1. iPSC Achtergrondinformatie voor de niet-wetenschapper

Stamcellen zijn "onvolwassen" cellen die zich nog niet hebben gecommitteerd om een ​​bepaald celtype te worden. Ze zijn buigzaam omdat ze het potentieel hebben om zich te ontwikkelen tot veel verschillende soorten rijpe cellen in het lichaam, zoals cellen die deel uitmaken van het hart of de bloedvaten, en andere weefsels en organen. In 2007 ontdekten onderzoekers een strategie om stamcellen in het laboratorium te maken door volwassen volwassen cellen te herprogrammeren die we vaak voor onderzoeksdoeleinden kweken.^{1, 2} . Deze kunstmatig gecreëerde stamcellen worden geïnduceerde pluripotente stamcellen ("iPSC's") genoemd. Voor het vakgebied Progeria is dit een enorme doorbraak. Voor het eerst kunnen wetenschappers nu Progeria-stamcellen maken en vragen stellen over hoe stamcellen functioneren en zich ontwikkelen in Progeria. Voorheen was er geen bron van menselijke Progeria-stamcellen, en daarom was er een leegte van informatie over hoe Progeria-stamcellen functioneren in vergelijking met stamcellen van mensen zonder Progeria. Bovendien kunnen wetenschappers de Progeria-stamcellen opnieuw programmeren om voor het eerst rijpe Progeria-bloedvaten, hartcellen en andere celtypen te creëren. Tot nu toe was er geen bron van menselijke Progeria-hart- of bloedvatcellen.  We kunnen nu de sleutel vragen vragen over de hartziekte die leidt tot vroegtijdig overlijden in Progeria door hartaanvallen en beroertes. We kunnen deze ontdekkingen vergelijken met de hartziekte en veroudering in de algemene bevolking en meer ontdekken over wat de veroudering in ons allemaal beïnvloedt. Er zijn al verschillende uitstekende onderzoeken gepubliceerd met Progeria-stamcellen.^3-5  Ons doel bij The Progeria Research Foundation is om veel meer ontdekkingen te vergemakkelijken met behulp van deze waardevolle tool. Raadpleeg deze website van de Amerikaanse overheid voor een inleiding over stamcellen: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Doel van de generatie en distributie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) door The Progeria Research Foundation

De missie van The Progeria Research Foundation is het ontdekken van behandelingen en de remedie voor het Hutchinson-Gilford Progeria-syndroom en de aan veroudering gerelateerde aandoeningen. In 2009 ging PRF een samenwerking aan met een expertteam van wetenschappers van de Universiteit van Toronto, Canada, onder leiding van William Stanford, PhD, om Progeria iPSC's van hoge kwaliteit te genereren. Dr. Stanford is de Canada Research Chair in Integrative Stem Cell Biology. Vanaf 2011 blijft PRF samenwerken met Dr. Stanford aan de Universiteit van Ottawa, Canada, waar hij hoogleraar cellulaire en moleculaire geneeskunde is, faculteit geneeskunde en senior wetenschapper aan het Sprott Centre for Stem Cell Research van het Ottawa Hospital Research Institute.

Ons doel is om onderzoekers over de hele wereld dit instrument van onschatbare waarde te bieden. Dit nieuwe onderzoeksinstrument zal worden gebruikt om nieuw en innovatief onderzoek in Progeria te genereren, evenals de relatie met hartaandoeningen en veroudering.  

3. Generatie van Hutchinson-Gilford Progeria syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) werden afgeleid met behulp van VSVG-pseudogetypeerde retrovirale transductie van vier menselijke factoren, Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc in fibroblasten. iPSC-kolonies werden afgeleid van muis-embryonale fibroblasten (MEF's). De gebruikte procedure was in wezen zoals eerder beschreven, maar zonder het gebruik van de EOS-reporter (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Kwaliteitscontrole: validatie en karakterisering

De momenteel beschikbare regels hebben verschillende validatiestappen ondergaan (zie downloadbare PDF's hieronder):

5. Oorspronkelijk uitgangsmateriaal waaruit deze iPS-cellen zijn afgeleid

iPSC's zijn afgeleid van PRF Cell & Tissue Bank niet-getransformeerde fibroblastcellijnen.

