Selecteer een pagina

Geïnduceerde pluripotente

Stamcellen

 

1. iPSC Achtergrondinformatie voor de niet-wetenschapper

Stamcellen zijn "onvolwassen" cellen die nog niet zijn toegewijd aan het worden van een bepaald celtype. Ze zijn plooibaar omdat ze het potentieel hebben om zich te ontwikkelen tot veel verschillende soorten volwassen cellen in het lichaam, zoals cellen die het hart of de bloedvaten vormen, en andere weefsels en organen. In 2007 ontdekten onderzoekers een strategie voor het creëren van stamcellen in het laboratorium door volwassen volwassen cellen te herprogrammeren die we gewoonlijk kweken voor onderzoeksdoeleinden.1, 2 . Deze kunstmatig gecreëerde stamcellen worden geïnduceerde pluripotente stamcellen ("iPSC's") genoemd. Voor het veld van Progeria is dit een enorme doorbraak. Voor het eerst kunnen wetenschappers nu Progeria-stamcellen maken en vragen stellen over hoe stamcellen functioneren en zich ontwikkelen in Progeria. Voorheen was er geen bron van menselijke Progeria-stamcellen en was er daarom een gebrek aan informatie over hoe Progeria-stamcellen functioneren in vergelijking met stamcellen van mensen zonder Progeria. Bovendien kunnen wetenschappers de Progeria-stamcellen herprogrammeren om voor het eerst volwassen Progeria-bloedvaten, hartcellen en andere celtypen te creëren. Tot nu toe was er geen bron van menselijke Progeria-hart- of bloedvatcellen.  We kunnen nu de sleutel vragen vragen over de hartziekte die leidt tot vroegtijdige dood bij Progeria door hartaanvallen en beroertes. We kunnen deze ontdekkingen vergelijken met de hartziekte en veroudering in de algemene bevolking en meer ontdekken over wat veroudering bij ons allemaal beïnvloedt. Er zijn al verschillende uitstekende studies gepubliceerd met behulp van Progeria-stamcellen.3-5  Ons doel bij The Progeria Research Foundation is om nog veel meer ontdekkingen te faciliteren met behulp van deze onschatbare tool. Voor een inleiding over stamcellen, zie deze website van de Amerikaanse overheid: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Inductie van pluripotente stamcellen uit volwassen menselijke fibroblasten door gedefinieerde factoren. Cel. 2007;131:861-872.
    2. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. Geïnduceerde pluripotente stamcellijnen afgeleid van menselijke lichaamscellen. Wetenschap. 2007;318:1917-1920.
    3. Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3e, Izpisua Belmonte JC. Samenvatting van vroegtijdige veroudering met iPSC's van het Hutchinson-Gilford progeriasyndroom. Natuur. 2011;472:221-225.
    4. Misteli T. HGPS-afgeleide iPSC's voor de leeftijden. Cel Stamcel. 2011;8:4-6.

2. Doel van de generatie en distributie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) door de Progeria Research Foundation

De missie van The Progeria Research Foundation is om behandelingen en de genezing te ontdekken voor het Hutchinson-Gilford Progeria Syndroom en de daarmee samenhangende verouderingsstoornissen. In 2009 ging PRF een samenwerking aan met een deskundig team van wetenschappers aan de University of Toronto, Canada, onder leiding van William Stanford, PhD, om hoogwaardige Progeria iPSC's te genereren. Dr. Stanford is de Canada Research Chair in Integrative Stem Cell Biology. Vanaf 2011 werkt PRF nog steeds samen met Dr. Stanford aan de University of Ottawa, Canada, waar hij hoogleraar cellulaire en moleculaire geneeskunde is, faculteit geneeskunde en senior wetenschapper bij het Sprott Centre for Stem Cell Research van het Ottawa Hospital Research Institute.

Ons doel is om deze onschatbare tool te bieden aan onderzoekers over de hele wereld. Deze nieuwe onderzoekstool zal worden gebruikt om nieuw en innovatief onderzoek te genereren in Progeria, evenals de relatie ervan met hartziekten en veroudering.  

