1. गैर-वैज्ञानिक के लिए आईपीएससी पृष्ठभूमि की जानकारी

स्टेम कोशिकाएँ "अपरिपक्व" कोशिकाएँ हैं जो अभी तक किसी एक कोशिका प्रकार बनने के लिए प्रतिबद्ध नहीं हैं। वे लचीले होते हैं क्योंकि उनमें शरीर में कई अलग-अलग प्रकार की परिपक्व कोशिकाओं में विकसित होने की क्षमता होती है, जैसे कोशिकाएं जो हृदय या रक्त वाहिकाओं और अन्य ऊतकों और अंगों को बनाती हैं। 2007 में, शोधकर्ताओं ने परिपक्व वयस्क कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करके प्रयोगशाला में स्टेम सेल बनाने की एक रणनीति की खोज की, जिन्हें हम आमतौर पर अनुसंधान उद्देश्यों के लिए विकसित करते हैं।^{1, 2} . कृत्रिम रूप से निर्मित इन स्टेम कोशिकाओं को प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल ("आईपीएससी") कहा जाता है। प्रोजेरिया के क्षेत्र के लिए यह एक बड़ी सफलता है। पहली बार, वैज्ञानिक अब प्रोजेरिया स्टेम कोशिकाएँ बना सकते हैं और प्रोजेरिया में स्टेम कोशिकाएँ कैसे कार्य करती हैं और विकसित होती हैं, इसके बारे में प्रश्न पूछ सकते हैं। पहले मानव प्रोजेरिया स्टेम कोशिकाओं का कोई स्रोत नहीं था, और इसलिए प्रोजेरिया रहित लोगों की स्टेम कोशिकाओं की तुलना में प्रोजेरिया स्टेम कोशिकाएं कैसे कार्य करती हैं, इसके बारे में जानकारी का अभाव था। इसके अलावा, वैज्ञानिक पहली बार परिपक्व प्रोजेरिया रक्त वाहिकाओं, हृदय कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं को बनाने के लिए प्रोजेरिया स्टेम कोशिकाओं को फिर से प्रोग्राम कर सकते हैं। अब तक, मानव प्रोजेरिया हृदय या रक्त वाहिका कोशिकाओं का कोई स्रोत नहीं था।  अब हम कुंजी पूछ सकते हैं हृदय रोग के बारे में प्रश्न जिसके कारण प्रोजेरिया में दिल के दौरे और स्ट्रोक से जल्दी मृत्यु हो जाती है। हम इन खोजों की तुलना सामान्य आबादी में हृदय रोग और उम्र बढ़ने से कर सकते हैं और इस बारे में और अधिक खोज कर सकते हैं कि हम सभी में उम्र बढ़ने का क्या प्रभाव पड़ता है। प्रोजेरिया स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके पहले से ही कई उत्कृष्ट अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं।^3-5  प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन में हमारा लक्ष्य इस अमूल्य उपकरण का उपयोग करके कई और खोजों को सुविधाजनक बनाना है। स्टेम कोशिकाओं पर प्राइमर के लिए, कृपया यह अमेरिकी सरकार की वेबसाइट देखें: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन द्वारा प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) उत्पादन और वितरण का उद्देश्य

प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन का मिशन हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम और इसके उम्र बढ़ने से संबंधित विकारों के उपचार और इलाज की खोज करना है। 2009 में, पीआरएफ ने उच्च गुणवत्ता वाले प्रोजेरिया आईपीएससी उत्पन्न करने के लिए विलियम स्टैनफोर्ड, पीएचडी के निर्देशन में कनाडा के टोरंटो विश्वविद्यालय में वैज्ञानिकों की एक विशेषज्ञ टीम के साथ सहयोग किया। डॉ. स्टैनफोर्ड इंटीग्रेटिव स्टेम सेल बायोलॉजी में कनाडा रिसर्च चेयर हैं। 2011 तक, पीआरएफ ने कनाडा के ओटावा विश्वविद्यालय में डॉ. स्टैनफोर्ड के साथ सहयोग करना जारी रखा, जहां वह सेलुलर और आणविक चिकित्सा के प्रोफेसर, मेडिसिन संकाय और ओटावा अस्पताल अनुसंधान संस्थान के स्प्रोट सेंटर फॉर स्टेम सेल रिसर्च में वरिष्ठ वैज्ञानिक हैं।

