प्रेरित प्लुरिपोटेंट
स्टेम कोशिकाएं
प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन सेल और ऊतक बैंक
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं (iPSC)
- प्रोजेरिया iPSCs गैर-वैज्ञानिकों के लिए पृष्ठभूमि जानकारी
- के उद्देश्य प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन द्वारा प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल उत्पादन और वितरण
- हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम प्रेरित-प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (iPSCs) का उत्पादन
- गुणवत्ता नियंत्रण: सत्यापन और लक्षण वर्णन
- मूल प्रारंभिक सामग्री जिससे iPSCs व्युत्पन्न किए गए थे
- भविष्य के iPSC अपडेट और नई सेल लाइनों के लिए हमारी ईमेल सूची में शामिल हों
- कोई प्रश्न है? हमसे संपर्क करें।
- iPSC लाइन्स का ऑर्डर देना
- एचजीपीएस और नियंत्रण आईपीएससी संस्कृति मीडिया तैयारी
- मैट्रिजेल प्लेट्स तैयार करना
- hESCs और iPSCs कोशिकाओं को पिघलाना (प्रति क्रायो-वायल)
- hESC/iPSC की कटाई और देखभाल
- पासेजिंग एचईएससी/आईपीएससी
- फ्रीजिंग hESC/iPSC
1. iPSC गैर-वैज्ञानिकों के लिए पृष्ठभूमि जानकारी
स्टेम सेल "अपरिपक्व" कोशिकाएं हैं जो अभी तक किसी एक प्रकार की कोशिका बनने के लिए प्रतिबद्ध नहीं हुई हैं। वे लचीली होती हैं क्योंकि उनमें शरीर में कई अलग-अलग प्रकार की परिपक्व कोशिकाओं में विकसित होने की क्षमता होती है, जैसे कि हृदय या रक्त वाहिकाओं और अन्य ऊतकों और अंगों को बनाने वाली कोशिकाएँ। 2007 में, शोधकर्ताओं ने परिपक्व वयस्क कोशिकाओं को पुनः प्रोग्रामिंग करके प्रयोगशाला में स्टेम सेल बनाने की एक रणनीति की खोज की, जिसे हम आमतौर पर शोध उद्देश्यों के लिए विकसित करते हैं।1, 2 कृत्रिम रूप से बनाए गए इन स्टेम सेल को प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल ("iPSCs") कहा जाता है। प्रोजेरिया के क्षेत्र के लिए, यह एक बहुत बड़ी सफलता है। पहली बार, वैज्ञानिक अब प्रोजेरिया स्टेम सेल बना सकते हैं और स्टेम सेल कैसे काम करते हैं और प्रोजेरिया में कैसे विकसित होते हैं, इस बारे में सवाल पूछ सकते हैं। पहले मानव प्रोजेरिया स्टेम सेल का कोई स्रोत नहीं था, और इसलिए इस बारे में जानकारी का अभाव था कि प्रोजेरिया रहित लोगों के स्टेम सेल की तुलना में प्रोजेरिया स्टेम सेल कैसे काम करते हैं। इसके अलावा, वैज्ञानिक पहली बार परिपक्व प्रोजेरिया रक्त वाहिकाओं, हृदय कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं को बनाने के लिए प्रोजेरिया स्टेम कोशिकाओं को फिर से प्रोग्राम कर सकते हैं। अब तक, मानव प्रोजेरिया हृदय या रक्त वाहिका कोशिकाओं का कोई स्रोत नहीं था। अब हम कुंजी पूछ सकते हैं हृदय रोग के बारे में प्रश्न जो प्रोजेरिया में दिल के दौरे और स्ट्रोक से समय से पहले मृत्यु का कारण बनते हैं। हम इन खोजों की तुलना सामान्य आबादी में हृदय रोग और बुढ़ापे से कर सकते हैं और इस बारे में अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं कि हम सभी में बुढ़ापे को किस तरह प्रभावित करता है। प्रोजेरिया स्टेम सेल का उपयोग करके पहले से ही कई उत्कृष्ट अध्ययन प्रकाशित हो चुके हैं।3-5 प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन में हमारा लक्ष्य इस अमूल्य उपकरण का उपयोग करके कई और खोजों को सुगम बनाना है। स्टेम सेल पर एक प्रारंभिक जानकारी के लिए, कृपया इस अमेरिकी सरकार की वेबसाइट देखें: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm
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- ताकाहाशी के, तनाबे के, ओहनुकी एम, नारिता एम, इचिसाका टी, तोमोदा के, यामानाका एस. परिभाषित कारकों द्वारा वयस्क मानव फाइब्रोब्लास्ट से प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का प्रेरण। कक्ष। 2007;131:861-872.
