पीआरएफ सेल लाइनों को पिघलाना

1. 37˚C पानी के स्नान में कोशिकाओं को तेजी से पिघलाएं।
2. शीशी के बाहरी हिस्से को 70% इथेनॉल से पोंछें।
3. पिघली हुई कोशिकाओं को 25 मिलीलीटर ग्रोथ मीडिया वाले टी5 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
4. फ्लास्क को रात भर 37˚C इनक्यूबेटर में रखें।
5. अगले दिन, माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करके सुनिश्चित करें कि कोशिकाएँ जुड़ गई हैं।
6. मीडिया हटाएं और नए विकास मीडिया से बदलें।

पीआरएफ सेल लाइनों का उपसंस्कृति

1. संगम होने पर कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए।
2. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए (दी गई मात्राएँ मान रही हैं कि कोशिकाएँ T25 में हैं):
   ए) स्टेराइल तकनीक का उपयोग करके, मीडिया को हटा दें और फ्लास्क को 2-3 मिलीलीटर स्टेराइल एचबीएसएस से धो लें। HBSS को हटाएँ और त्यागें।
   ख) 1 मिलीलीटर ट्रिप्सिन डालें और 2-3 मिनट तक सेते रहें। यह निर्धारित करने के लिए कि कोशिकाओं ने गोल होना, उठना और तैरना शुरू कर दिया है, उन्हें उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे जांचना चाहिए। यदि 3 मिनट के बाद कोशिकाएं अलग नहीं होती हैं, तो आप 1-2 मिनट और इनक्यूबेट कर सकते हैं।
   ग) टोपी को कस लें और सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क को धीरे से एक तरफ से दूसरी तरफ झुकाएं। यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं को ढीला करने के लिए फ्लास्क को किनारे से हल्के से थपथपाया जा सकता है।
   घ) ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए जैसे ही कोशिकाएं तैरने लगें, फ्लास्क में 4 मिलीलीटर नया मीडिया डालें। प्लास्टिक से सभी कोशिकाओं को हटाकर घोल में डालने के लिए फ्लास्क के किनारों को नए मीडिया से कई बार धोएं। सभी तरल युक्त कोशिकाओं को हटा दें और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार (या यदि आप 50 या अधिक फ्लास्क एकत्र कर रहे हैं तो 3 मिलीलीटर) में स्थानांतरित करें।
   ई) बाँझ तकनीक का उपयोग करके, हेमोसाइटोमीटर पर गिनती के लिए एक एलिकोट हटा दें।
   च) जब आप कोशिकाओं की गिनती कर रहे हों, तो शेष घोल को 5 आरपीएम पर 1000 मिनट के लिए क्लिनिकल सेंट्रीफ्यूज में घुमाया जाना चाहिए।
3. अपनी कोशिका गणना की गणना करने के बाद, कोशिकाओं को 2.5 x 10 पर प्लेट करें⁵ प्रति T25 फ़िल्टर शीर्ष फ्लास्क में कोशिकाएँ।
4. कोशिकाओं को हर 2-3 दिन में ताजा विकास माध्यम से भोजन देना चाहिए।

जमना:

कोशिकाओं को कम से कम 5 x 10 पर जमाया जाना चाहिए⁵ 10% डीएमएसओ और 30% एफबीएस युक्त ग्रोथ मीडिया में कोशिकाएं/एमएल/क्रायोवियल और बाद में रात भर -80˚C पर एक आइसोप्रोपेनॉल फ्रीजिंग कक्ष में रखा जाता है। अगले दिन तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

सबकल्चरिंग और फ़्रीज़िंग फ़ाइब्रोब्लास्ट के लिए प्रोटोकॉल