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अमर कोशिका

संस्कृति प्रोटोकॉल

 

अमर सेल कल्चर प्रोटोकॉल

हम पीआरएफ सेल और टिश्यू बैंक को उदारतापूर्वक अमर सेल लाइनें बनाने और प्रदान करने के लिए हार्वर्ड विश्वविद्यालय के डॉ. मार्टिन डोर्फ़ को धन्यवाद देते हैं। धन्यवाद।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीआरएफ सेल लाइनों को अमर कर दिया गया:

रेट्रोवायरस संक्रमण

ए. वायरस उत्पन्न करना: अभिकर्मक से 12-24 घंटे पहले, पैकेजिंग HEK293 कोशिकाओं को 100-60% संगम पर 80-मिमी प्लेट पर चढ़ाया गया था। प्रत्येक प्लेट को 12μg रेट्रोवायरल कंस्ट्रक्ट pBABE-puro (SV40T) और 12μg pCL-Ampho रेट्रोवायरस पैकेजिंग वेक्टर के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। ट्रांसफ़ेक्शन के 8-10 घंटे बाद कल्चर माध्यम को एस्पिरेट किया गया और 10 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम से बदल दिया गया। इष्टतम वायरल टिटर प्राप्त करने के लिए संस्कृति को अतिरिक्त 48-72 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था।

बी. लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करना: संक्रमण से 100-12 घंटे पहले लक्ष्य कोशिकाओं को 18 मिमी प्लेट पर चढ़ाया गया था। पैकेजिंग कोशिकाओं से माध्यम एकत्र किया गया और 0.45-μm सेलूलोज़ एसीटेट या पॉलीसल्फ़ोनिक फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया। एक बार जब कोशिकाएं 40-60% मिश्रित हो गईं, तो 8 μg/ml पॉलीब्रिन की अंतिम सांद्रता के साथ 10 मिलीलीटर वायरस युक्त माध्यम जोड़ा गया। संक्रमण के तीन दौर क्रमिक रूप से, ~12 घंटे के अंतराल पर किए गए। 24 घंटे ऊष्मायन के बाद माध्यम को बदल दिया गया।

C. स्थिर सेल लाइनों का चयन: संक्रमण के 72 घंटे बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ किया गया, 1:3 पर विभाजित किया गया और 100 μg/ml पौरोमाइसिन की उपस्थिति में दो 3 मिमी प्लेटों में स्थानांतरित किया गया, साथ ही एंटीबायोटिक के बिना एक नियंत्रण प्लेट भी। स्थिर कोशिका रेखाएं बनाने के लिए कल्चर मीडियम को लगभग 2 से 3 सप्ताह तक हर 2 या 4 दिन में बदला जाता था।

 

ग्रोथ मीडिया

डीएमईएम- इनविट्रोजन #11960-044 (एल-ग्लूटामाइन के बिना उच्च ग्लूकोज)

15% एफबीएस भ्रूण बोवाइन सीरम

1% (1x) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (इंविट्रोजन#15140-122)

1% (1एक्स) एल-ग्लूटामाइन (इंविट्रोजन#25030-081)

0.75 माइक्रोग्राम/मिली पौरोमाइसिन (इनविवोजेन #एंट-पीआर-1)

क्लोम - रस

ट्रिप्सिन ईडीटीए सी .25% (इंविट्रोजन#25200-056)

हैंक का संतुलित नमक समाधान

एचबीएसएस- (इंविट्रोजन#14170 (1एक्स) (-) कैल्शियम क्लोराइड, (-)मैग्नीशियम क्लोराइड, (-) मैग्नीशियम सल्फेट)

जमने के लिए डीएमएसओ

सेल कल्चर ग्रेड डीएमएसओ

कोशिकाएँ लगभग 5 x 10 की सांद्रता पर सूखी बर्फ पर जमी हुई पहुँचेंगी5कोशिकाएं/शीशी

फ़ाइब्रोब्लास्ट को पिघलाने के लिए प्रोटोकॉल

  1. 37°C पानी के स्नान में कोशिकाओं को तेजी से पिघलाएं।
  2. शीशी के बाहरी हिस्से को 70% इथेनॉल से पोंछें।
  3. पिघली हुई कोशिकाओं को एक टी25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें पौरोमाइसिन के बिना 5 मिलीलीटर ग्रोथ मीडिया हो।
  4. फ्लास्क को रात भर 37°C इनक्यूबेटर में रखें।
  5. अगले दिन, माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करके सुनिश्चित करें कि कोशिकाएँ जुड़ गई हैं।
  6. मीडिया हटाएं और नए विकास मीडिया से बदलें।