- यू जे, वोडयानिक एमए, स्मुगा-ओटो के, एंटोसिविक्ज़-बॉर्गेट जे, फ्रैन जेएल, तियान एस, नी जे, जोंसडॉटिर जीए, रूओटी वी, स्टीवर्ट आर, स्लुकविन, II, थॉमसन जेए। मानव दैहिक कोशिकाओं से प्राप्त प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनें। विज्ञान। 2007;318:1917-1920.
- लियू जीएच, बरखो बी.जेड., रुइज़ एस., डीप डी., क्यू. जे., यांग एस.एल., पैनोपोलोस ए.डी., सुजुकी के., कुरियन एल., वाल्श सी., थॉम्पसन जे., बौए एस., फंग एच.एल., सांचो-मार्टिनेज आई., झांग के., येट्स जे., 3. इज़पिसुआ बेलमोंटे जे.सी. हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम से आई.पी.एस.सी. के साथ समय से पहले बुढ़ापे की पुनरावृत्ति। प्रकृति। 2011;472:221-225.
- मिस्टेली टी. युगों के लिए एचजीपीएस-व्युत्पन्न आईपीएससी। कोशिका स्टेम सेल. 2011;8:4-6.
2. प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन द्वारा प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (iPSC) उत्पादन और वितरण का उद्देश्य
प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन का मिशन हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम और इसके बुढ़ापे से संबंधित विकारों के लिए उपचार और इलाज की खोज करना है। 2009 में, PRF ने उच्च गुणवत्ता वाले प्रोजेरिया iPSCs बनाने के लिए विलियम स्टैनफोर्ड, पीएचडी के निर्देशन में, टोरंटो विश्वविद्यालय, कनाडा के वैज्ञानिकों की एक विशेषज्ञ टीम के साथ सहयोग किया। डॉ. स्टैनफोर्ड इंटीग्रेटिव स्टेम सेल बायोलॉजी में कनाडा रिसर्च चेयर हैं। 2011 तक, PRF ने कनाडा के ओटावा विश्वविद्यालय में डॉ. स्टैनफोर्ड के साथ सहयोग करना जारी रखा, जहाँ वे सेल्युलर और मॉलिक्यूलर मेडिसिन के प्रोफेसर, मेडिसिन संकाय और ओटावा हॉस्पिटल रिसर्च इंस्टीट्यूट के स्प्रॉट सेंटर फॉर स्टेम सेल रिसर्च में वरिष्ठ वैज्ञानिक हैं।
हमारा लक्ष्य दुनिया भर के शोधकर्ताओं को यह अमूल्य उपकरण प्रदान करना है। इस नए शोध उपकरण का उपयोग प्रोजेरिया के साथ-साथ हृदय रोग और बुढ़ापे के साथ इसके संबंध पर नए और अभिनव शोध करने के लिए किया जाएगा।
3. हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम प्रेरित-प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (iPSCs) का उत्पादन
प्रेरित-प्लूरिपोटेंट स्टेम सेल (iPSCs) को चार मानव कारकों, Oct4, Sox2, Klf4, और c-Myc के VSVG-छद्मरूपी रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके फाइब्रोब्लास्ट में प्राप्त किया गया था। iPSC कॉलोनियों को माउस-भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (MEFs) पर प्राप्त किया गया था। उपयोग की गई प्रक्रिया मूल रूप से पहले वर्णित के अनुसार थी, लेकिन EOS रिपोर्टर (नेचर प्रोटोकॉल 4: 1828-1844, 2009) के उपयोग के बिना।
4. गुणवत्ता नियंत्रण: सत्यापन और लक्षण वर्णन
वर्तमान में उपलब्ध लाइनें कई सत्यापन चरणों से गुजर चुकी हैं (नीचे डाउनलोड करने योग्य पीडीएफ देखें):
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- प्रत्येक लाइन के लिए माइकोप्लाज्मा परीक्षण: डॉ. स्टैनफोर्ड की प्रयोगशाला ने प्रत्येक सेल लाइन के लिए पीसीआर द्वारा माइकोप्लाज्मा विश्लेषण किया है। इसके अलावा, विस्तार के बाद और कोशिकाओं को भेजने से पहले, लाइनों का माइकोप्लाज्मा के लिए फिर से परीक्षण किया जाएगा।