हमारा लक्ष्य दुनिया भर के शोधकर्ताओं को यह अमूल्य उपकरण प्रदान करना है। इस नए अनुसंधान उपकरण का उपयोग प्रोजेरिया के साथ-साथ हृदय रोग और उम्र बढ़ने के संबंध में नए और नवीन अनुसंधान उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा।  

3. हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम प्रेरित-प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का निर्माण

प्रेरित-प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को चार मानव कारकों, ऑक्ट4, एसओएक्स2, केएलएफ4 और सी-माइसी के फ़ाइब्रोब्लास्ट में वीएसवीजी-छद्म रूपित रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। आईपीएससी कालोनियों को माउस-भ्रूण फ़ाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) पर प्राप्त किया गया था। उपयोग की गई प्रक्रिया अनिवार्य रूप से पहले वर्णित के अनुसार थी लेकिन ईओएस रिपोर्टर (नेचर प्रोटोकॉल 4: 1828-1844, 2009) के उपयोग के बिना। 

4. गुणवत्ता नियंत्रण: सत्यापन और लक्षण वर्णन

जो पंक्तियाँ वर्तमान में उपलब्ध हैं वे कई सत्यापन चरणों से गुज़री हैं (नीचे डाउनलोड करने योग्य पीडीएफ देखें):

5. मूल प्रारंभिक सामग्री जिससे ये आईपीएस सेल प्राप्त किए गए थे

आईपीएससी को पीआरएफ सेल और टिश्यू बैंक गैर-रूपांतरित फ़ाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों से प्राप्त किया गया था।

सभी आईपीएस लाइनों के लिए उपयोग की जाने वाली ट्रांसडक्शन विधि रेट्रोवायरस एमकेओएस थी।

आईपीएससी लाइन आईडी	उत्परिवर्तन	लिंग और दान की आयु	मूल कोशिका प्रकार यहां क्लिक करें.	सहायक डेटा
एचजीएडीएफएन003 आईपीएस 1बी	एलएमएनएएक्सॉन 11, 1824 सी>टी	पुरुष 2वर्ष 0माह	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट HGADFN003	003 आईपीएस1बी
HGADFN003 आईपीएस 1सी	एलएमएनए एक्सॉन 11, 1824 सी>टी	पुरुष 2वर्ष 0माह	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट HGADFN003	003 आईपीएस1सी
एचजीडीएफएन003 आईपीएस 1डी	एलएमएनए एक्सॉन 11, 1824 सी>टी	पुरुष 2वर्ष 0माह	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट HGADFN003	003 आईपीएस1डी
एचजीएडीएफएन167 आईपीएस 1जे	एलएमएनए एक्सॉन 11, 1824 सी>टी	पुरुष 8वर्ष 5माह	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट्स HGADFN167	167 पीएस 1 जे
एचजीएडीएफएन167 आईपीएस 1क्यू	एलएमएनए एक्सॉन 11, 1824 सी>टी	पुरुष 8वर्ष 5माह	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट्स HGADFN167	167 आईपीएस1क्यू
एचजीएमडीएफएन090 आईपीएस 1बी	HGADFN167 की माँ (अप्रभावित)	महिला 37 वर्ष 10 माह	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट HGMDFN090	090 आईपीएस1बी
एचजीएमडीएफएन090 आईपीएस 1सी	HGADFN167 की माँ (अप्रभावित)	महिला 37 वर्ष 10 माह	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट HGMDFN090	090 आईपीएस1सी
एचजीएफडीएफएन168 आईपीएस1 डी2	HGADFN167 के जनक (अप्रभावित)	पुरुष 40 वर्ष 5mo	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट्स HGFDFN168	168 आईपीएस1 डी2
HGFDFN168 iPS1P	HGADFN167 के जनक (अप्रभावित)	पुरुष 40 वर्ष 5mo	त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट HGFDFN168	168 आईपीएस1पी

