Scongelamento delle linee cellulari PRF

1. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua 37˚C.
2. Pulire l'esterno della fiala con 70% etanolo.
3. Trasferire le cellule scongelate in un matraccio T25 contenente 5 ml di terreno di crescita.
4. Collocare il pallone nell'incubatrice 37˚C durante la notte.
5. Il giorno seguente, osservare al microscopio per assicurarsi che le cellule si siano attaccate.
6. Rimuovere i supporti e sostituirli con nuovi supporti di crescita.

Linee cellulari PRF per sottocultura

1. Le cellule dovrebbero essere divise quando confluenti.
2. Per dividere le celle (i volumi indicati presuppongono che le celle si trovino in un T25):
   a) Utilizzando una tecnica sterile, rimuovere il supporto e sciacquare il pallone con 2-3 ml di HBSS sterile. Rimuovere e scartare HBSS.
   b) Aggiungere 1 ml di tripsina e incubare per 2-3 minuti. Le cellule devono essere controllate al microscopio invertito per determinare se hanno iniziato ad arrotondarsi, sollevarsi e galleggiare. Se le cellule non si staccano dopo 3 minuti, puoi incubare per altri 1-2 minuti.
   c) Stringere il tappo e inclinare delicatamente il pallone da un lato all'altro per rimuovere tutte le cellule. Il pallone può essere picchiettato leggermente sul lato per allentare le cellule, se necessario.
   d) Aggiungere 4 ml di nuovo terreno al pallone non appena le cellule galleggiano per inattivare la tripsina. Risciacquare più volte i lati del pallone con il nuovo mezzo per lavare tutte le cellule dalla plastica e nella soluzione. Rimuovere tutto il liquido contenente le cellule e trasferirlo in una conica da 15 ml (o 50 ml se si mettono insieme 3 o più beute).
   e) Utilizzando una tecnica sterile, rimuovere un'aliquota per il conteggio su un emocitometro.
   f) Mentre si contano le cellule, il resto della soluzione deve essere centrifugato nella centrifuga clinica per 5 minuti a 1000 rpm.
3. Dopo aver calcolato il conteggio delle celle, placca le celle su 2.5 x 10⁵ celle per pallone superiore del filtro T25.
4. Le cellule dovrebbero essere alimentate ogni 2-3 giorni con terreno di crescita fresco.

Congelamento:

Le celle devono essere congelate a non meno di 5 x 10⁵ cellule / ml / cryovial in terreni di crescita contenenti il ​​10% di DMSO e il 30% di FBS e successivamente posti in una camera di congelamento dell'isopropanolo a -80 ° C durante la notte. Trasferire nell'azoto liquido il giorno successivo.

Protocollo per subcolture e congelamento di fibroblasti