- प्लुरिपोटेंसी मार्कर ट्रा-1-60, ट्रा-1-81, और एसएसईए4 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग।
- क्षारीय फॉस्फेटेस धुंधलापन बहुलता के सूचक के रूप में
- भ्रूण शरीर निर्माण और उसके बाद तीन रोगाणु-परतों के मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग। परीक्षण किए गए मार्कर थे βIII-ट्यूबुलिन (एक्टोडर्म), स्मूथ-मसल एक्टिन (मेसोडर्म), और गाटा4 या एएफपी (एंडोडर्म)
- कैरियोटाइप विश्लेषण.
- विभेदित कोशिकाओं में लेमिन ए की पुनः अभिव्यक्ति
- टेराटोमा परीक्षण
अतिरिक्त सत्यापन प्रक्रिया में:
कुछ लाइनों ने टेराटोमा परीक्षण पूरा कर लिया है जैसा कि सहायक डेटा में दिखाया गया है। अन्य सभी लाइनों के लिए, टेराटोमा परीक्षण प्रक्रिया में हैं और जैसे ही ये परीक्षण पूरे हो जाएँगे, स्थिति अपडेट कर दी जाएगी।
5. मूल प्रारंभिक सामग्री जिससे ये iPS कोशिकाएँ प्राप्त की गईं
iPSCs को PRF सेल और ऊतक बैंक गैर-रूपांतरित फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों से प्राप्त किया गया था।
सभी iPS लाइनों के लिए प्रयुक्त ट्रांसडक्शन विधि रेट्रोवायरस MKOS थी।
iPSC लाइन आईडी | उत्परिवर्तन | लिंग और दानआयु | मूल कोशिका प्रकार यहाँ क्लिक करें. | सहायक डेटा |
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HGADFN003 आईपीएस 1बी | एलएमएनएएक्सॉन 11, 1824 सी>टी | पुरुष 2वर्ष 0माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट एचजीएडीएफएन003 | 003 आईपीएस1बी |
HGADFN003 आईपीएस 1सी | एलएमएनए एक्सॉन 11, 1824 सी>टी | पुरुष 2वर्ष 0माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट एचजीएडीएफएन003 | 003 आईपीएस1सी |
एचजीडीएफएन003 आईपीएस 1डी | एलएमएनए एक्सॉन 11, 1824 सी>टी | पुरुष 2वर्ष 0माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट एचजीएडीएफएन003 | 003 आईपीएस1डी |
एचजीएडीएफएन167 आईपीएस 1जे | एलएमएनए एक्सॉन 11, 1824 सी>टी | पुरुष 8वर्ष 5माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट HGADFN167 | 167 पीएस 1जे |
HGADFN167 आईपीएस 1Q | एलएमएनए एक्सॉन 11, 1824 सी>टी | पुरुष 8वर्ष 5माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट HGADFN167 | 167 आईपीएस1क्यू |
HGMDFN090 आईपीएस 1बी | HGADFN167 की माँ (अप्रभावित) | महिला 37वर्ष 10माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट एचजीएमडीएफएन090 | 090 आईपीएस1बी |
HGMDFN090 आईपीएस 1सी | HGADFN167 की माँ (अप्रभावित) | महिला 37वर्ष 10माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट एचजीएमडीएफएन090 | 090 आईपीएस1सी |
एचजीएफडीएफएन168 आईपीएस1 डी2 | HGADFN167 के पिता (अप्रभावित) | पुरुष 40 वर्ष 5माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट HGFDFN168 | 168 आईपीएस1 डी2 |
एचजीएफडीएफएन168 आईपीएस1पी | HGADFN167 के पिता (अप्रभावित) | पुरुष 40 वर्ष 5माह | त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट एचजीएफडीएफएन168 | 168 आईपीएस1पी |
6. भविष्य के iPSC अपडेट और नई सेल लाइनों के लिए हमारी ईमेल सूची में शामिल हों
हम iPSC लाइनें बनाना जारी रख रहे हैं। यदि आप PRF सेल और ऊतक बैंक में रखे गए iPSC पर समय-समय पर अपडेट चाहते हैं, तो कृपया क्लिक करके हमारी ईमेल सूची में शामिल हों यहाँ
7. कोई प्रश्न?