6. भविष्य के आईपीएससी अपडेट और नई सेल लाइनों के लिए हमारी ईमेल सूची में शामिल हों

हम IPSC लाइनें बनाना जारी रख रहे हैं। यदि आप पीआरएफ सेल और टिश्यू बैंक में आयोजित आईपीएससी पर समय-समय पर अपडेट चाहते हैं, तो कृपया क्लिक करके हमारी ईमेल सूची में शामिल हों यहाँ उत्पन्न करें

7. प्रश्न?

कृपया किसी भी प्रश्न या आवश्यकता के लिए लेस्ली गॉर्डन, एमडी, पीएचडी, चिकित्सा निदेशक से संपर्क करें lgordon@progeriaresearch.org या 978-535-2594

8. आईपीएस सेल लाइनों को ऑर्डर करना

2014 में, पीआरएफ ने हमारे एमटीए में कोई बदलाव नहीं करने की नीति बनाई। यह 12 देशों के संस्थानों में काम करने वाली 70 अनुसंधान टीमों के साथ 14 वर्षों की संविदात्मक व्यवस्था का परिणाम है। पीआरएफ और उसके वकील ने उस समय अवधि में उत्पन्न हुए मुद्दों पर विचार किया है और तदनुसार समझौते को संपादित किया है, जिसके परिणामस्वरूप हमें लगता है कि ये निष्पक्ष और उचित शर्तें हैं।

अमेरिकी संघीय सरकारी संस्थानों या प्रश्नों के लिए, कृपया वेंडी नॉरिस से यहां संपर्क करें: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

चरण 1: एक आवेदन और सामग्री हस्तांतरण अनुबंध पूरा करें

गैर-सरकारी संस्थानों के लिए आवेदन और समझौता

गैर-सरकारी संस्थानों के लिए सामग्री अंतरण समझौता

चरण १: पूर्ण किए गए आवेदन और सामग्री हस्तांतरण समझौते को वेंडी नॉरिस को यहां लौटाएं wnorris@lifespan.org. एक बार स्वीकृत होने पर, आपको अपने ऑर्डर और प्रत्याशित शिपिंग तिथि की पुष्टि करने वाला एक ईमेल प्राप्त होगा। 

चरण १: डॉ. स्टैनफोर्ड की प्रयोगशाला वर्तमान में जमे हुए क्रायोवियल में लाइनें वितरित कर रही है। जब संस्कृति को भेज दिया जाएगा तो उसकी प्रयोगशाला आपको शिपिंग और ट्रैकिंग जानकारी के साथ ईमेल करेगी। अनुभवहीन शोधकर्ताओं को मानव भ्रूण स्टेम सेल/आईपीएससी कार्य के लिए आवश्यक विशेष पाठ्यक्रमों में प्रशिक्षण प्राप्त करने के लिए निर्देशित किया जाता है।

ओटावा अस्पताल अनुसंधान संस्थान में ह्यूमन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल सुविधा (डॉ. स्टैनफोर्ड द्वारा निर्देशित) प्रोजेरिया आईपीएससी सेल लाइनों के लिए विशिष्ट आईपीएससी संस्कृति तकनीकों की बुनियादी बातों पर आभासी एक-पर-एक प्रशिक्षण प्रदान करती है। वैज्ञानिकों के अनुभव के स्तर के आधार पर प्रशिक्षण विकल्प और प्रारूप लचीले होते हैं।  अधिक जानकारी के लिए कृपया hpscf@ohri.ca पर ईमेल करें.

