Cellula linfoblastica
Protocolli di cultura
Protocollo per la coltivazione di linfociti trasformati
Dalla spedizione di celle congelate
Le cellule congelate verranno ricevute in aliquote 1 ml su ghiaccio secco. Mantieni le cellule congelate fino a quando non vengono scongelate per la coltura cellulare o conservale in un deposito di azoto liquido se non avvia subito le colture. Tuttavia, si consiglia di conservare le cellule per un uso successivo, far crescere nuove scorte e congelare più fiale. Le cellule sono crioconservate in 45% RPMI-1640, 50% siero di vitello fetale e 5% DMSO (grado di coltura tissutale).
- Mettere 10 ml di RPMI-1640, 15% siero di vitello fetale (FCS), ± antibiotici in un matraccio T-25.
- Consentire al materiale di equilibrarsi in un incubatore umidificato 37 ° C con 5% CO 2in aria per 30 minuti.
- Scongelare ogni fiala di cellule congelate in un bagnomaria 37 ° C o in un becher di acqua tiepida, una alla volta.
- Pulire rapidamente l'esterno dell'ampolla con un tampone di preparazione isopropanolo sterile, quindi avvolgere il tampone di preparazione attorno all'ampolla per proteggere le dita e rompere il sigillo sull'ampolla all'interno di una cappa di sicurezza biologica.
- Rimuovere il ml 1 di cellule congelate con una pipetta di vetro sterile Pasteur e posizionarlo in un matraccio T-25 con 10 ml di terreno. Etichettare chiaramente il pallone per identificare ogni linea cellulare.
- Collocare le cellule in un incubatore umidificato 37 ° C con 5% CO 2 nell'aria.
- Dopo 24 ore rimuovere 5 ml di terreno dalla cima senza disturbare i linfociti depositati sul fondo del pallone e sostituirli con 5 ml di terreno preriscaldato.
- Alimentare le cellule con 5 - 6 ml di terreno fresco ogni 3 - 4 giorni e dividerle in nuove colture secondo necessità.
Dalla spedizione di culture vive
- Le colture di linfociti vivi saranno ricevute in matracci T-25 riempiti fino in cima con RPMI-1640, 15% FCS, 1% Penicillina-Streptomicina (Gibco). I tappi saranno chiusi e sigillati con parafilm.
- Rimuovi il parafilm.
- Collocare le colture in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 in aria e lasciare che le cellule si depositino (20 – 30 minuti).
- Utilizzando una pipetta sterile rimuovere tutti tranne 10-15 ml di terreno e scartare.
- Riposizionare i tappi sui matracci leggermente allentati per consentire lo scambio di gas (Verificare che i filetti dei tappi non contengano fluidi su di essi. In tal caso, è possibile che si desideri trasferire in un nuovo matraccio.) Riposizionare le colture nell'incubatrice con 5% CO 2in aria. Dovrebbero riprendersi in un giorno o due.
- Alimentare le cellule con terreno fresco ogni 3 - 4 giorni risospendendo gli aggregati cellulari e rimuovendo il 50-60% del volume e sostituendo con terreno fresco. Le cellule rimosse dal pallone possono essere utilizzate per avviare nuove colture secondo necessità.
Per ulteriori informazioni si prega di contattare:
Leslie B. Gordon, MD, PhD
Professore di ricerca pediatrica Warren Alpert Medical School della Brown University e Dipartimento di Pediatria, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Department of Anesthesia, Children's Hospital Boston e Harvard Medical School, Boston, MA Medical Director, The Progeria Research Foundation
Telefono: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
Wendy Norris
Telefono: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org