De transductiemethode die werd gebruikt voor alle iPS-lijnen was Retrovirus MKOS.

iPSC-lijn-ID	Mutatie	Geslacht en donatie Leeftijd	Oorspronkelijk celtype Klik hier.	Ondersteunende gegevens
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Man 2yr 0mo	Huidfibroblasten HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Man 2yr 0mo	Huidfibroblasten HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Man 2yr 0mo	Huidfibroblasten HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Man 8yr 5mo	Dermale fibroblasten HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Man 8yr 5mo	Dermale fibroblasten HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Moeder van HGADFN167 (onaangetast)	Vrouw 37yr 10mo	Huidfibroblasten HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Moeder van HGADFN167 (onaangetast)	Vrouw 37yr 10mo	Huidfibroblasten HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Vader van HGADFN167 (onaangetast)	Man 40yr 5mo	Dermale fibroblasten HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Vader van HGADFN167 (onaangetast)	Man 40yr 5mo	Huidfibroblasten HGFDFN168	168 iPS1P

6. Word lid van onze e-maillijst voor toekomstige iPSC-updates en nieuwe cellijnen

We blijven iPSC-lijnen genereren. Als u periodieke updates wilt over iPSC's in de PRF Cell & Tissue Bank, meld u dan aan voor onze e-maillijst door te klikken op hier

7. Vragen?

Neem voor vragen of behoeften contact op met Leslie Gordon, MD, PhD, medisch directeur lgordon@progeriaresearch.org of 978-535-2594

8. Bestellen van iPS-cellijnen

In 2014 heeft PRF een beleid ingesteld waarbij onze MTA niet is gewijzigd. Dit is het resultaat van 12 jaar contractuele afspraken met 70-onderzoeksteams die werken bij instellingen in 14-landen. PRF en haar raadsman hebben rekening gehouden met de problemen die in die periode zijn gerezen en hebben de overeenkomst dienovereenkomstig bewerkt, wat resulteert in naar onze mening eerlijke en redelijke voorwaarden.

Voor Amerikaanse federale overheidsinstellingen of vragen kunt u contact opnemen met Wendy Norris op: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Stap 1: voltooi een aanvraag voor een aanvraag en materiaaloverdracht

Toepassing en overeenkomst voor niet-gouvernementele instellingen

Materiaaloverdrachtsovereenkomst voor niet-gouvernementele instellingen

Stap 2: Stuur de ingevulde aanvraag en de overeenkomst voor materiaaloverdracht terug naar Wendy Norris op wnorris@lifespan.org. Na goedkeuring ontvangt u een e-mail ter bevestiging van uw bestelling en verwachte verzenddatum. 

Stap 3: Het laboratorium van Dr. Stanford verdeelt momenteel lijnen in bevroren cryovials. Zijn laboratorium zal u een e-mail sturen wanneer de kweek is verzonden, met verzend- en trackinginformatie. Onervaren onderzoekers krijgen de opdracht om training te volgen in gespecialiseerde cursussen die essentieel zijn voor het werk van menselijke embryonale stamcellen / iPSC's.

De Human Pluripotent Stem Cell Facility (geregisseerd door Dr. Stanford) van het Ottawa Hospital Research Institute biedt virtuele één-op-één training over de basisprincipes van iPSC-kweektechnieken die specifiek zijn voor de Progeria iPSC-cellijnen. Trainingsopties en -format zijn flexibel, afhankelijk van het ervaringsniveau van de wetenschappers.  Stuur voor meer informatie een e-mail naar hpscf@ohri.ca.

Stap 4: De Universiteit van Ottawa zal u rechtstreeks factureren voor elke iPSC-lijn plus koerierskosten, indien van toepassing.

