Pagina selecteren

Geïmmortaliseerde cel

Cultuurprotocollen

 

Onsterfelijk gemaakt celcultuurprotocol

We danken Dr. Martin Dorf van de Harvard University voor het genereus genereren en leveren van de onsterfelijk gemaakte cellijnen aan de PRF Cell & Tissue Bank. Dank je.

PRF-cellijnen werden vereeuwigd met behulp van het volgende protocol:

Retrovirus-infectie

A. Virus produceren: 12-24 uur voor transfectie werden HEK293-cellen in de verpakking uitgeplaat op een plaat van 100 mm bij 60-80% confluentie. Elke plaat werd gecotransfecteerd met 12 μg retroviraal construct pBABE-puro (SV40T) en 12 μg pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector. Het kweekmedium werd 8-10 uur na transfectie afgezogen en vervangen door 10 ml compleet medium. De kweek werd nog eens 48-72 uur geïncubeerd om een ​​optimale virale titer te verkrijgen.

B. Doelcellen infecteren: De doelwitcellen werden 100-12 uur voor infectie uitgeplaat op een 18 mm plaat. Het medium van de verpakkingscellen werd verzameld en gefiltreerd door een celluloseacetaat- of polysulfonfilter van 0.45 μm. Zodra de cellen 40-60% confluent waren, werd 8 ml virusbevattend medium met een eindconcentratie van 10 ug / ml polybreen toegevoegd. Drie infectierondes werden opeenvolgend uitgevoerd, ~ 12 uur uit elkaar. Het medium werd na 24 uur incubatie vervangen.

C. Selectie van stabiele cellijnen: 72 uur na infectie werden de cellen getrypsiniseerd, 1: 3 gesplitst en overgebracht naar twee 100 mm platen in aanwezigheid van 3 ug / ml puromycine, plus één controleplaat zonder antibioticum. Het kweekmedium werd elke 2 of 3 dagen vervangen gedurende ongeveer 2 tot 4 weken om stabiele cellijnen te produceren.

 

Groeimedia

DMEM- Invitrogen # 11960-044 (hoge glucose zonder L-glutamine)

15% FBS foetaal runderserum

1% (1x) Penicilline-streptomycine (Invitrogen # 15140-122)

1% (1X) L-glutamine (Invitrogen # 25030-081)

0.75 μg / ml puromycine (InvivoGen # ant-pr-1)

trypsine

Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Hank's gebalanceerde zoutoplossing

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) calciumchloride, (-) magnesiumchloride, (-) magnesiumsulfaat)

DMSO voor bevriezen

Celkweekkwaliteit DMSO

Cellen komen bevroren aan op droogijs in een concentratie van ongeveer 5 x 105cellen / flesje

Protocol voor het ontdooien van fibroblasten

  1. Ontdooi cellen snel in een 37 ° C waterbad.
  2. Veeg de buitenkant van de flacon met 70% ethanol.
  3. Breng de ontdooide cellen over in een T25-fles die 5 ml groeimedia zonder puromycine bevat.
  4. Plaats de kolf een nacht in 37 ° C incubator.
  5. De volgende dag observeren onder de microscoop om er zeker van te zijn dat cellen zijn gehecht.
  6. Verwijder media en vervang door nieuwe groeimedia.

Subkweek PRF-cellijnen

1) Wanneer cellen zijn gevestigd en groeien, begint u media te gebruiken die 0.75 μg / ml puromycine bevatten. Blijf de cellen behouden in media die 0.75 μg / ml puromycine bevatten.

2) Cellen moeten worden gesplitst wanneer ze samenvloeien.

3) Om cellen te splitsen (gegeven volumes gaan ervan uit dat cellen zich in een T25 bevinden):

A. Verwijder met behulp van steriele techniek de media en spoel de kolf met 2-3 ml steriele HBSS. HBSS verwijderen en weggooien.

B. Voeg 1 ml trypsine toe en incubeer gedurende 2-3 minuten. Cellen moeten onder een omgekeerde microscoop worden gecontroleerd om te bepalen of ze zijn begonnen af ​​te ronden, op te heffen en te drijven. Als cellen na 3 minuten niet worden losgemaakt, kunt u nog een 1-2 minuten incuberen

C. Draai de dop vast en tip de fles voorzichtig heen en weer om alle cellen los te maken. Kolf kan lichtjes op de zijkant worden getikt om cellen indien nodig los te maken.

D. Voeg 4 ml nieuwe media toe aan de kolf zodra cellen drijven om de trypsine te inactiveren. Spoel de zijkanten van de kolf verschillende keren af ​​met het nieuwe medium om alle cellen van het plastic en in de oplossing te wassen. Verwijder alle vloeistof bevattende cellen en breng over naar een 15ml conische (of 50 ml als u 3 of meer kolven samenvoegt).

E. Gebruik een steriele techniek om een ​​hoeveelheid te verwijderen om op een hemacytometer te tellen.

F. Terwijl u cellen telt, moet de rest van de oplossing 5 minuten met 1000 rpms in de klinische centrifuge worden gesponnen.

4) Na het berekenen van uw celgetal, plaatst u de cellen op 2.5 x 105 cellen per T 25-filterkolf.

5) Cellen moeten elke 2-3 dagen worden gevoed met vers groeimedium dat 0.75 μg / ml puromycine bevat.

invriezen:

Cellen moeten worden ingevroren op niet minder dan 5x 105 cellen / ml / cryoviaal in groeimedia met 10% DMSO en 30% FBS zonder puromycine en vervolgens overnacht in een isopropanol-vrieskamer bij -80 ° C geplaatst. Breng de volgende dag over naar vloeibare stikstof.

Voor meer informatie, richt u tot:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Hoogleraar pediatrisch onderzoek Warren Alpert Medical School of Brown University en Department of Pediatrics, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Department of Anesthesia, Children's Hospital Boston en Harvard Medical School, Boston, MA medisch directeur, The Progeria Research Foundation

Telefoon: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
Leslie_Gordon@brown.edu

Wendy Norris
PRF Cell and Tissue Bank
Telefoon: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org