चरण 4: ओटावा विश्वविद्यालय आपको प्रत्येक आईपीएससी लाइन और कूरियर लागत, यदि कोई हो, के लिए सीधे चालान करेगा।

9. एचजीपीएस और नियंत्रण आईपीएस सेल कल्चर मीडिया तैयारी

आईपीएससी और ईएससी को स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज (कैट# 5825) से एमटीईएसआर प्लस खिलाने की जरूरत है। कृपया भंडारण के लिए आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों का पालन करें।

10. मैट्रीगेल प्लेट्स तैयार करना

नोट: मैट्रीगेल से जुड़े सभी कदम यथाशीघ्र किए जाने चाहिए और यथासंभव ठंडे रहने चाहिए।

1. 4 बजे मैट्रीगेल बोतल को पिघलाएं°सी. प्रोटीन सांद्रता का पता लगाने के लिए उस लॉट के विश्लेषण प्रमाणपत्र की जाँच करें।
2. पिघली हुई मैट्रीगेल में 12mg/mL की अंतिम सांद्रता तक पहुंचने के लिए पर्याप्त ठंडा DMEM/F5 मीडिया मिलाएं।
3. चरण 1 से तैयार मैट्रीगेल के 2 एमएल एलिकोट्स को पहले से ठंडा 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में बनाएं।
4. -20 पर सभी एलिकोट्स को फ्रीज और स्टोर करें°C.
5. मैट्रीगेल प्लेट बनाने के लिए, -1 में से मैट्रीगेल (20एमएल) का एक एलिकोट हटा दें°सी और 10 एमएल ठंडा डीएमईएम/एफ12 मिलाएं। गोली के पिघलने तक अच्छी तरह मिलाएँ (बिना बुलबुले बनाए, और घोल को हमेशा ठंडा रखें)।
6. 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर 20 एमएल ठंडा डीएमईएम/एफ12 डालें (1 एमएल मैट्रीगेल एलिकोट को 30 एमएल डीएमईएम/एफ12 में पतला किया जाता है), अच्छी तरह मिलाएं।
7. प्लेट (1 वेल प्लेट के लिए 6 एमएल/वेल, 0.5 वेल प्लेट के लिए 12 एमएल/वेल, 0.25 वेल प्लेट के लिए 24 एमएल/वेल)। प्लेट को धीरे से हिलाकर सुनिश्चित करें कि घोल पूरे सतह क्षेत्र को कवर कर रहा है। किसी भी बचे हुए मैट्रीगेल को दोबारा जमा न करें।
8. यदि प्लेट का तुरंत उपयोग कर रहे हैं, तो प्लेट को कमरे के तापमान पर 1 घंटे (या 30 पर 37 मिनट) के लिए छोड़ दें°सी), माइक्रोस्कोप के नीचे मैट्रीगेल का निरीक्षण करें। मैट्रीगेल को अच्छी तरह से फैलाया जाना चाहिए और "गुच्छेदार" नहीं होना चाहिए।
9. यदि किसी अन्य समय प्लेट का उपयोग कर रहे हैं, तो प्लेट के किनारे को पैराफिल्म से लपेटें और 4 पर स्टोर करें°2 सप्ताह तक के लिए सी.

मैट्रिगेल - बीडी/फिशर, बिल्ली#सीबी-40230

डीएमईएम/एफ12 - लाइफ टेक्नोलॉजीज, बिल्ली#11330-057

डॉ. विलियम स्टैनफोर्ड-2022

11. ईएस या आईपीएस कोशिकाओं को पिघलाना (प्रति क्रायो-शीशी)

