Pagina selecteren

Lymphoblast Cell

Cultuurprotocollen

 

Protocol voor het kweken van getransformeerde lymfocyten

Van verzending van bevroren cellen

Bevroren cellen worden ontvangen in hoeveelheden van 1 ml op droogijs. Houd cellen ingevroren tot ze zijn ontdooid voor celkweek of plaats ze in vloeibare stikstofopslag als ze niet meteen beginnen met kweken. Het wordt echter aanbevolen dat als u de cellen gaat opslaan voor later gebruik, u nieuwe voorraden opgroeit en meerdere ampullen invriest. De cellen worden gecryopreserveerd in 45% RPMI-1640, 50% foetaal kalfsserum en 5% DMSO (weefselkweekkwaliteit).

  1. Plaats 10 ml RPMI-1640, 15% foetaal kalfsserum (FCS), ± antibiotica in een T-25-kolf.
  2. Laat de media in een 37 ° C bevochtigde incubator equilibreren met 5% CO 2in lucht gedurende 30 minuten.
  3. Ontdooi elke ampul met bevroren cellen in een 37 ° C waterbad of een beker lauw water, een voor een.
  4. Reinig de buitenkant van de ampul snel met een steriel isopropanol prep pad, wikkel het prep pad rond de ampul om vingers te beschermen en de afdichting op de ampul te barsten in een biologische veiligheidskap.
  5. Verwijder de 1 ml bevroren cellen met een steriele glazen pasteurpipet en plaats in een T-25-fles met 10 ml medium. Label de fles duidelijk om elke cellijn te identificeren.
  6. Plaats de cellen in een bevochtigde incubator 37 ° C met 5% CO 2 in de lucht.
  7. Verwijder na 24 uur 5 ml medium van de bovenkant zonder de lymfocyten op de bodem van de kolf te verstoren en vervang door 5 ml voorverwarmd medium.
  8. Voer de cellen om de 5-6 dagen met 3-4 ml vers medium en verdeel ze indien nodig in nieuwe culturen.

Van verzending van levende culturen

  1. Levende lymfocytenkweken zullen worden ontvangen in T-25-kolven die tot de top zijn gevuld met RPMI-1640, 15% FCS, 1% Penicilline-Streptomycine (Gibco). De doppen worden strak en afgedicht met parafilm.
  2. Verwijder parafilm.
  3. Plaats de culturen in een bevochtigde incubator van 37 ° C met 5% CO2 in lucht en laat de cellen bezinken (20 - 30 minuten).
  4. Gebruik een steriele pipet om alles behalve 10-15 ml medium te verwijderen en weg te gooien.
  5. Plaats de doppen terug op flessen die iets zijn losgemaakt om gasuitwisseling mogelijk te maken (controleer of de schroefdraden van de dop geen media bevatten. Als dit het geval is, wilt u mogelijk overgaan naar een nieuwe fles.) Plaats de culturen terug in de incubator met 5% CO 2in lucht. Ze zouden binnen een dag of twee moeten herstellen.
  6. Voer de cellen elke 3-4 dagen met vers medium door de celaggregaten te resuspenderen en 50-60% van het volume te verwijderen en te vervangen door vers medium. Cellen die uit de kolf zijn verwijderd, kunnen worden gebruikt om indien nodig nieuwe culturen te starten.

Voor meer informatie, richt u tot:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Hoogleraar pediatrisch onderzoek Warren Alpert Medical School of Brown University en Department of Pediatrics, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Department of Anesthesia, Children's Hospital Boston en Harvard Medical School, Boston, MA medisch directeur, The Progeria Research Foundation

Telefoon: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
Leslie_Gordon@brown.edu

Wendy Norris
PRF Cell and Tissue Bank
Telefoon: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org