पीआरएफ सेल लाइनों का उपसंस्कृति

1) जब कोशिकाएं स्थापित और विकसित हो जाएं, तो 0.75 μg/ml पौरोमाइसिन युक्त मीडिया का उपयोग करना शुरू करें। 0.75 μg/ml पौरोमाइसिन युक्त मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखना जारी रखें।

2) संगम होने पर कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए।

3) कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए (दी गई मात्राएं मान रही हैं कि कोशिकाएं T25 में हैं):

ए. बाँझ तकनीक का उपयोग करके, मीडिया को हटा दें और फ्लास्क को 2-3 मिलीलीटर बाँझ एचबीएसएस से धो लें। HBSS को हटाएँ और त्यागें।

बी. 1 मिलीलीटर ट्रिप्सिन डालें और 2-3 मिनट तक सेते रहें। यह निर्धारित करने के लिए कि कोशिकाओं ने गोल होना, उठना और तैरना शुरू कर दिया है, उन्हें उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे जांचना चाहिए। यदि 3 मिनट के बाद कोशिकाएं अलग नहीं होती हैं, तो आप 1-2 मिनट और इनक्यूबेट कर सकते हैं

सी. टोपी को कस लें और सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क को धीरे से एक तरफ से दूसरी तरफ झुकाएं। यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं को ढीला करने के लिए फ्लास्क को किनारे से हल्के से थपथपाया जा सकता है।

डी. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए जैसे ही कोशिकाएं तैरने लगें, फ्लास्क में 4 मिलीलीटर नया मीडिया डालें। प्लास्टिक से सभी कोशिकाओं को हटाकर घोल में डालने के लिए फ्लास्क के किनारों को नए मीडिया से कई बार धोएं। सभी तरल युक्त कोशिकाओं को हटा दें और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार (या यदि आप 50 या अधिक फ्लास्क एकत्र कर रहे हैं तो 3 मिलीलीटर) में स्थानांतरित करें।

ई. बाँझ तकनीक का उपयोग करके, हेमासाइटोमीटर पर गिनती के लिए एक एलिकोट हटा दें।

एफ. जब आप कोशिकाओं की गिनती कर रहे हों, तो शेष घोल को 5 आरपीएम पर 1000 मिनट के लिए क्लिनिकल सेंट्रीफ्यूज में घुमाया जाना चाहिए।

4) अपनी कोशिका गणना की गणना करने के बाद, प्लेट कोशिकाओं को 2.5 x 10 पर रखें5 प्रति टी 25 फिल्टर शीर्ष फ्लास्क कोशिकाएं।

5) कोशिकाओं को हर 2-3 दिन में 0.75 μg/ml पौरोमाइसिन युक्त ताजा विकास माध्यम खिलाया जाना चाहिए।

जमना:

कोशिकाओं को कम से कम 5x10 पर जमाया जाना चाहिए5 कोशिकाएं /एमएल/क्रायोवियल विकास मीडिया में 10% डीएमएसओ और 30% एफबीएस युक्त पौरोमाइसिन के बिना और बाद में रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर एक आइसोप्रोपेनॉल फ्रीजिंग कक्ष में रखा गया। अगले दिन तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

आगे की जानकारी के लिए कृपया संपर्क करें:

लेस्ली बी। गॉर्डन, एमडी, पीएचडी

ब्राउन यूनिवर्सिटी और बाल रोग विभाग के बाल रोग अनुसंधान वॉरेन अल्परट मेडिकल स्कूल के प्रोफेसर, हैस्ब्रो चिल्ड्रेन हॉस्पिटल, प्रोविडेंस, आरआई डिपार्टमेंट ऑफ एनेस्थीसिया, चिल्ड्रन हॉस्पिटल बोस्टन और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए मेडिकल निदेशक, प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन

फोन: 978-535-2594
फैक्स: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

वेंडी नॉरिस
PRF सेल और ऊतक बैंक
फ़ोन: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org

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