1. 4°C से एक मैट्रीगेल प्लेट लें और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए गर्म करें, या एक ताजा मैट्रीगेल प्लेट बनाएं (मैट्रीगेल प्लेट प्रोटोकॉल तैयार करना देखें)।
2. 4 एमएल फाल्कन ट्यूब में 15 एमएल एमटीईएसआर प्लस गर्म करें।
3. तरल नाइट्रोजन टैंक से कोशिकाओं को निकालें और 37°C स्नान में तब तक घुमाएँ जब तक केवल एक छोटा बर्फ का टुकड़ा न रह जाए। शीशी 1-2 मिनिट में पिघल जानी चाहिए. यह कदम शीघ्रता से उठाया जाना चाहिए.
4. इथेनॉल सेल ट्यूब और फाल्कन मीडिया ट्यूब और हुड में रखें।
5. 1 एमएल का प्रयोग करें धीरे-धीरे चौड़े मुँह की नोक पूर्व-गर्म मीडिया के 4 एमएल में सेल जोड़ें (सेल सस्पेंशन को मिलाने से बचें)।
6. 130 मिनट के लिए 5 आरसीएफ पर स्पिन करें।
7. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
8. 2एमएल पीएससी मीडिया जोड़ें, और चौड़े मुंह की नोक के साथ गुच्छों को धीरे से तोड़ें. मीडिया को 6 वेल प्लेट के एक वेल में स्थानांतरित करें और 2uL ROCK अवरोधक (Y27632, 10uM की अंतिम सांद्रता) जोड़ें। एक मैट्रीगेल लेपित कुएं में प्लेट (6 अच्छी प्लेट में से)।
9. कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए कोशिकाओं को धीरे से रॉक करें, और एक हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर (5%O.) में रखें₂, 10% CO₂). बीज बोने के 24 घंटे बाद तक प्लेट में गड़बड़ी से बचें।

   नोट: गुच्छों के अत्यधिक टूटने या आक्रामक पिपेटिंग से बचना बहुत महत्वपूर्ण है। इससे जीवित रहने की दर में काफी कमी आ सकती है। बीजारोपण के समय कोशिकाएँ 100-300 कोशिकाओं के बड़े टुकड़ों में रहनी चाहिए। सौम्य रहते हुए, कोशिकाओं के पिघलने के बाद क्रायोप्रोटेक्टेंट के संपर्क में आने के समय को कम करने के लिए तेजी से काम करने का प्रयास करें

10. 24 घंटे के बाद मीडिया निकालें और 2 एमएल पीएससी मीडिया (6 वेल के लिए, 1 वेल के लिए 12 एमएल और 0.5 वेल प्लेट के लिए 24 एमएल) डालें। एचईएससी/आईपीएससी प्रोटोकॉल के लिए कटाई और देखभाल देखें।

पीएससी मीडिया

स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज से एमटीईएसआर प्लस (कैट# 5825)। कृपया भंडारण के लिए आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों का पालन करें।

रॉक इनहिबिटर Y27632 क्या है?

ROCK अवरोध करनेवाला Y27632 Rho संबद्ध काइनेज p160 ROCK का एक चयनात्मक अवरोधक है। रॉक इनहिबिटर Y27632 के साथ उपचार मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (IPSC) के पृथक्करण प्रेरित एपोप्टोसिस को रोकता है, जिससे जीवित रहने की दर में वृद्धि होती है और hESCs और hiPSCs के उपसंवर्धन और विगलन के दौरान प्लुरिपोटेंसी बनाए रखा जाता है। रॉक इनहिबिटर Y27632 को क्रायोप्रिजर्वेशन के दौरान स्टेम कोशिकाओं की जीवित रहने की दर को बढ़ाने में भी मददगार पाया गया है। ध्यान दें कि रॉक इनहिबिटर एलिकोट्स प्रकाश और दोहराव वाले फ्रीज पिघलना चक्रों के प्रति संवेदनशील होते हैं। आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित शेल्फ जीवन के भीतर इन अंशों का उपयोग करना सुनिश्चित करें।

