Pagina selecteren

Fibroblast Cell

Cultuurprotocollen

 

Protocol voor subcultuur en bevriezing van fibroblasten

Groeimedia

DMEM - ThermoFisher # 11960-044 (hoge glucose zonder L-glutamine)

15% FBS foetaal runderserum - ThermoFisher # 10437-028

1% (1X) Penicilline-streptomycine - ThermoFisher # 15140-122

1% (1X) GlutaMAX - ThermoFisher # 35050-061

trypsine

Trypsin EDTA C 0.25% (ThermoFisher # 25200-056)

Hank's gebalanceerde zoutoplossing

HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) calciumchloride, (-) magnesiumchloride, (-) magnesiumsulfaat

DMSO voor bevriezen

Celcultuurkwaliteit DMSO - Sigma #D2438

PRF-cellijnen ontdooien

  1. Ontdooi cellen snel in een 37˚C waterbad.
  2. Veeg de buitenkant van de flacon met 70% ethanol.
  3. Breng de ontdooide cellen over in een T25-fles die 5 ml groeimedia bevat.
  4. Plaats de kolf gedurende de nacht in een 37˚C-incubator.
  5. De volgende dag observeren onder de microscoop om er zeker van te zijn dat cellen zijn gehecht.
  6. Verwijder media en vervang door nieuwe groeimedia.

Subkweek PRF-cellijnen

  1. Cellen moeten worden gesplitst wanneer ze samenvloeien.
  2. Cellen splitsen (gegeven volumes gaan ervan uit dat cellen zich in een T25 bevinden):
    a) Gebruik een steriele techniek, verwijder het medium en spoel de kolf met 2-3 ml steriel HBSS. Verwijder HBSS en gooi het weg.
    b) Voeg 1 ml trypsine toe en incubeer 2-3 minuten. Cellen moeten onder een omgekeerde microscoop worden gecontroleerd om te bepalen of ze beginnen af ​​te ronden, omhoog te gaan en te zweven. Als de cellen na 3 minuten niet zijn losgemaakt, mag u nog eens 1-2 minuten incuberen.
    c) Draai de dop vast en kantel de kolf voorzichtig heen en weer om alle cellen los te maken. De kolf kan lichtjes op de zijkant worden getikt om de cellen indien nodig los te maken.
    d) Voeg 4 ml nieuw medium toe aan de kolf zodra de cellen drijven om de trypsine te inactiveren. Spoel de zijkanten van de kolf meerdere keren af ​​met het nieuwe medium om alle cellen van het plastic en in de oplossing te wassen. Verwijder alle vloeistof die cellen bevat en breng over naar een conische vorm van 15 ml (of 50 ml als u 3 of meer kolven samenvoegt).
    e) Gebruik een steriele techniek om een ​​aliquot te verwijderen om op een hemocytometer te tellen.
    f) Terwijl u cellen telt, moet de rest van de oplossing gedurende 5 minuten bij 1000 tpm in de klinische centrifuge worden gecentrifugeerd.
  3. Nadat u het aantal cellen hebt berekend, plaatst u de cellen op 2.5 x 105 cellen per T25-filterkolf.
  4. Cellen moeten elke 2-3-dagen worden gevoed met vers groeimedium.

invriezen:

Cellen moeten op minimaal 5 x 10 worden ingevroren5 cellen / ml / cryovials in groeimedia die 10% DMSO en 30% FBS bevatten en vervolgens overnacht in een isopropanol vrieskamer bij -80 ° C. Breng de volgende dag over naar de vloeibare stikstof.

Protocol voor subcultuur en bevriezing van fibroblasten

Voor meer informatie, richt u tot:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Hoogleraar pediatrisch onderzoek Warren Alpert Medical School of Brown University en Department of Pediatrics, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Department of Anesthesia, Children's Hospital Boston en Harvard Medical School, Boston, MA medisch directeur, The Progeria Research Foundation

Telefoon: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
Leslie_Gordon@brown.edu

Wendy Norris
PRF Cell and Tissue Bank
Telefoon: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org