कृपया किसी भी प्रश्न या आवश्यकता के लिए लेस्ली गॉर्डन, एमडी, पीएचडी, चिकित्सा निदेशक से संपर्क करें, lgordon@progeriaresearch.org या 978-535-2594
8. आईपीएस सेल लाइनों का ऑर्डर करना
2014 में, PRF ने हमारे MTA में कोई बदलाव न करने की नीति बनाई। यह 14 देशों के संस्थानों में काम कर रही 70 शोध टीमों के साथ 12 साल की संविदात्मक व्यवस्था का परिणाम है। PRF और उसके वकील ने उस समय अवधि में उत्पन्न हुए मुद्दों को ध्यान में रखा है और तदनुसार समझौते को संपादित किया है, जिसके परिणामस्वरूप हमें लगता है कि उचित और उचित शर्तें हैं।
अमेरिकी संघीय सरकारी संस्थानों या प्रश्नों के लिए कृपया वेंडी नॉरिस से संपर्क करें: wnorris@brownhealth.org या 401
चरण 1: आवेदन और सामग्री हस्तांतरण समझौता पूरा करें
गैर-सरकारी संस्थाओं के लिए आवेदन और समझौता
गैर-सरकारी संस्थाओं के लिए सामग्री हस्तांतरण समझौता
चरण दो: पूर्ण रूप से भरा हुआ आवेदन पत्र और सामग्री हस्तांतरण समझौता वेंडी नॉरिस को वापस भेजें wnorris@brownhealth.orgएक बार स्वीकृति मिल जाने पर, आपको अपने ऑर्डर और अनुमानित शिपिंग तिथि की पुष्टि करने वाला एक ईमेल प्राप्त होगा।
चरण 3: डॉ. स्टैनफोर्ड की प्रयोगशाला वर्तमान में जमे हुए क्रायोवियल में लाइनें वितरित कर रही है। जब संस्कृति भेज दी जाएगी, तो उनकी प्रयोगशाला आपको शिपिंग और ट्रैकिंग जानकारी के साथ ईमेल करेगी। अनुभवहीन शोधकर्ताओं को मानव भ्रूण स्टेम सेल/iPSCs कार्य के लिए आवश्यक विशेष पाठ्यक्रमों में प्रशिक्षण प्राप्त करने का निर्देश दिया जाता है।
ओटावा हॉस्पिटल रिसर्च इंस्टीट्यूट में ह्यूमन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल फैसिलिटी (डॉ. स्टैनफोर्ड द्वारा निर्देशित) प्रोजेरिया iPSC सेल लाइनों के लिए विशिष्ट iPSC कल्चर तकनीकों की मूल बातों पर वर्चुअल वन-ऑन-वन प्रशिक्षण प्रदान करती है। वैज्ञानिकों के अनुभव के स्तर के आधार पर प्रशिक्षण विकल्प और प्रारूप लचीले होते हैं। अधिक जानकारी के लिए कृपया hpscf@ohri.ca पर ईमेल करें.
