Pagina selecteren

Geïnduceerde pluripotent

Stamcellen

1. iPSC Achtergrondinformatie voor de niet-wetenschapper

Stamcellen zijn "onrijpe" cellen die zich nog niet hebben verbonden om één celtype te worden. Ze zijn plooibaar omdat ze het potentieel hebben om zich te ontwikkelen tot veel verschillende soorten volwassen cellen in het lichaam, zoals cellen die het hart of de bloedvaten vormen, en andere weefsels en organen. In 2007 ontdekten onderzoekers een strategie voor het maken van stamcellen in het laboratorium door volwassen volwassen cellen te herprogrammeren die we vaak laten groeien voor onderzoeksdoeleinden.1, 2 . Deze kunstmatig gecreëerde stamcellen worden geïnduceerde pluripotente stamcellen ("iPSC's") genoemd. Voor het veld van Progeria is dit een enorme doorbraak. Voor het eerst kunnen wetenschappers nu Progeria-stamcellen maken en vragen stellen over hoe stamcellen werken en zich ontwikkelen in Progeria. Voorheen was er geen bron van menselijke Progeria-stamcellen en daarom was er geen informatie over hoe Progeria-stamcellen werken in vergelijking met stamcellen van mensen zonder Progeria. Bovendien kunnen wetenschappers de Progeria-stamcellen opnieuw programmeren om voor het eerst volgroeide Progeria-bloedvaten, hartcellen en andere celtypen te maken. Tot nu toe was er geen bron van menselijke Progeria-hart of bloedvatcellen. We kunnen nu de sleutel vragen vragen over de hartziekte die leidt tot vroege dood in Progeria door hartaanvallen en beroertes. We kunnen deze ontdekkingen vergelijken met de hartziekte en veroudering in de algemene bevolking en meer ontdekken over wat veroudering bij ons allemaal beïnvloedt. Er zijn al verschillende uitstekende studies gepubliceerd met behulp van Progeria-stamcellen.3-5 Ons doel bij de Progeria Research Foundation is om veel meer ontdekkingen te faciliteren met behulp van deze waardevolle tool. Raadpleeg deze website van de Amerikaanse overheid voor meer informatie over stamcellen: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

  1. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Inductie van pluripotente stamcellen uit volwassen menselijke fibroblasten door gedefinieerde factoren. Cel 2007; 131: 861-872.
  2. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. Geïnduceerde pluripotente stamcellijnen afgeleid van menselijke somatische cellen. Science. 2007; 318: 1917-1920.
  3. Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3rd, Izpisua Belmonte JC. Samenvatting van voortijdige veroudering met iPSC's van het progamma-syndroom van Hutchinson-Gilford. Natuur. 2011; 472: 221-225.
  4. Misteli T. HGPS-afgeleide iPSC's voor alle leeftijden. Celstamcel. 2011; 8: 4-6.

2. Doel van het genereren en verspreiden van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) door The Progeria Research Foundation

De missie van The Progeria Research Foundation is het ontdekken van behandelingen en de remedie voor het Hutchinson-Gilford Progeria-syndroom en de aan veroudering gerelateerde aandoeningen. In 2009 ging PRF een samenwerking aan met een expertteam van wetenschappers van de Universiteit van Toronto, Canada, onder leiding van William Stanford, PhD, om Progeria iPSC's van hoge kwaliteit te genereren. Dr. Stanford is de Canada Research Chair in Integrative Stem Cell Biology. Vanaf 2011 blijft PRF samenwerken met Dr. Stanford aan de Universiteit van Ottawa, Canada, waar hij hoogleraar cellulaire en moleculaire geneeskunde is, faculteit geneeskunde en senior wetenschapper aan het Sprott Centre for Stem Cell Research van het Ottawa Hospital Research Institute.

Ons doel is om dit hulpmiddel van onschatbare waarde te bieden aan onderzoekers over de hele wereld. Deze nieuwe onderzoekstool zal worden gebruikt om nieuw en innovatief onderzoek in Progeria te genereren, evenals de relatie tot hartziekten en veroudering.