9. HGPS en controle iPS celkweekmedium voorbereiding

iPSC en ESC's moeten worden gevoed met mTeSR Plus van Stem Cell Technologies (cat# 5825). Volg de aanbevelingen van de leverancier voor opslag.

10. Matrigelplaten voorbereiden

Note: Alle stappen met matrigel moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd en zo koud mogelijk blijven.

1. Ontdooi matrigel fles bij 4°C. Controleer het analysecertificaat van die partij om de eiwitconcentratie te vinden.
2. Voeg voldoende koude DMEM/F12-media toe aan de ontdooide matrigel om een ​​eindconcentratie van 5 mg/mL te bereiken.
3. Maak porties van 1 ml van de bereide matrigel uit stap 2 in voorgekoelde 15 ml Falcon-buizen.
4. Vries en bewaar alle porties bij -20°C.
5. Om matrigelplaten te maken, verwijdert u een aliquot matrigel (1 ml) van -20°C en voeg 10 ml koude DMEM/F12 toe. Meng goed tot de pellet ontdooit (zonder luchtbellen te creëren, en houd de oplossing altijd koud).
6. Breng over in een buis van 50 ml, voeg vervolgens 20 ml koude DMEM/F12 toe (1 ml matrigel-aliquot wordt verdund in 30 ml DMEM/F12), meng goed.
7. Plaat (1 ml/putje voor plaat met 6 putjes, 0.5 ml/putje voor plaat met 12 putjes, 0.25 ml/putje voor plaat met 24 putjes). Zorg ervoor dat de oplossing het hele oppervlak bedekt door de plaat voorzichtig te schudden. Vries overgebleven matrigel niet opnieuw in.
8. Als u de plaat onmiddellijk gebruikt, laat de plaat dan 1 uur (of 30 minuten bij 37 .C) op kamertemperatuur staan°C), observeer Matrigel onder de microscoop. Matrigel moet goed verspreid zijn en niet "klonterig".
9. Als u platen op een ander moment gebruikt, wikkel de rand van de plaat dan in met parafilm en bewaar bij 4°C voor maximaal 2 weken.

Matrigel - BD / Fisher, cat # CB-40230

DMEM / F12 - Life Technologies, cat # 11330-057

Dr. William Stanford-2022

11. ES- of iPS-cellen ontdooien (per cryobuisje)

1. Neem een ​​matrigelplaat van 4°C en verwarm deze een uur op kamertemperatuur, of maak een verse matrigelplaat (zie protocol voor het voorbereiden van de matrigelplaat).
2. Verwarm 4 ml mTeSR Plus in een falconbuis van 15 ml.
3. Verwijder cellen uit de tank met vloeibare stikstof en wervel in een bad van 37 ° C totdat er nog maar een klein ijsblokje over is. De injectieflacon moet binnen 1-2 minuten ontdooien. Deze stap moet snel worden gedaan.
4. Tube met ethanolcel en falcon-mediabuis en plaats in de kap.
5. Gebruik een 1 ml wijde mond tip te langzaam voeg cellen toe aan 4 ml voorverwarmde media (vermijd het mengen van celsuspensie).
6. Draai 130 minuten op 5 rcf.
7. Verwijder supernatant.
8. Voeg 2 ml PSC-media toe, en met een brede mondtip klontjes voorzichtig breken. Breng media over naar een putje van een plaat met 6 putjes en voeg 2 L ROCK-remmer toe (Y27632, eindconcentratie van 10 uM). Plaat in een met matrigel gecoate put (van een plaat met 6 putjes).
9. Schud de cellen voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen en plaats ze in een hypoxische incubator (5% O₂, 10% CO₂). Vermijd verstoring van de plaat gedurende 24 uur na het zaaien.