चरण 4: ओटावा विश्वविद्यालय आपको प्रत्येक iPSC लाइन के साथ-साथ कूरियर लागत (यदि कोई हो) के लिए सीधे चालान भेजेगा।
9. एचजीपीएस और नियंत्रण आईपीएस सेल कल्चर मीडिया तैयारी
iPSC और ESC को स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज (cat# 5825) से mTeSR प्लस के साथ फीड किया जाना चाहिए। कृपया भंडारण के लिए आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों का पालन करें।
10. मैट्रिजेल प्लेट्स तैयार करना
टिप्पणीमैट्रिजेल से संबंधित सभी चरणों को यथाशीघ्र पूरा किया जाना चाहिए तथा यथासंभव ठंडा रखा जाना चाहिए।
- 4 पर मैट्रिजेल बोतल को पिघलाएं°C. उस लॉट पर प्रोटीन सांद्रता जानने के लिए विश्लेषण प्रमाणपत्र की जांच करें।
- पिघले हुए मैट्रिजेल में पर्याप्त मात्रा में ठंडा DMEM/F12 मीडिया मिलाएं जिससे अंतिम सान्द्रता 5mg/mL हो जाए।
- चरण 2 से तैयार मैट्रिजेल के 1mL अंशों को पूर्व-शीतित 15mL फाल्कन ट्यूबों में बनाएं।
- सभी अंशों को -20 पर स्थिर करें और संग्रहीत करें°सी।
- मैट्रिजेल प्लेट बनाने के लिए, -20 से मैट्रिजेल का एक अंश (1mL) निकालें°सी और 10 एमएल ठंडा डीएमईएम/एफ12 डालें। जब तक गोली पिघल न जाए तब तक अच्छी तरह मिलाएँ (बुलबुले बनाए बिना, और घोल को हमेशा ठंडा रखें)।
- 50mL ट्यूब में डालें, फिर 20mL ठंडा DMEM/F12 डालें (1mL मैट्रिजेल एलिक्वॉट को 30mL DMEM/F12 में पतला करें), अच्छी तरह मिलाएं।
- प्लेट (6 वेल प्लेट के लिए 1mL/वेल, 12 वेल प्लेट के लिए 0.5mL/वेल, 24 वेल प्लेट के लिए 0.25mL/वेल)। प्लेट को धीरे से हिलाकर सुनिश्चित करें कि घोल पूरे सतह क्षेत्र को कवर कर रहा है। बचे हुए मैट्रिजेल को दोबारा फ्रीज न करें।
- यदि प्लेट का तुरंत उपयोग करना है, तो प्लेट को कमरे के तापमान पर 1 घंटे (या 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) तक रखा रहने दें।°सी), माइक्रोस्कोप के नीचे मैट्रिजेल का निरीक्षण करें। मैट्रिजेल अच्छी तरह से फैला हुआ होना चाहिए और “गांठदार” नहीं होना चाहिए।
- यदि किसी अन्य समय प्लेट का उपयोग कर रहे हों, तो प्लेट के किनारे को पैराफिल्म से लपेट दें और 4 डिग्री के तापमान पर रखें।°सी. 2 सप्ताह तक।
मैट्रिजेल – बीडी/फिशर, cat#CB-40230
DMEM/F12 – लाइफ टेक्नोलॉजीज, cat#11330-057
डॉ. विलियम स्टैनफोर्ड-2022
11. ईएस या आईपीएस कोशिकाओं को पिघलाना (प्रति क्रायो-वायल)
- एक मैट्रिजेल प्लेट को 4°C से बाहर निकालें और एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर गर्म करें, या एक ताजा मैट्रिजेल प्लेट बनाएं (मैट्रिजेल प्लेट तैयार करने का प्रोटोकॉल देखें)।
- 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में 4 एमएल mTeSR प्लस को गर्म करें।
- तरल नाइट्रोजन टैंक से कोशिकाओं को निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस के स्नान में तब तक घुमाएँ जब तक कि केवल एक छोटा बर्फ का टुकड़ा न रह जाए। शीशी 1-2 मिनट में पिघल जानी चाहिए। यह कदम जल्दी से किया जाना चाहिए।
- इथेनॉल सेल ट्यूब और फाल्कन मीडिया ट्यूब और हुड में जगह।
- 1mL का उपयोग करें चौड़े मुंह की नोक धीरे धीरे कोशिकाओं को 4mL पूर्व-गर्म मीडिया में मिलाएं (कोशिका निलंबन को मिलाने से बचें)।
- 5 मिनट तक 130 आरसीएफ पर घुमाएं।
- सतह पर तैरनेवाला पदार्थ निकालें.