3. Generatie van Hutchinson-Gilford Progeria Syndroom Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen (iPSCs)

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) werden afgeleid met behulp van VSVG-pseudotyped retrovirale transductie van vier menselijke factoren, Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc in fibroblasten. iPSC-kolonies werden afgeleid op muis-embryonale fibroblasten (MEF's). De gebruikte procedure was in wezen zoals eerder beschreven, maar zonder het gebruik van de EOS-reporter (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Kwaliteitscontrole: Validatie en karakterisering

De lijnen die momenteel beschikbaar zijn, hebben verschillende validatiestappen ondergaan (zie onderstaande downloadbare PDF's):

 

    1. Mycoplasma-testen voor elke lijn: Dr. Stanford's lab heeft mycoplasma-analyse uitgevoerd door PCR voor elke cellijn. Daarnaast worden de lijnen na expansie en voorafgaand aan het verzenden van cellen opnieuw getest op mycoplasma.
    2. Immunokleuring voor pluripotentiemarkers Tra-1-60, Tra-1-81 en SSEA4.
    3. Alkalische fosfatasekleuring als indicator van pluripotentie
    4. Embryoïde lichaamvorming en daaropvolgende immunokleuring voor merkers van de drie kiembladen. De geteste merkers waren βIII-tubuline (ectoderm), gladde spieractine (mesoderm) en Gata4 of AFP (endoderm)
    5. Karyotype-analyse.
    6. Herexpressie van lamin A in gedifferentieerde cellen
    7. Teratoom-analyses

Aanvullende validatie in uitvoering:
Sommige lijnen hebben teratoma-assays voltooid, zoals blijkt uit ondersteunende gegevens. Voor alle andere lijnen zijn teratoma-assays in uitvoering en de status wordt bijgewerkt zodra deze assays zijn voltooid.

5. Oorspronkelijk uitgangsmateriaal waaruit deze iPS-cellen zijn afgeleid

iPSC's zijn afkomstig van niet-getransformeerde fibroblastcellijnen van PRF Cell & Tissue Bank.

De transductiemethode die voor alle iPS-lijnen werd gebruikt, was Retrovirus MKOS.

iPSC-lijn-IDMutatieGeslacht en donatieLeeftijdOorspronkelijk celtype Klik hier.Ondersteunende gegevens
HGADFN003 iPS 1B LMNAExon 11,
1824 C>T
Man 2jr 0mnd Dermale fibroblasten
HGADFN003
003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C LMNA-exon 11,
1824 C>T
Man 2jr 0mnd Dermale fibroblasten
HGADFN003
003 iPS1C
HGDFN003
iPS-1D
LMNA-exon 11,
1824 C>T
Man 2jr 0mnd Dermale fibroblasten
HGADFN003
003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J LMNA Exon 11, 1824 C>TMan 8jr 5mndDermale fibroblasten HGADFN167167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q LMNA Exon 11, 1824 C>TMan 8jr 5mndDermale fibroblasten HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B Moeder van HGADFN167 (niet aangetast)Vrouw 37jr 10mndDermale fibroblasten
HGMDFN090
090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C Moeder van HGADFN167 (niet aangetast)Vrouw 37jr 10mndDermale fibroblasten
HGMDFN090
090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2Vader van HGADFN167 (niet aangetast)Man 40jr
5 maanden
Dermale fibroblasten HGFDFN168168iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1PVader van HGADFN167 (niet aangetast)Man 40jr
5 maanden
Dermale fibroblasten
HGFDFN168
168iPS1P

6. Meld u aan voor onze e-maillijst voor toekomstige iPSC-updates en nieuwe cellijnen

We blijven iPSC-lijnen genereren. Als u periodieke updates wilt ontvangen over iPSC's die in de PRF Cell & Tissue Bank worden bewaard, meldt u zich dan aan voor onze e-maillijst door te klikken op hier

7. Vragen?

Neem contact op met Leslie Gordon, MD, PhD, medisch directeur, voor vragen of behoeften via lgordon@progeriaresearch.org of 978-535-2594

8. iPS-cellijnen bestellen

In 2014 heeft PRF een beleid van geen wijzigingen in onze MTA ingesteld. Dit is het resultaat van 12 jaar contractuele afspraken met 70 onderzoeksteams die werken bij instituten in 14 landen. PRF en haar raadslieden hebben rekening gehouden met de kwesties die in die periode zijn ontstaan en de overeenkomst dienovereenkomstig aangepast, wat heeft geresulteerd in wat wij als eerlijke en redelijke voorwaarden beschouwen.

Voor Amerikaanse federale overheidsinstellingen of vragen kunt u contact opnemen met Wendy Norris via: wnorris@brownhealth.org of 401-274-1122x48063.