   NOTITIE: Het is erg belangrijk om overmatige afbraak van klonten of agressief pipetteren te voorkomen. Dit kan de overlevingskans aanzienlijk verminderen. De cellen moeten op het moment van zaaien in brokken van 100-300 cellen blijven. Probeer voorzichtig te werk te gaan als de cellen eenmaal ontdooid zijn, om de tijd dat ze in contact komen met cryoprotectant tot een minimum te beperken.​

10. Verwijder de media na 24 uur en voeg 2 ml PSC-media toe (voor een 6 putje, 1 ml voor 12 putjes en 0.5 ml voor een plaat met 24 putjes). Zie Oogsten en verzorgen voor hESC/iPSC-protocol.

PSC-media

mTeSR Plus van Stem Cell Technologies (cat# 5825). Volg de aanbevelingen van de leverancier voor opslag.

Wat is ROCK Inhibitor Y27632?

ROCK-remmer Y27632 is een selectieve remmer van het Rho-geassocieerde kinase p160 ROCK. Behandeling met ROCK-remmer Y27632 voorkomt door dissociatie geïnduceerde apoptose van menselijke embryonale stamcellen (hESC) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), waardoor de overlevingskans wordt verhoogd en de pluripotentie behouden blijft tijdens subcultivatie en ontdooiing van hESC's en hiPSC's. Van ROCK-remmer Y27632 is ook aangetoond dat het de overlevingskans van stamcellen tijdens cryopreservatie verbetert. Merk op dat aliquots van steenremmers gevoelig zijn voor licht en repetitieve vries-dooicycli. Zorg ervoor dat u deze hoeveelheden gebruikt binnen de door de leverancier aanbevolen houdbaarheidsperiode.

Dr. William Stanford-2022

12. Oogsten en verzorgen van hESC/iPSC

1. De dag nadat de cellen waren ontdooid, bekijk ze onder de microscoop om de overlevingskans te bepalen. OPMERKING: het is normaal om een ​​groot aantal losse cellen te observeren. Zolang sommige cellen gehecht zijn, kunnen er binnen 3-7 dagen kolonies uit ontstaan.
2. Verwijder media uit de putjes en pipet 2 ml (voor een 6 putje, 1 ml voor 12 putjes en 0.5 ml voor 24 putjes plaat) verse en warme PSC-media per putje. Plaats de plaat terug in de incubator.
3. Cellen worden gevoed tot 60-70% confluent (volg de aanbevelingen van de leverancier).
4. Vanaf dag 2 moeten cellen worden geobserveerd en ontdaan van gedifferentieerde cellen die mogelijk groeien.
5. Om cellen schoon te maken, gebruikt u de plukkap en schraapt u gedifferentieerde cellen af ​​met een pipetpunt.
6. Zodra de cellen zijn schoongemaakt, wijzigt u de media zoals in de bovenstaande stappen is gedaan.

(Zie hESC/iPSC bevriezen of hESC/iPSC passeren)

NOTITIE:

Er werd vastgesteld dat PSC-media efficiënter waren in een hypoxische omgeving. We hebben ook waargenomen dat er minder differentiatie optreedt wanneer cellen worden gekweekt in hypoxische incubators versus normoxisch. Ten slotte hebben gezaaide cellen een betere overlevingskans bij gebruik van een hypoxische incubator.

Normoxisch: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

Hypoxisch: 37°C, 5% O₂, 10% CO₂

Dr. William Stanford-2022

13. HESC/iPSC . halen

1. Voeg 2 ml PSC-media toe aan een matrigel-gecoate plaat met 6 putjes en zet opzij.
2. Neem de plaat die moet worden gepasseerd en verwijder de media uit de put en was eenmaal met 1 ml PBS (-/-).
3. Voeg 1 ml van de EDTA-oplossing toe aan het putje en laat 3-4 minuten bij kamertemperatuur staan. Verplaats de plaat niet rond, omdat cellen kunnen losraken.
4. Verwijder de EDTA-oplossing en voeg 1 ml PSC-media toe. Laat EDTA niet langer dan 4 minuten op de cellen, omdat de cellen hierdoor zullen opstijgen.
5. Schraap cellen met behulp van een celschraper en verdeel de cellen over de 6 putjes van uw plaat met PSC-media. Vermijd overmatig opbreken van de koloniestukken en probeer voorzichtig te zijn met schrapen. Probeer cellen in grote brokken te houden. Gebruik indien nodig een pipetpunt met brede mond om klonten te verbreken. Overmatig opbreken van cellen kan celdood of overmatige spontane differentiatie na passage veroorzaken.
6. Incubeer bij 37°C na gelijkmatige verdeling van cellen in elk putje (8 figuur of L-vorm schudden). Vermijd plaatverstoring gedurende 24 uur na passage.