- 2mL PSC मीडिया डालें, और चौड़े मुंह वाली टिप के साथ गुच्छों को धीरे से तोड़ें. मीडिया को 6 वेल प्लेट के एक वेल में ट्रांसफर करें, 2uL ROCK अवरोधक (Y27632, अंतिम सांद्रता 10uM) डालें। प्लेट को एक मैट्रिजेल कोटेड वेल (6 वेल प्लेट में से) में डालें।
- कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए धीरे से हिलाएं, और एक हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर (5%O) में रखें2, 101टीपी3टी सीओ2) बीज बोने के बाद 24 घंटे तक प्लेट में किसी प्रकार की गड़बड़ी से बचें।
टिप्पणी: गुच्छों को अत्यधिक तोड़ने या आक्रामक पाइपिंग से बचना बहुत महत्वपूर्ण है। इससे जीवित रहने की दर में काफी कमी आ सकती है। बीज बोने के समय कोशिकाएँ 100-300 कोशिकाओं के बड़े टुकड़ों में रहनी चाहिए। कोमल रहते हुए, कोशिकाओं के पिघलने के बाद तेज़ी से काम करने की कोशिश करें ताकि वे क्रायोप्रोटेक्टेंट के संपर्क में कम से कम समय तक रहें।
- 24 घंटे के बाद मीडिया को हटा दें और 2mL PSC मीडिया डालें (6 वेल के लिए, 12 वेल के लिए 1mL और 24 वेल प्लेट के लिए 0.5mL)। hESC/iPSC प्रोटोकॉल के लिए हार्वेस्टिंग और देखभाल देखें।
पीएससी मीडिया
स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज से mTeSR प्लस (cat# 5825)। कृपया भंडारण के लिए आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों का पालन करें।
रॉक अवरोधक Y27632 क्या है?
रॉक इनहिबिटर Y27632 Rho एसोसिएटेड किनेस p160 रॉक का एक चयनात्मक अवरोधक है। रॉक इनहिबिटर Y27632 के साथ उपचार मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (iPSC) के पृथक्करण प्रेरित एपोप्टोसिस को रोकता है, जिससे जीवित रहने की दर में वृद्धि होती है और hESCs और hiPSCs के उपसंस्कृति और विगलन के दौरान प्लुरिपोटेंसी को बनाए रखा जाता है। रॉक इनहिबिटर Y27632 को क्रायोप्रिजर्वेशन के दौरान स्टेम कोशिकाओं की जीवित रहने की दर को बढ़ाने के लिए भी दिखाया गया है। ध्यान दें कि रॉक अवरोधक एलिकोट प्रकाश और दोहरावदार फ्रीज पिघलना चक्रों के प्रति संवेदनशील हैं। आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित शेल्फ लाइफ के भीतर इन एलिकोट का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
डॉ. विलियम स्टैनफोर्ड-2022
12. hESC/ iPSC की कटाई और देखभाल
- कोशिकाओं के पिघलने के अगले दिन उन्हें माइक्रोस्कोप के नीचे देखें ताकि जीवित रहने की दर का पता लगाया जा सके। नोट: बड़ी संख्या में असंलग्न कोशिकाओं का दिखना सामान्य बात है। जब तक कुछ कोशिकाएँ जुड़ी हुई हैं, तब तक 3 - 7 दिनों के भीतर उनसे कॉलोनियाँ बन सकती हैं।
- कुओं से मीडिया निकालें और प्रति कुएँ 2 एमएल (6 कुओं के लिए, 12 कुओं के लिए 1 एमएल और 24 कुओं की प्लेट के लिए 0.5 एमएल) ताज़ा और गर्म पीएससी मीडिया पिपेट करें। प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें।
