios de crecimiento que contiene 10% DMSO y 30% FBS sin puromicina y posteriormente se coloca en una cámara de congelación de isopropanol a -80 ° C durante la noche. Transfiera al nitrógeno líquido al día siguiente.

Wendy Norris