NOTITIE: Zodra de cellen zijn afgeschraapt, wilt u ze zo snel mogelijk op de nieuwe plaat overbrengen omdat de cellen snel weer vastzitten (binnen 5 minuten).

Als EDTA langer dan 4 minuten op de cellen blijft zitten, kunnen de cellen beginnen los te laten. Als dit gebeurt, verzamelt u de cellen gewoon in een valk van 15 ml met 4 ml PSC-media. Spin cellen bij 130 rcf gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellet met 1 ml media en verdeel gelijkmatig over een matrigel gecoate plaat met 6 putjes (160 ul per putje).

EDTA-oplossing: Voeg 500 µl 0.5 M EDTA (pH 8.0) toe aan 500 ml DPBS (-/-). Voeg 0.9 g NaCl toe. Filtreer de oplossing om te steriliseren en bewaar deze tot 4 maanden bij 6°C.

Uit de krant:

Passage en kolonie-expansie van menselijke pluripotente stamcellen door enzymvrije dissociatie in chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden

Jeanette Beers,¹ Daniel R. Gulbranson,^2,3 Nicole George,⁴Lauren I. Siniscalchi,¹ Jeffrey Jones,^4,5 James A. Thomson,^2,3,6 en Guokai Chen^1,2

14. hESC/iPSC . bevriezen

1. Zet Bio-Cool (Controlled Rate Freezer) aan en stel de temperatuur in op -7°C.
2. Verwijder cellen uit de incubator en observeer confluentie en morfologie onder de microscoop.
3. Als de putjes 70% confluent zijn, verwijdert u oude media en wast u eenmaal met PBS (-/-) en voegt u vervolgens 1 ml EDTA-oplossing toe (zie doorgeven met EDTA-oplossing) per putje.
4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-4 minuten.
5. Zuig de EDTA-oplossing op en voeg 1 ml koude mFreSR-media toe (cat#05855, Stem Cell Technologies).
6. Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig op te tillen. Houd cellen zoveel mogelijk in grote brokken en vermijd pipetteren op en neer.
7. Breng cellen/mFreSR over naar een cryobuis met behulp van een brede mondtip. Bewaar flacons op ijs tot ze klaar zijn voor stap 8.
8. Plaats buizen in Bio-Cool en incubeer gedurende 10 minuten.
9. Krijg vloeibare stikstof.
10. Na 10 minuten zaait u de cellen door een spatel in vloeibare stikstof te dompelen en de zijkant van de cryo-flacon ongeveer 10-30 seconden aan te raken of totdat u een kristalvorm aan de zijkant van de cryo-flacon ziet.
11. Start programma 1 door op de “PROG”-knop te drukken en doorloop het programma door nogmaals op de knop te drukken en u zou de snelheid van 0.5°C/min moeten zien. en druk vervolgens op "UITVOEREN".
12. Zodra de temperatuur -65°C bereikt, kunnen de cryobuizen worden overgebracht naar en opgeslagen in vloeibare stikstof.

Alternatieven

Een andere optie is om de cryobuisjes in een vriescontainer (Biocision-CoolCell) te plaatsen en een nacht bij -80°C te bewaren. Verplaats de cryobuizen de volgende dag naar vloeibare stikstof (vloeibare of dampfase).

Dr. William Stanford-2022