- कोशिकाओं को 60-70% संलयित होने तक खिलाया जाता है (आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों का पालन करें)।
- दूसरे दिन से ही कोशिकाओं का निरीक्षण किया जाना चाहिए तथा उनमें से किसी भी विभेदित कोशिका को साफ कर देना चाहिए जो बढ़ रही हो।
- कोशिकाओं को साफ करने के लिए, पिकिंग हुड का उपयोग करें और विभेदित कोशिकाओं को पिपेट टिप से खुरच कर हटा दें।
- एक बार कोशिकाएं साफ हो जाएं, तो उपरोक्त चरणों के अनुसार मीडिया बदलें।
(देखें hESC/iPSC को फ्रीज करना या hESC/iPSC को पास करना)
टिप्पणी:
पीएससी मीडिया को हाइपोक्सिक वातावरण में अधिक कुशल पाया गया। हमने यह भी देखा है कि जब कोशिकाओं को हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर में उगाया जाता है, तो नॉर्मोक्सिक की तुलना में कम विभेदन होता है। अंत में, हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर का उपयोग करने पर सीडेड कोशिकाओं की जीवित रहने की दर बेहतर होती है।
नॉर्मोक्सिक: 37°सी, 211टीपी3टी ओ2, 51टीपी3टी सीओ2
हाइपोक्सिक: 37°सी, 51टीपी3टीओ2, 101टीपी3टी सीओ2
डॉ. विलियम स्टैनफोर्ड-2022
13. hESC/iPSC उत्तीर्ण करना
- 6 वेल मैट्रिजेल लेपित प्लेट में 2 एमएल पीएससी मीडिया डालें और एक तरफ रख दें।
- जिस प्लेट से गुजरना है उसे लें और उसमें से मीडिया को निकाल लें तथा उसे 1 एमएल पीबीएस (-/-) से एक बार धो लें।
- वेल में 1mL EDTA घोल डालें और कमरे के तापमान पर 3-4 मिनट के लिए छोड़ दें। प्लेट को इधर-उधर न हिलाएं क्योंकि इससे कोशिकाएँ अलग होने लगेंगी।
- EDTA घोल निकालें और 1mL PSC मीडिया डालें। EDTA को कोशिकाओं पर 4 मिनट से ज़्यादा न रहने दें क्योंकि इससे कोशिकाएँ ऊपर उठ जाएँगी।
- सेल स्क्रैपर का उपयोग करके कोशिकाओं को खुरचें और PSC मीडिया युक्त अपनी प्लेट के 6 कुओं में कोशिकाओं को विभाजित करें। कॉलोनी के टुकड़ों को अत्यधिक तोड़ने से बचें, और खुरचने में सावधानी बरतने की कोशिश करें। कोशिकाओं को बड़े टुकड़ों में रखने की कोशिश करें। यदि आवश्यक हो तो गुच्छों को तोड़ने के लिए चौड़े मुंह वाले पिपेट टिप का उपयोग करें। कोशिकाओं के अत्यधिक टूटने से कोशिका मृत्यु हो सकती है या पासिंग के बाद अत्यधिक स्वतःस्फूर्त विभेदन हो सकता है।
- 37 पर इनक्यूबेट करें°प्रत्येक वेल में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के बाद सी (8 आकृति या एल आकार हिलाना)। पासिंग के बाद 24 घंटे तक प्लेट में गड़बड़ी से बचें।
टिप्पणीएक बार कोशिकाओं को खुरचने के बाद आप उन्हें यथाशीघ्र नई प्लेट में स्थानांतरित करना चाहेंगे, क्योंकि कोशिकाएं शीघ्रता से (5 मिनट के भीतर) पुनः जुड़ जाएंगी।
