लिम्फोब्लास्ट संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल

तरक्की का जरिया

आरपीएमआई 1640 – थर्मोफिशर # 11875
15% फीटल बोवाइन सीरम (FBS) – थर्मोफिशर #10437-028
1% (1X) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (वैकल्पिक) – थर्मोफिशर #15140-122

सामान्य टिप्पणियां

• इनक्यूबेटर में ग्रोथ मीडियम को हमेशा 37°C, 5% CO पर संतुलित किया जाना चाहिए₂ उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए
• हमेशा हवादार ढक्कन वाले फ्लास्क का उपयोग करें
• फ्लास्क को हमेशा सीधी स्थिति में रखें
• T25 फ्लास्क में 20 मिली से अधिक का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए

जमी हुई कोशिकाओं को पिघलाना

जमे हुए कोशिकाओं को सूखी बर्फ पर 1 मिली अंश में प्राप्त किया जाएगा। सेल कल्चर के लिए कोशिकाओं को पिघलने तक जमे रहने दें या यदि कल्चर तुरंत शुरू नहीं करना है तो लिक्विड नाइट्रोजन स्टोरेज में रखें। हालाँकि, यह अनुशंसा की जाती है कि यदि आप बाद में उपयोग के लिए कोशिकाओं को संग्रहीत करने जा रहे हैं, तो ताज़ा स्टॉक उगाएँ और कई एम्पुल्स को फ्रीज करें। कोशिकाओं को 45% RPMI-1640, 50% FBS, और 5% DMSO (ऊतक संवर्धन ग्रेड) में क्रायोप्रिजर्व किया जाता है।

1. 1. 10 मिली आरपीएमआई-1640, 151टीपी3टी भ्रूणीय गोजातीय सीरम (एफबीएस), ± एंटीबायोटिक्स को वेंटेड कैप वाले टी-25 फ्लास्क में डालें।
   2. मीडिया को 5% CO के साथ 37°C आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में संतुलित होने दें₂ 30 मिनट के लिए हवा में रखें। फ्लास्क को सीधी स्थिति में रखना चाहिए।
   3. जमी हुई कोशिकाओं के प्रत्येक एम्पुल या शीशी को 37°C जल स्नान या गुनगुने पानी के बीकर में एक-एक करके पिघलाएं।
   4. 70% इथेनॉल से एम्पुल या शीशी के बाहरी हिस्से को जल्दी से साफ करें। अगर सेल्स कांच के एम्पुल में हैं, तो ध्यान से एम्पुल को तोड़ें और उंगलियों को टूटे हुए कांच से बचाना सुनिश्चित करें।
   5. एक स्टेराइल पिपेट से 1 मिली जमी हुई कोशिकाओं को निकालें और 10 मिली मीडियम के साथ टी-25 फ्लास्क में रखें। प्रत्येक सेल लाइन की पहचान करने के लिए फ्लास्क पर स्पष्ट रूप से लेबल लगाएँ।
   6. फ्लास्क को 5% CO के साथ 37°C आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखें₂ हवा में। फ्लास्क को सीधी स्थिति में रखा जाना चाहिए।
   7. 24 घंटे के बाद, फ्लास्क के तल पर जमे लिम्फोसाइटों को परेशान किए बिना ऊपर से 5 मिलीलीटर माध्यम को हटा दें और उसके स्थान पर 5 मिलीलीटर पूर्व-गर्म माध्यम डाल दें।
   8. लिम्फोब्लास्ट कोशिका संवर्धन प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।

लिम्फोब्लास्ट कल्चर

1. 1. पिघलने के तीन से चार दिन बाद, कोशिकाओं की गिनती करें। कोशिकाएँ चिपकती नहीं हैं और गुच्छों में बढ़ती हैं। गुच्छों को धीरे-धीरे पाइपिंग करके तोड़ें।
   2. कोशिकाओं की गिनती करें.
   3. आदर्श रूप से, कोशिका सांद्रता 2 x 10 से अधिक नहीं होनी चाहिए⁶ कोशिकाएं/एमएल.
   4. कोशिका सांद्रता के आधार पर कोशिकाओं को पुनः फीड करें, विभाजित करें या फ्रीज करें।
   5. संतुलित वृद्धि माध्यम की 5-6 मिली मात्रा डालकर पुनः खिलाएं।
   6. नये पौधों को कम से कम 2 x 10 के आकार में बोयें⁵ कोशिकाएं/एमएल.
   7. कोशिकाओं को लगभग 5 x 10 पर जमाया जाना चाहिए⁶ कोशिकाएँ/एमएल. सेल फ़्रीज़िंग प्रोटोकॉल का पालन करें।

लिम्फोब्लास्ट को फ्रीज करना

1. 1. कोशिकाओं को लगभग 5 x 10 पर जमाया जाना चाहिए⁶ कोशिकाएं/एमएल.
   2. कोशिकाओं की उचित मात्रा को 15 या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
   3. 4°C पर 100 xg पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
   4. माध्यम को निकालें और ठण्डे हिमीकरण माध्यम की उचित मात्रा में पुनः स्थापित करें।
   5. क्रायोवियल में 1 मिलीलीटर प्रत्येक कोशिका को स्थानांतरित करें।
   6. क्रायोविअल्स को फ्रीजिंग चैंबर में रखें और चैंबर को -80°C फ्रीजर में रात भर के लिए रख दें।
   7. अगले दिन क्रायोविअल्स को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

वेंडी नोरिस