3. Generatie van Hutchinson-Gilford Progeria syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's)

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) werden afgeleid met behulp van VSVG-pseudotyped retrovirale transductie van vier menselijke factoren, Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc in fibroblasten. iPSC-kolonies werden verkregen op muis-embryonale fibroblasten (MEF's). De gebruikte procedure was in wezen zoals eerder beschreven, maar zonder het gebruik van de EOS-reporter (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009).

4. Kwaliteitscontrole: validatie en karakterisering

De momenteel beschikbare regels hebben verschillende validatiestappen ondergaan (zie downloadbare PDF's hieronder):

  1. Mycoplasmatesten voor elke lijn: het laboratorium van Dr. Stanford heeft mycoplasma-analyse uitgevoerd met PCR voor elke cellijn. Bovendien worden de lijnen na uitbreiding en voorafgaand aan het verzenden van cellen opnieuw getest op mycoplasma.
  2. Immunokleuring voor pluripotentie markers Tra-1-60, Tra-1-81 en SSEA4.
  3. Alkalische fosfatase-kleuring als indicator voor pluripotentie
  4. Embryoid lichaamsvorming en daaropvolgende immunokleuring voor markers van de drie kiemlagen. Geteste merkers waren βIII-tubuline (Ectoderm), Smooth-Muscle Actin (Mesoderm) en Gata4 of AFP (Endoderm)
  5. Karyotype-analyse.
  6. Re-expressie van lamin A in gedifferentieerde cellen
  7. Teratoma-testen

Extra validatie wordt uitgevoerd:
Sommige lijnen hebben teratoomtests voltooid zoals getoond in ondersteunende gegevens. Voor alle andere regels worden teratoomtests uitgevoerd en wordt de status bijgewerkt zodra deze tests zijn voltooid.

5. Origineel uitgangsmateriaal waarvan deze iPS-cellen zijn afgeleid

iPSC's werden afgeleid van niet-getransformeerde fibroblastcellijnen van PRF Cell & Tissue Bank.

De transductiemethode die werd gebruikt voor alle iPS-lijnen was Retrovirus MKOS.

iPSC-lijn-IDMutatieGeslacht en donatie LeeftijdOorspronkelijk celtype Klik hier.Ondersteunende gegevens
HGADFN003 iPS 1B LMNAExon 11,
1824 C> T
Man 2yr 0mo Huidfibroblasten
HGADFN003
003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C LMNA Exon 11,
1824 C> T
Man 2yr 0mo Huidfibroblasten
HGADFN003
003 iPS1C
HGDFN003
iPS 1D
LMNA Exon 11,
1824 C> T
Man 2yr 0mo Huidfibroblasten
HGADFN003
003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J LMNA Exon 11, 1824 C> TMan 8yr 5moDermale fibroblasten HGADFN167167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q LMNA Exon 11, 1824 C> TMan 8yr 5moDermale fibroblasten HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B Moeder van HGADFN167 (onaangetast)Vrouw 37yr 10moHuidfibroblasten
HGMDFN090
090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C Moeder van HGADFN167 (onaangetast)Vrouw 37yr 10moHuidfibroblasten
HGMDFN090
090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2Vader van HGADFN167 (onaangetast)Man 40yr
5mo
Dermale fibroblasten HGFDFN168168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1PVader van HGADFN167 (onaangetast)Man 40yr
5mo
Huidfibroblasten
HGFDFN168
168 iPS1P

6. Word lid van onze e-maillijst voor toekomstige iPSC-updates en nieuwe cellijnen

We blijven iPSC-lijnen genereren. Als u periodieke updates over iPSC's in de PRF Cell & Tissue Bank wenst, kunt u zich aanmelden bij onze e-maillijst door te klikken op hier

7. Vragen?

Neem voor vragen of behoeften contact op met Leslie Gordon, MD, PhD, medisch directeur lgordon@progeriaresearch.org of 978-535-2594

8. IPS-cellijnen bestellen

In 2014 heeft PRF een beleid ingesteld waarbij onze MTA niet is gewijzigd. Dit is het resultaat van 12 jaar contractuele afspraken met 70-onderzoeksteams die werken bij instellingen in 14-landen. PRF en haar raadsman hebben rekening gehouden met de problemen die in die periode zijn gerezen en hebben de overeenkomst dienovereenkomstig bewerkt, wat resulteert in naar onze mening eerlijke en redelijke voorwaarden.

