Trypsine

Trypsine EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

Hank's gebalanceerde zoutoplossing

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) calciumchloride, (-)magnesiumchloride, (-) magnesiumsulfaat)

DMSO voor invriezen

Celcultuurkwaliteit DMSO

Cellen komen bevroren aan op droogijs in een concentratie van ongeveer 5 x 10⁵cellen/flesje

Protocol voor het ontdooien van fibroblasten

1. Ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37°C.
2. Veeg de buitenkant van het flesje schoon met 70%-ethanol.
3. Breng de ontdooide cellen over in een T25-kolf met 5 ml groeimedium zonder puromycine.
4. Plaats de kolf een nacht in een broedstoof bij 37°C.
5. Bekijk de volgende dag onder de microscoop of de cellen zich hebben gehecht.
6. Verwijder de media en vervang ze door nieuwe groeimedia.

Subculturen van PRF-cellijnen

1) Wanneer cellen gevestigd zijn en groeien, begin dan met het gebruiken van media die 0,75 μg/ml puromycine bevatten. Blijf de cellen in media houden die 0,75 μg/ml puromycine bevatten.

2) Cellen moeten gesplitst worden als ze samenvloeien.

3) Om cellen te splitsen (de opgegeven volumes zijn gebaseerd op de veronderstelling dat de cellen zich in een T25 bevinden):

A. Verwijder de media met behulp van een steriele techniek en spoel de kolf met 2-3 ml steriele HBSS. Verwijder de HBSS en gooi deze weg.

B. Voeg 1 ml trypsine toe en incubeer 2-3 minuten. Cellen moeten onder een omgekeerde microscoop worden gecontroleerd om te bepalen of ze zijn begonnen met ronddraaien, optillen en drijven. Als de cellen na 3 minuten niet loskomen, kunt u nog eens 1-2 minuten incuberen

C. Draai de dop vast en kantel de kolf voorzichtig van links naar rechts om alle cellen los te maken. De kolf kan indien nodig lichtjes op de zijkant worden getikt om de cellen los te maken.

D. Voeg 4 ml nieuwe media toe aan de kolf zodra de cellen drijven om de trypsine te inactiveren. Spoel de zijkanten van de kolf meerdere keren af met de nieuwe media om alle cellen van het plastic en in de oplossing te wassen. Verwijder alle vloeistof met cellen en giet over in een conische 15 ml (of 50 ml als u 3 of meer kolven samenvoegt).

E. Neem met behulp van een steriele techniek een aliquot om te tellen op een hemacytometer.

F. Terwijl u de cellen telt, moet de rest van de oplossing gedurende 5 minuten bij 1000 toeren per minuut in de klinische centrifuge worden gecentrifugeerd.

4) Nadat u uw celtelling hebt berekend, plaatst u de cellen op 2,5 x 10⁵ cellen per T 25 filtertopkolf.

5) De cellen moeten elke 2-3 dagen gevoed worden met vers groeimedium dat 0,75 μg/ml puromycine bevat.

Bevriezen:

Cellen moeten worden ingevroren bij minimaal 5x10⁵ cellen /ml/cryoviaal in groeimedia bevat 10% DMSO en 30% FBS zonder puromycine en vervolgens in een isopropanolvrieskamer bij -80°C gedurende de nacht geplaatst. De volgende dag overbrengen naar vloeibare stikstof.

Wendy Norris