डॉ. विलियम स्टैनफोर्ड-2022

12. एचईएससी/आईपीएससी के लिए कटाई और देखभाल

1. कोशिकाओं के पिघलने के अगले दिन जीवित रहने की दर निर्धारित करने के लिए उन्हें माइक्रोस्कोप के नीचे देखें। ध्यान दें: बड़ी संख्या में अनासक्त कोशिकाओं का दिखना सामान्य है। जब तक कुछ कोशिकाएँ जुड़ी रहती हैं, 3-7 दिनों के भीतर उनमें कॉलोनियाँ उत्पन्न हो सकती हैं।
2. कुओं से मीडिया निकालें और प्रति कुआं 2 एमएल (6 कुओं के लिए, 1 कुओं के लिए 12 एमएल और 0.5 कुओं की प्लेट के लिए 24 एमएल) ताजा और गर्म पीएससी मीडिया पिपेट करें। प्लेट को इनक्यूबेटर में लौटाएँ।
3. कोशिकाओं को 60-70% संगम तक खिलाया जाता है (आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों का पालन करें)।
4. दूसरे दिन से, कोशिकाओं का निरीक्षण किया जाना चाहिए और बढ़ने वाली किसी भी विभेदित कोशिकाओं को साफ किया जाना चाहिए।
5. कोशिकाओं को साफ करने के लिए, पिकिंग हुड का उपयोग करें और एक पिपेट टिप के साथ विभेदित कोशिकाओं को खुरच कर हटा दें।
6. एक बार कोशिकाएं साफ़ हो जाएं, तो उपरोक्त चरणों के अनुसार मीडिया बदलें।

(फ्रीजिंग एचईएससी/आईपीएससी या पासिंग एचईएससी/आईपीएससी देखें)

नोट:

पीएससी मीडिया हाइपोक्सिक वातावरण में अधिक कुशल होने के लिए दृढ़ संकल्पित था। हमने यह भी देखा है कि जब कोशिकाओं को हाइपोक्सिक इनक्यूबेटरों बनाम नॉर्मोक्सिक में उगाया जाता है तो कम भेदभाव होता है। अंत में, हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर का उपयोग करने पर बीजित कोशिकाओं की जीवित रहने की दर बेहतर होती है।

नॉर्मोक्सिक: 37°सी, 21% ओ₂, 5% CO₂

हाइपोक्सिक: 37°सी, 5%ओ₂, 10% CO₂

डॉ. विलियम स्टैनफोर्ड-2022

13. एचईएससी/आईपीएससी उत्तीर्ण करना

1. 2 अच्छी तरह से मैट्रीगेल लेपित प्लेट में 6 एमएल पीएससी मीडिया डालें और एक तरफ रख दें।
2. प्लेट को पास करने के लिए लें और मीडिया को कुएं से हटा दें और 1 एमएल पीबीएस (-/-) से एक बार धो लें।
3. कुएं में 1 एमएल ईडीटीए घोल डालें और कमरे के तापमान पर 3-4 मिनट के लिए छोड़ दें। प्लेट को इधर-उधर न हिलाएं क्योंकि कोशिकाएं अलग होना शुरू हो सकती हैं।
4. EDTA समाधान निकालें और 1mL PSC मीडिया जोड़ें। ईडीटीए को कोशिकाओं पर 4 मिनट से अधिक समय तक न छोड़ें क्योंकि इससे कोशिकाएं ऊपर उठ जाएंगी।
5. सेल स्क्रेपर का उपयोग करके कोशिकाओं को स्क्रैप करें और पीएससी मीडिया वाले अपनी प्लेट के 6 कुओं के बीच कोशिकाओं को विभाजित करें। कॉलोनी के टुकड़ों को अत्यधिक तोड़ने से बचें और खुरचने में सावधानी बरतने का प्रयास करें। कोशिकाओं को बड़े टुकड़ों में रखने का प्रयास करें। यदि आवश्यक हो तो गुच्छों को तोड़ने के लिए चौड़े मुंह वाली पिपेट टिप का उपयोग करें। कोशिकाओं के अत्यधिक टूटने से कोशिका मृत्यु या पारित होने के बाद अत्यधिक सहज विभेदन हो सकता है।
6. 37 पर सेते हैं°सी प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के बाद (8 अंक या एल आकार मिलाते हुए)। पासिंग के 24 घंटे बाद तक प्लेट में गड़बड़ी से बचें।

ध्यान दें: एक बार कोशिकाएं स्क्रैप हो जाने के बाद आप उन्हें जल्द से जल्द नई प्लेट में स्थानांतरित करना चाहते हैं क्योंकि कोशिकाएं जल्दी (5 मिनट के भीतर) फिर से जुड़ जाएंगी।