Stap 1: Vul een aanvraag en een materiaaloverdrachtsovereenkomst in

Aanvraag en overeenkomst voor niet-gouvernementele instellingen

Overeenkomst inzake materiële overdracht voor niet-gouvernementele instellingen

Stap 2: Stuur de ingevulde aanvraag en de overeenkomst voor materiaaloverdracht terug naar Wendy Norris op wnorris@brownhealth.orgZodra uw bestelling is goedgekeurd, ontvangt u een e-mail ter bevestiging van uw bestelling en de verwachte verzenddatum. 

Stap 3: Het laboratorium van Dr. Stanford distribueert momenteel lijnen in bevroren cryovials. Zijn laboratorium stuurt u een e-mail wanneer de cultuur is verzonden, met verzend- en trackinginformatie. Onervaren onderzoekers worden doorverwezen naar gespecialiseerde cursussen die essentieel zijn voor het werk met menselijke embryonale stamcellen/iPSC's.

De Human Pluripotent Stem Cell Facility (onder leiding van Dr. Stanford) bij het Ottawa Hospital Research Institute biedt virtuele één-op-één training over de basis van iPSC-kweektechnieken die specifiek zijn voor de Progeria iPSC-cellijnen. Trainingsopties en -format zijn flexibel, afhankelijk van het ervaringsniveau van de wetenschappers.  Voor meer informatie kunt u een e-mail sturen naar hpscf@ohri.ca.

Stap 4: De Universiteit van Ottawa factureert u rechtstreeks voor elke iPSC-lijn, plus eventuele koerierskosten.

9. HGPS en Control iPS celkweekmedia voorbereiding

iPSC's en ESC's moeten gevoed worden met mTeSR Plus van Stem Cell Technologies (cat# 5825). Volg de aanbevelingen van de leverancier voor opslag.

10. Matrigelplaten voorbereiden

Opmerking:Alle stappen met betrekking tot matrigel moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd en zo koud mogelijk blijven.

  1. Ontdooi de matrigelfles op 4°C. Controleer het analysecertificaat van dat lot om de eiwitconcentratie te vinden.
  2. Voeg voldoende koud DMEM/F12-medium toe aan de ontdooide matrigel totdat een uiteindelijke concentratie van 5 mg/ml is bereikt.
  3. Maak alikwoten van 1 ml van de bereide matrigel uit stap 2 in voorgekoelde 15 ml falcon-buisjes.
  4. Vries alle alikwoten in en bewaar ze bij -20°C.
  5. Om matrigelplaten te maken, verwijdert u één aliquot matrigel (1 ml) van -20°C en voeg 10 ml koude DMEM/F12 toe. Meng goed totdat de pellet ontdooit (zonder dat er bellen ontstaan en houd de oplossing altijd koud).
  6. Giet het mengsel in een 50 ml-buis en voeg 20 ml koude DMEM/F12 toe (1 ml van het Matrigel-aliquot wordt verdund in 30 ml DMEM/F12). Meng goed.
  7. Plaat (1 ml/well voor 6-wells plaat, 0,5 ml/well voor 12-wells plaat, 0,25 ml/well voor 24-wells plaat). Zorg ervoor dat de oplossing het gehele oppervlak bedekt door de plaat voorzichtig te schudden. Vries overgebleven matrigel niet opnieuw in.
  8. Als u de plaat direct gebruikt, laat u deze 1 uur (of 30 minuten bij 37 °F) op kamertemperatuur staan.°C), bekijk matrigel onder de microscoop. Matrigel moet goed verspreid zijn en niet “klonterig”.
  9. Als u de platen op een ander moment gebruikt, wikkelt u de rand van de plaat in parafilm en bewaart u deze gedurende 4 uur.°C gedurende maximaal 2 weken.

Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Levenstechnologieën, cat#11330-057

Dr. William Stanford-2022

11. Ontdooien van ES- of iPS-cellen (per cryo-vial)

  1. Haal een matrigelplaat uit de oven (4°C) en verwarm deze een uur op kamertemperatuur. Je kunt ook een nieuwe matrigelplaat maken (zie het protocol voor het bereiden van een matrigelplaat).
  2. Verwarm 4 ml mTeSR Plus in een 15 ml falconbuis.
  3. Verwijder de cellen uit de vloeibare stikstoftank en draai ze rond in een bad van 37°C tot er nog maar een klein stukje ijs over is. Het flesje zou in 1-2 minuten moeten ontdooien. Deze stap moet snel worden uitgevoerd.
  4. Ethanolcelbuis en falcon mediabuis en plaats in de afzuigkap.
  5. Gebruik een 1 ml brede mondpunt langzaam Voeg cellen toe aan 4 ml voorverwarmde media (vermijd het mengen van de celsuspensie).
  6. 5 minuten op 130 rcf centrifugeren.
  7. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
  8. Voeg 2 ml PSC-medium toe en gebruik een brede mondtip breek de klonters voorzichtig. Breng de media over naar één putje van een 6-wells plaat en voeg 2uL ROCK-remmer (Y27632, uiteindelijke concentratie van 10uM) toe. Plaat in één met matrigel bedekt putje (van een 6-wells plaat).
  9. Schud de cellen voorzichtig om ze gelijkmatig te verdelen en plaats ze in een hypoxische broedstoof (5%O2, 10% CO2). Vermijd verstoring van de plaat gedurende 24 uur na het zaaien.