Voor Amerikaanse federale overheidsinstellingen of vragen kunt u contact opnemen met Wendy Norris op: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Stap 1: voltooi een aanvraag voor een aanvraag en materiaaloverdracht

Toepassing en overeenkomst voor niet-gouvernementele instellingen

Materiële overdrachtsovereenkomst voor niet-gouvernementele instellingen *

Stap 2: stuur de voltooide overeenkomst voor aanvraag en materiaaloverdracht terug naar PRF op info@progeriaresearch.org. Na goedkeuring ontvangt u een e-mail ter bevestiging van uw bestelling en verwachte verzenddatum.

Stap 3: Het laboratorium van Dr. Stanford verdeelt momenteel lijnen in bevroren cryovials. Zijn laboratorium stuurt je een e-mail wanneer de cultuur is verzonden, met verzend- en trackinginformatie. Onervaren onderzoekers worden gevraagd om training te krijgen op gespecialiseerde cursussen die essentieel zijn voor het werk van menselijke embryonale stamcellen / iPSC's.

Stap 4: De Universiteit van Ottawa brengt $ 100.00 in rekening(USD) per iPSC-lijn plus eventuele koerierskosten en stuurt u rechtstreeks een factuur.

9. HGPS en controle iPS Voorbereiding van celcultuurmedia

iPSC en ESC's moeten worden gevoed met TeSR-E8 van Stem Cell Technologies (cat # 05990) of Essential 8 medium van ThermoFisher Scientific (cat # A1517001). Volg de aanbevelingen van de leverancier voor opslag.

10. Madrigalplaten bereiden

Opmerking:: Alle stappen met matrigel moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd en zo koud mogelijk blijven.

  1. Matrigelfles ontdooien (10ml) bij 4C.
  2. Neem een ​​matrigelfles en voeg 10ml koude DMEM / F12-media toe.
  3. Aliquot 1ml van matrigel in voorgekoelde 15ml-valkenbuizen.
  4. Bevries alle porties bij -20C
  5. Om een ​​matrigelplaat te maken, verwijdert u een hoeveelheid matrigel (1ml) van -20C en voegt u 18ml koude DMEM / F12 toe. Laat de pellets ontdooien en eenmaal ontdooid goed mengen (zonder bellen te creëren) en plaat (1ml / well voor 6 well-plaat, 0.5ml / well voor 12-well plaat, 0.25ml / well voor 24-putplaat). Deze platen zijn gelabeld als MG1.
  6. Als u de plaat onmiddellijk gebruikt, laat u de plaat 1 uur op kamertemperatuur staan ​​en observeert u matrigel onder de microscoop. Matrigel moet goed verspreid zijn en niet "klonterig".
  7. Zodra 1 uur is verstreken, brengt u de matrigel over naar een tweede plaat (deze plaat is gelabeld MG2). Als je het meteen gebruikt, incubeer dan 1 uur bij kamertemperatuur.
  8. Als u platen op een ander tijdstip gebruikt, wikkel dan de rand van de plaat met paraffine en bewaar bij 4 graden.