यदि EDTA को कोशिकाओं पर 4 मिनट से अधिक समय तक छोड़ दिया जाता है, तो कोशिकाएँ अलग होना शुरू हो सकती हैं। यदि ऐसा होता है, तो बस कोशिकाओं को 4mL PSC मीडिया के साथ 15mL फाल्कन में इकट्ठा करें। 5 मिनट के लिए 130 rcf पर कोशिकाओं को स्पिन करें। 1mL मीडिया के साथ गोली को फिर से लटकाएँ और 6 वेल मैट्रिजेल कोटेड प्लेट (160uL प्रति वेल) में समान रूप से विभाजित करें।
EDTA घोल: 500uL 0.5M EDTA (pH 8.0) को 500mL DPBS (-/-) में मिलाएँ। 0.9g NaCl मिलाएँ। घोल को छानकर स्टेरलाइज़ करें और 4°C पर 6 महीने तक स्टोर करें।
पेपर से:
रासायनिक रूप से परिभाषित संवर्धन स्थितियों में एंजाइम-मुक्त पृथक्करण द्वारा मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का मार्ग निर्धारण और कॉलोनी विस्तार
जीनेट बियर्स,1 डैनियल आर. गुलब्रान्सन,2,3 निकोल जॉर्ज,4लॉरेन आई. सिनिस्काल्ची,1 जेफ़री जोन्स,4,5 जेम्स ए. थॉमसन,2,3,6 और गुओकाई चेन1,2
14. फ्रीजिंग hESC/iPSC
- बायो-कूल (नियंत्रित दर फ्रीजर) चालू करें और तापमान को -7°C पर समायोजित करें।
- इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें और सूक्ष्मदर्शी से संगम और आकारिकी का निरीक्षण करें।
- यदि कुएं 70% संलयित हैं, तो पुराने मीडिया को हटा दें और एक बार PBS(-/-) से धो लें, फिर प्रति कुएं में 1 एमएल EDTA घोल डालें (EDTA घोल के साथ पासिंग देखें)।
- कमरे के तापमान पर 3-4 मिनट तक रखें।
- EDTA घोल को चूसें और 1 एमएल ठंडा mFreSR मीडिया (cat#05855, स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) डालें।
- कोशिकाओं को धीरे से उठाने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। कोशिकाओं को जितना संभव हो सके बड़े टुकड़ों में रखें और ऊपर-नीचे पाइपिंग से बचें।
- चौड़े मुंह वाली टिप का उपयोग करके कोशिकाओं/mFreSR को क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें। चरण 8 के लिए तैयार होने तक शीशियों को बर्फ पर रखें।
- ट्यूबों को बायो-कूल में रखें और 10 मिनट तक रखें।
- तरल नाइट्रोजन प्राप्त करें.
- 10 मिनट के बाद, एक स्पैटुला को तरल नाइट्रोजन में डुबोकर और क्रायो-वायल के किनारे को लगभग 10-30 सेकंड तक छूते हुए कोशिकाओं को बीज दें या जब तक आपको क्रायो-वायल के किनारे एक क्रिस्टल का रूप दिखाई न दे।
- “PROG” बटन दबाकर प्रोग्राम 1 शुरू करें और फिर से बटन दबाकर प्रोग्राम से गुजरें और आपको 0.5°C/मिनट की दर दिखनी चाहिए, फिर “RUN” दबाएं।
- जब तापमान -65°C तक पहुंच जाता है तो क्रायो-ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित और संग्रहीत किया जा सकता है।
वैकल्पिक
दूसरा विकल्प यह है कि क्रायो-ट्यूब को फ़्रीजिंग कंटेनर (बायोसिशन-कूलसेल) में रखें और रात भर -80°C पर स्टोर करें। अगले दिन क्रायो-ट्यूब को लिक्विड नाइट्रोजन (तरल या वाष्प चरण) में ले जाएँ।
डॉ. विलियम स्टैनफोर्ड-2022