यदि EDTA को कोशिकाओं पर 4 मिनट से अधिक समय के लिए छोड़ दिया जाता है, तो कोशिकाएं अलग होना शुरू हो सकती हैं। यदि ऐसा होता है, तो बस कोशिकाओं को 15 एमएल पीएससी मीडिया के साथ 4 एमएल फाल्कन में एकत्र करें। 130 मिनट के लिए 5 आरसीएफ पर कोशिकाओं को स्पिन करें। 1एमएल मीडिया के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और 6 वेल मैट्रीगेल लेपित प्लेट (160यूएल प्रति वेल) के बीच समान रूप से विभाजित करें।

EDTA समाधान: 500mL 0.5M EDTA (pH 8.0) को 500mL DPBS (-/-) में जोड़ें। 0.9 ग्राम NaCl मिलाएं। कीटाणुरहित करने के लिए घोल को छान लें और 4 महीने तक 6°C पर संग्रहित करें।

कागज से:

रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों में एंजाइम मुक्त पृथक्करण द्वारा मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का मार्ग और कॉलोनी विस्तार

जेनेट बीयर्स,¹ डेनियल आर. गुलब्रैंसन,^2,3 निकोल जॉर्ज,⁴लॉरेन आई. सिनिस्काल्ची,¹ जेफरी जोन्स,^4,5 जेम्स ए. थॉमसन,^2,3,6 और गुओकाई चेन^1,2

14. फ्रीजिंग एचईएससी/आईपीएससी

1. बायो-कूल (नियंत्रित दर फ्रीजर) चालू करें और तापमान को -7°C पर समायोजित करें।
2. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें और माइक्रोस्कोप के तहत संगम और आकारिकी का निरीक्षण करें।
3. यदि कुएँ 70% संगमित हैं, तो पुराने मीडिया को हटा दें और पीबीएस (-/-) से एक बार धो लें, फिर प्रति कुँए में 1 एमएल ईडीटीए घोल (ईडीटीए घोल के साथ पासिंग देखें) डालें।
4. 3-4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
5. EDTA समाधान को एस्पिरेट करें और 1 एमएल ठंडा mFreSR मीडिया (कैट#05855, स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) जोड़ें।
6. कोशिकाओं को धीरे से उठाने के लिए सेल स्क्रेपर का उपयोग करें। जितना संभव हो कोशिकाओं को बड़े टुकड़ों में रखें और ऊपर-नीचे पाइप लगाने से बचें।
7. चौड़े मुंह की नोक का उपयोग करके कोशिकाओं/mFreSR को क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें। चरण 8 के लिए तैयार होने तक शीशियों को बर्फ पर रखें।
8. ट्यूबों को बायो-कूल में रखें और 10 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
9. तरल नाइट्रोजन प्राप्त करें.
10. 10 मिनट के बाद, तरल नाइट्रोजन में एक स्पैटुला डुबोकर और लगभग 10-30 सेकंड के लिए क्रायो-शीशी के किनारे को छूकर कोशिकाओं को बीज दें या जब तक आप क्रायो-शीशी के किनारे पर एक क्रिस्टल का रूप न देख लें।
11. "PROG" बटन दबाकर प्रोग्राम 1 शुरू करें और बटन दोबारा दबाकर प्रोग्राम शुरू करें और आपको 0.5°C/मिनट की दर देखनी चाहिए। , फिर "RUN" दबाएँ।
12. एक बार तापमान -65 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने पर क्रायो-ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित और संग्रहीत किया जा सकता है।

अल्टरनेटिव्स

दूसरा विकल्प क्रायो-ट्यूबों को फ्रीजिंग कंटेनर (बायोसिशन-कूलसेल) में रखना और रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करना है। अगले दिन क्रायो-ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन (तरल या वाष्प चरण) में ले जाएं।

डॉ. विलियम स्टैनफोर्ड-2022