    OPMERKING: Het is erg belangrijk om overmatig afbreken van klonten of agressief pipetteren te vermijden. Dit kan de overlevingskans aanzienlijk verminderen. De cellen moeten in brokken van 100-300 cellen groot blijven op het moment van zaaien. Probeer voorzichtig te werk te gaan zodra de cellen ontdooid zijn om de tijd dat ze in contact zijn met cryoprotectant te minimaliseren.

  10. Verwijder de media na 24 uur en voeg 2 ml PSC-media toe (voor een plaat met 6 putjes, 1 ml voor een plaat met 12 putjes en 0,5 ml voor een plaat met 24 putjes). Zie het protocol Oogsten en verzorgen van hESC/iPSC.

    PSC-media

    mTeSR Plus van Stem Cell Technologies (cat# 5825). Volg de aanbevelingen van de leverancier voor opslag.

    Wat is ROCK Inhibitor Y27632?

    ROCK Inhibitor Y27632 is een selectieve remmer van de Rho-geassocieerde kinase p160 ROCK. Behandeling met ROCK Inhibitor Y27632 voorkomt dissociatie-geïnduceerde apoptose van humane embryonale stamcellen (hESC) en humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), waardoor de overlevingskans toeneemt en de pluripotentie behouden blijft tijdens subcultivatie en ontdooiing van hESC's en hiPSC's. ROCK Inhibitor Y27632 blijkt ook de overlevingskans van stamcellen te vergroten tijdens cryopreservatie. Let op dat Rock inhibitor-aliquots gevoelig zijn voor licht en herhaaldelijke vries-dooicycli. Zorg ervoor dat u deze aliquots gebruikt binnen de door de leverancier aanbevolen houdbaarheidsdatum.

    Dr. William Stanford-2022

    12. Oogsten en verzorgen van hESC/iPSC

    1. Bekijk de cellen de dag nadat ze zijn ontdooid onder de microscoop om de overlevingskans te bepalen. OPMERKING: het is normaal om een hoog aantal niet-gehechte cellen te zien. Zolang er cellen zijn gehecht, kunnen er binnen 3 - 7 dagen kolonies uit ontstaan.
    2. Verwijder media uit de wells en pipetteer 2 ml (voor een 6-wells, 1 ml voor een 12-wells en 0,5 ml voor een 24-wells plaat) verse en warme PSC-media per well. Plaats de plaat terug in de incubator.
    3. Cellen worden gevoed totdat 60-70% confluent is (volg de aanbevelingen van de leverancier).
    4. Vanaf dag 2 moeten de cellen worden geobserveerd en moeten eventuele gedifferentieerde cellen die groeien, worden verwijderd.
    5. Om de cellen schoon te maken, gebruikt u de plukkap en schraapt u de gedifferentieerde cellen weg met een pipetpunt.
    6. Zodra de cellen zijn gereinigd, vervangt u het medium zoals hierboven beschreven.

    (Zie hESC/iPSC bevriezen of hESC/iPSC passeren)

    OPMERKING:

    PSC-media bleken efficiënter in een hypoxische omgeving. We hebben ook waargenomen dat er minder differentiatie optreedt wanneer cellen worden gekweekt in hypoxische incubators dan in normoxische. Tot slot hebben gezaaide cellen een betere overlevingskans bij gebruik van een hypoxische incubator.