Matrigel - BD / Fisher, cat # CB-40230
DMEM / F12 - Life Technologies, cat # 11330-057

Dr. William Stanford-2018

11. HESC's en iPSC's ontdooien

ES- of iPS-cellen ontdooien (per cryobuisje)

  1. Neem matrigelplaat uit 4C en verwarm gedurende een uur op kamertemperatuur of maak verse matrigelplaat (zie voorbereiding matrigelplaat-protocol).
  2. Warm 4ml PSC-media (pluripotente stamcelmedia) in een 15ml-valkenbuis.
  3. Verwijder de cellen uit de vriezer en wervel in het 37-waterbad totdat er slechts een klein stuk ijs over is. Deze stap moet snel worden uitgevoerd.
  4. Tube met ethanolcel en falcon-mediabuis en plaats in de kap.
  5. Gebruik een 1ml-mondmondstuk om langzaam cellen toe te voegen aan 4ml voorverwarmde media
  6. Draai op 850rpm voor 5min
  7. Verwijder supernatant
  8. Voeg 2ml PSC-media toe en breek klompjes met een brede mondpunt. Breng media over naar één well van een 6-wellplaat en voeg 2ul ROCK-remmer toe (Y27632, eindconcentratie 10uM).
  9. Verwijder media na 24-uren en voeg 2ml PSC-media toe (voor een 6-put, 1ml voor 12-put en 0.5ml voor 24-putplaat). Zien Oogsten en zorgen voor hESC / iPSC protocol

PSC-media
TeSR-E8 van Stem Cell Technologies, catalogus # 05990 of Essential 8 Medium van ThermoFisher Scientific, catalogus # A1517001

Wat is ROCK Inhibitor Y27632?
ROCK-remmer Y27632 is een selectieve remmer van de Rhoassociated kinase p160ROCK. Behandeling met ROCK-remmer Y27632 voorkomt door dissociatie geïnduceerde apoptose van menselijke embryonale stamcellen (hESC) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC), verhoogt de overlevingskans en behoudt pluripotentie tijdens subcultivatie en ontdooiing van hESC's en hiPSC's. Van ROCK-remmer Y27632 is ook aangetoond dat het de overlevingskans van stamcellen tijdens cryopreservatie verbetert.

Dr. William Stanford-2018

12. Oogsten en verzorgen van hESC's en iPSC's

  1. Verwijder media uit 4C en plaats in 37C waterbad.
  2. De dag nadat cellen werden ontdooid, bekijkt u ze onder de microscoop om het overlevingspercentage te bepalen. (Als cellen alleen werden ingevroren met mFreSR is het overlevingspercentage ongeveer 20%, als cellen werden ingevroren met behulp van de Bio-Cool overlevingspercentage ongeveer 60%).
  3. Verwijder media uit de putjes en pipet 2ml (voor een 6-put, 1ml voor 12-put en 0.5ml voor 24-putjesplaat) van verse PSC-media per put.
  4. Plaats plaat in 37C-incubator (hypoxische toestand: 10% CO2 en 5% O2).
  5. Cellen worden elke dag gevoed voor de volgende 3-5 dagen totdat 80% samenvloeit.
  6. Cellen moeten worden geobserveerd en gereinigd van gedifferentieerde cellen die mogelijk groeien.
  7. Om cellen schoon te maken, gebruikt u de plukkap en "verwijdert u" gedifferentieerde cellen met een pipetpunt.
  8. Nadat cellen zijn schoongemaakt, wisselt u van medium zoals in de bovenstaande stappen is gedaan.

(Zie HESC / iPSC bevriezen of hESC / iPSC doorgeven)

NOTITIE:
PSC-media waren vastbesloten efficiënter te zijn in een hypoxische omgeving. We hebben ook waargenomen dat minder differentiatie optreedt wanneer cellen worden gekweekt in hypoxische incubators versus normoxisch. Ook bij het zaaien van cellen is er een betere overlevingskans bij gebruik van een hypoxische incubator.

