trypsine

Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Hank's gebalanceerde zoutoplossing

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) calciumchloride, (-) magnesiumchloride, (-) magnesiumsulfaat)

DMSO voor bevriezen

Celkweekkwaliteit DMSO

Cellen komen bevroren aan op droogijs in een concentratie van ongeveer 5 x 10⁵cellen / flesje

Protocol voor het ontdooien van fibroblasten

1. Ontdooi cellen snel in een 37 ° C waterbad.
2. Veeg de buitenkant van de flacon met 70% ethanol.
3. Breng de ontdooide cellen over in een T25-fles die 5 ml groeimedia zonder puromycine bevat.
4. Plaats de kolf een nacht in 37 ° C incubator.
5. De volgende dag observeren onder de microscoop om er zeker van te zijn dat cellen zijn gehecht.
6. Verwijder media en vervang door nieuwe groeimedia.

Subkweek PRF-cellijnen

1) Wanneer cellen zijn gevestigd en groeien, begint u media te gebruiken die 0.75 μg / ml puromycine bevatten. Blijf de cellen behouden in media die 0.75 μg / ml puromycine bevatten.

2) Cellen moeten worden gesplitst wanneer ze samenvloeien.

3) Om cellen te splitsen (gegeven volumes gaan ervan uit dat cellen zich in een T25 bevinden):

A. Verwijder met behulp van steriele techniek de media en spoel de kolf met 2-3 ml steriele HBSS. HBSS verwijderen en weggooien.

B. Voeg 1 ml trypsine toe en incubeer gedurende 2-3 minuten. Cellen moeten onder een omgekeerde microscoop worden gecontroleerd om te bepalen of ze zijn begonnen af ​​te ronden, op te heffen en te drijven. Als cellen na 3 minuten niet worden losgemaakt, kunt u nog een 1-2 minuten incuberen

C. Draai de dop vast en tip de fles voorzichtig heen en weer om alle cellen los te maken. Kolf kan lichtjes op de zijkant worden getikt om cellen indien nodig los te maken.

D. Voeg 4 ml nieuwe media toe aan de kolf zodra cellen drijven om de trypsine te inactiveren. Spoel de zijkanten van de kolf verschillende keren af ​​met het nieuwe medium om alle cellen van het plastic en in de oplossing te wassen. Verwijder alle vloeistof bevattende cellen en breng over naar een 15ml conische (of 50 ml als u 3 of meer kolven samenvoegt).

E. Gebruik een steriele techniek om een ​​hoeveelheid te verwijderen om op een hemacytometer te tellen.

F. Terwijl u cellen telt, moet de rest van de oplossing 5 minuten met 1000 rpms in de klinische centrifuge worden gesponnen.

4) Na het berekenen van uw celgetal, plaatst u de cellen op 2.5 x 10⁵ cellen per T 25-filterkolf.

5) Cellen moeten elke 2-3 dagen worden gevoed met vers groeimedium dat 0.75 μg / ml puromycine bevat.

invriezen:

Cellen moeten worden ingevroren op niet minder dan 5x 10⁵ cellen / ml / cryoviaal in groeimedia met 10% DMSO en 30% FBS zonder puromycine en vervolgens overnacht in een isopropanol-vrieskamer bij -80 ° C geplaatst. Breng de volgende dag over naar vloeibare stikstof.

Wendy Norris