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Cellula linfoblastica

Protocolli di cultura

 

Protocollo per la coltivazione di linfociti trasformati

Dalla spedizione di celle congelate

Le cellule congelate verranno ricevute in aliquote 1 ml su ghiaccio secco. Mantieni le cellule congelate fino a quando non vengono scongelate per la coltura cellulare o conservale in un deposito di azoto liquido se non avvia subito le colture. Tuttavia, si consiglia di conservare le cellule per un uso successivo, far crescere nuove scorte e congelare più fiale. Le cellule sono crioconservate in 45% RPMI-1640, 50% siero di vitello fetale e 5% DMSO (grado di coltura tissutale).

  1. Mettere 10 ml di RPMI-1640, 15% siero di vitello fetale (FCS), ± antibiotici in un matraccio T-25.
  2. Consentire al materiale di equilibrarsi in un incubatore umidificato 37 ° C con 5% CO 2in aria per 30 minuti.
  3. Scongelare ogni fiala di cellule congelate in un bagnomaria 37 ° C o in un becher di acqua tiepida, una alla volta.
  4. Pulire rapidamente l'esterno dell'ampolla con un tampone di preparazione isopropanolo sterile, quindi avvolgere il tampone di preparazione attorno all'ampolla per proteggere le dita e rompere il sigillo sull'ampolla all'interno di una cappa di sicurezza biologica.
  5. Rimuovere il ml 1 di cellule congelate con una pipetta di vetro sterile Pasteur e posizionarlo in un matraccio T-25 con 10 ml di terreno. Etichettare chiaramente il pallone per identificare ogni linea cellulare.
  6. Collocare le cellule in un incubatore umidificato 37 ° C con 5% CO 2 nell'aria.
  7. Dopo 24 ore rimuovere 5 ml di terreno dalla cima senza disturbare i linfociti depositati sul fondo del pallone e sostituirli con 5 ml di terreno preriscaldato.
  8. Alimentare le cellule con 5 - 6 ml di terreno fresco ogni 3 - 4 giorni e dividerle in nuove colture secondo necessità.

Dalla spedizione di culture vive

  1. Le colture di linfociti vivi saranno ricevute in matracci T-25 riempiti fino in cima con RPMI-1640, 15% FCS, 1% Penicillina-Streptomicina (Gibco). I tappi saranno chiusi e sigillati con parafilm.
  2. Rimuovi il parafilm.
  3. Collocare le colture in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 in aria e lasciare che le cellule si depositino (20 – 30 minuti).
  4. Utilizzando una pipetta sterile rimuovere tutti tranne 10-15 ml di terreno e scartare.
  5. Riposizionare i tappi sui matracci leggermente allentati per consentire lo scambio di gas (Verificare che i filetti dei tappi non contengano fluidi su di essi. In tal caso, è possibile che si desideri trasferire in un nuovo matraccio.) Riposizionare le colture nell'incubatrice con 5% CO 2in aria. Dovrebbero riprendersi in un giorno o due.
  6. Alimentare le cellule con terreno fresco ogni 3 - 4 giorni risospendendo gli aggregati cellulari e rimuovendo il 50-60% del volume e sostituendo con terreno fresco. Le cellule rimosse dal pallone possono essere utilizzate per avviare nuove colture secondo necessità.

Per ulteriori informazioni si prega di contattare:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Professore di ricerca pediatrica Warren Alpert Medical School della Brown University e Dipartimento di Pediatria, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Department of Anesthesia, Children's Hospital Boston e Harvard Medical School, Boston, MA Medical Director, The Progeria Research Foundation

Telefono: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Wendy Norris
Banca di cellule e tessuti PRF
Telefono: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org