Normoxisch: 5% CO2
Hypoxisch: 5% O2, 10% CO2

Dr. William Stanford-2018

13.Passaging met EDTA-oplossing

  1. Voeg 2ml PSC-media toe aan een met 6 well matrigel gecoate plaat en leg deze opzij.
  2. Neem de te passeren plaat en verwijder de media uit de put en was eenmaal met 1ml PBS (- / -).
  3. Voeg 1ml van de EDTA-oplossing toe aan de put en laat 3-4min op kamertemperatuur staan. Verplaats de plaat niet, cellen kunnen losraken.
  4. Eenmaal 4 min. is up verwijder EDTA-oplossing en voeg 1ml PSC-media toe. Laat EDTA niet langer dan 4 min op de cellen liggen, want hierdoor zullen de cellen opstijgen.
  5. Schraap cellen (met celschrapper) en verdeel cellen over de 6-putjes van uw plaat met PSC-media (ik heb 160ul in elke put genomen). Vermijd het opdelen van de stukken in zeer kleine stukken. Probeer grote stukken te houden. Gebruik bij voorkeur een pipet met wijde mond.

NOTITIE: Zodra de cellen zijn geschraapt, wilt u ze zo snel mogelijk naar de nieuwe plaat overbrengen, omdat de cellen snel opnieuw worden bevestigd (binnen 5min).

Als EDTA langer dan 4mins op de cellen wordt achtergelaten. de cellen kunnen losraken. Als dit gebeurt, verwijder je eenvoudig cellen en verzamel je een 15ml-valk met 4ml PSC-media. Draai cellen bij 850rpm gedurende 5 min. Resuspendeer de pellet met 1ml media en verdeel gelijkmatig over een met 6 well matrigel gecoate plaat (160ul per well).

EDTA-oplossing: Voeg 500ul van 0.5M EDTA (pH 8.0) toe aan 500ml DPBS (- / -). Voeg 0.9g NaCl toe en stel de osmolariteit in op 340 mOsm. Filter de oplossing om te steriliseren en bewaar deze tot 4 maanden bij 6C. We willen de minste hoeveelheid verstoring voor de cellen tijdens dissociatie, daarom heeft de EDTA-oplossing dezelfde osmolariteit als de PSC-media.

Uit de krant:
Passage en kolonie-expansie van menselijke pluripotente stamcellen door enzymvrije dissociatie in chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden
Jeanette Beers,1 Daniel R. Gulbranson,2,3 Nicole George,4Lauren I. Siniscalchi,1 Jeffrey Jones,4,5 James A. Thomson,2,3,6 en Guokai Chen1,2

14. Bevriezing van hESC's en iPSC's

  1. Schakel Bio-Cool (Controlled Rate Freezer) in en stel de SP-temperatuur in op -7C.
  2. Verwijder cellen uit de incubator en observeer confluentie en morfologie onder de microscoop.
    NOTITIE: Op zoek naar ~ 80% samenvloeiing
  3. Indien confluent, verwijder oude media en was eenmaal met PBS (- / -) en voeg vervolgens 1 ml EDTA-oplossing toe (zie passage met EDTA-oplossing) per well.
  4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-4 minuten.
  5. Zuig de EDTA-oplossing aan en voeg 1 ml mFreSR-media toe (cat # 05855, Stem Cell Technologies)
  6. Gebruik celschraper om de cellen (voorzichtig) van de put los te maken.
  7. Breng cellen / mFreSR over naar een cryobuis met behulp van een brede mondtip.
  8. Plaats buizen in Bio-Cool en incubeer voor 10min.
  9. Krijg vloeibare stikstof.
  10. Na 10min. zaai de cellen door een spatel in vloeibare stikstof te dopen en de zijkant van de cryo-flacon ongeveer 10 seconden aan te raken of totdat u een kristalvorm aan de zijkant van de cryo-flacon ziet.
  11. Start programma 1 door op de knop "PROG" te drukken en door het programma te gaan door nogmaals op de knop te drukken en u zou de snelheid van 0.5C / min moeten zien. en druk vervolgens op "UITVOEREN".
  12. Zodra de temperatuur -65C bereikt, kunnen de cryobuizen worden overgebracht en opgeslagen in vloeibare stikstof.

Alternatieven
1-Een andere optie is om de cryobuizen in een vriescontainer (Biocision-CoolCell) te plaatsen en 's nachts bij -80C te bewaren. Bewaar de volgende dag cryobuizen in vloeibare stikstof.

Dr. William Stanford-2018