    Normoxisch: 37°C, 21% O2, 5% CO2

    Hypoxisch: 37°C, 5%O2, 10% CO2

    Dr. William Stanford-2022

    13. Het behalen van hESC/iPSC

    1. Voeg 2 ml PSC-medium toe aan een met 6 wells matrigel gecoate plaat en zet deze opzij.
    2. Neem de plaat die u wilt doorvoeren, verwijder de media uit het putje en was eenmaal met 1 ml PBS(-/-).
    3. Voeg 1 ml van de EDTA-oplossing toe aan de well en laat 3-4 minuten op kamertemperatuur staan. Beweeg de plaat niet, want cellen kunnen losraken.
    4. Verwijder de EDTA-oplossing en voeg 1 ml PSC-media toe. Laat de EDTA niet langer dan 4 minuten op de cellen zitten, omdat de cellen hierdoor loskomen.
    5. Schraap cellen met een celschraper en verdeel cellen over de 6 putjes van uw plaat met PSC-media. Vermijd overmatig breken van de koloniestukken en probeer voorzichtig te zijn met schrapen. Probeer cellen in grote stukken te houden. Gebruik een pipetpunt met brede mond om klonters te breken indien nodig. Overmatig breken van cellen kan leiden tot celdood of overmatige spontane differentiatie na passage.
    6. Broeden op 37°C na het gelijkmatig verdelen van de cellen in elke well (8-figuur of L-vormig schudden). Vermijd verstoring van de plaat gedurende 24 uur na passage.

    OPMERKING:Zodra de cellen zijn afgeschraapt, wilt u ze zo snel mogelijk overbrengen naar de nieuwe plaat. De cellen hechten zich namelijk snel weer vast (binnen 5 minuten).

    Als EDTA langer dan 4 minuten op de cellen blijft zitten, kunnen de cellen losraken. Als dit gebeurt, verzamel de cellen dan gewoon in een 15 ml falcon met 4 ml PSC-media. Spin de cellen 5 minuten op 130 rcf. Resuspendeer het pellet met 1 ml media en verdeel het gelijkmatig over een 6-well matrigel-gecoate plaat (160 uL per well).

    EDTA-oplossing: Voeg 500 uL 0,5 M EDTA (pH 8,0) toe aan 500 ml DPBS (-/-). Voeg 0,9 g NaCl toe. Filtreer de oplossing om te steriliseren en bewaar deze tot 6 maanden bij 4 °C.

    Uit het artikel:

    Passage en kolonie-expansie van menselijke pluripotente stamcellen door enzymvrije dissociatie in chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden

    Jeanette Bieren,1 Daniel R. Gulbranson,2,3 Nicole George,4Lauren I. Siniscalchi,1 Jeffrey Jansen,4,5 James A. Thomson,2,3,6 En Guokai-Chen1,2

    14. Bevriezen van hESC/iPSC

    1. Zet Bio-Cool (vriezer met gecontroleerde snelheid) aan en stel de temperatuur in op -7°C.
    2. Haal de cellen uit de broedstoof en bekijk de confluentie en morfologie onder de microscoop.
    3. Als de putjes 70%-confluent zijn, verwijder dan de oude media en was ze eenmaal met PBS(-/-). Voeg vervolgens 1 ml EDTA-oplossing (zie passeren met EDTA-oplossing) per putje toe.
    4. Laat 3-4 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    5. Zuig de EDTA-oplossing op en voeg 1 ml koud mFreSR-medium (cat#05855, Stem Cell Technologies) toe.
    6. Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig op te tillen. Houd cellen zoveel mogelijk in grote stukken en vermijd het op en neer pipetteren.
    7. Cellen/mFreSR overbrengen naar een cryotube met behulp van een brede mondtip. Houd de flesjes op ijs tot ze klaar zijn voor stap 8.
    8. Plaats de buisjes in Bio-Cool en laat ze 10 minuten incuberen.
    9. Zorg voor vloeibare stikstof.
    10. Na 10 minuten kunt u de cellen zaaien door een spatel in vloeibare stikstof te dompelen en de zijkant van het cryobuisje ongeveer 10-30 seconden aan te raken, of totdat u een kristalvorming op de zijkant van het cryobuisje ziet.
    11. Start programma 1 door op de knop “PROG” te drukken en doorloop het programma door nogmaals op de knop te drukken. U zou de snelheid van 0,5°C/min. moeten zien. Druk vervolgens op “RUN”.
    12. Zodra de temperatuur -65°C bereikt, kunnen de cryobuizen worden overgebracht en opgeslagen in vloeibare stikstof.

    Alternatieven

    Een andere optie is om de cryo-tubes in een vriescontainer (Biocision-CoolCell) te plaatsen en ze een nacht op -80°C te bewaren. Verplaats de cryo-tubes de volgende dag naar vloeibare stikstof (vloeibare of dampfase).

    Dr. William Stanford-2022

    nl_NLDutch