1. iPSC Informazioni di base per il non scienziato

Le cellule staminali sono cellule "immature" che non si sono ancora impegnate a diventare un tipo di cellula. Sono flessibili perché hanno il potenziale per svilupparsi in molti diversi tipi di cellule mature del corpo, come le cellule che compongono il cuore oi vasi sanguigni e altri tessuti e organi. Nel 2007, i ricercatori hanno scoperto una strategia per creare cellule staminali in laboratorio riprogrammando le cellule adulte mature che comunemente coltiviamo per scopi di ricerca.^{1, 2} . Queste cellule staminali create artificialmente sono chiamate cellule staminali pluripotenti indotte ("iPSC"). Per il campo della Progeria, questo è un enorme passo avanti. Per la prima volta, gli scienziati possono ora produrre cellule staminali Progeria e porre domande su come funzionano e si sviluppano le cellule staminali in Progeria. In precedenza non esisteva una fonte di cellule staminali Progeria umane, e quindi c'era un vuoto di informazioni su come funzionano le cellule staminali Progeria rispetto alle cellule staminali di persone senza Progeria. Inoltre, gli scienziati possono riprogrammare le cellule staminali Progeria per creare, per la prima volta, vasi sanguigni Progeria maturi, cellule cardiache e altri tipi di cellule. Fino ad ora, non esisteva alcuna fonte di cellule umane del cuore o dei vasi sanguigni Progeria.  Ora possiamo chiedere la chiave domande sulla malattia cardiaca che porta alla morte prematura nella Progeria per infarti e ictus. Possiamo confrontare queste scoperte con le malattie cardiache e l'invecchiamento nella popolazione generale e scoprire di più su ciò che influenza l'invecchiamento in tutti noi. Sono già stati pubblicati diversi studi eccellenti che utilizzano le cellule staminali Progeria.^3-5  Il nostro obiettivo alla Progeria Research Foundation è quello di facilitare molte più scoperte utilizzando questo strumento inestimabile. Per un primer sulle cellule staminali, consultare questo sito web del governo degli Stati Uniti: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Scopo della generazione e distribuzione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da parte della Progeria Research Foundation

La missione della Progeria Research Foundation è quella di scoprire i trattamenti e la cura per la sindrome di Progeria di Hutchinson-Gilford e i suoi disturbi legati all'invecchiamento. In 2009, PRF ha avviato una collaborazione con un team di scienziati esperti presso l'Università di Toronto, in Canada, sotto la direzione di William Stanford, PhD, per generare iPSC Progeria di alta qualità. Il Dr. Stanford è il Presidente della ricerca canadese in Biologia delle cellule staminali integrative. A partire da 2011, PRF continua a collaborare con il Dr. Stanford presso l'Università di Ottawa, in Canada, dove è professore di medicina cellulare e molecolare, facoltà di medicina e scienziato senior presso lo Sprott Center for Stem Cell Research dello Ottawa Hospital Research Institute.

Il nostro obiettivo è fornire questo prezioso strumento ai ricercatori di tutto il mondo. Questo nuovo strumento di ricerca verrà utilizzato per generare una ricerca nuova e innovativa nella Progeria, nonché il suo rapporto con le malattie cardiache e l'invecchiamento.  

3. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte dalla sindrome di Hutchinson-Gilford (iPSC)

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono state derivate utilizzando la trasduzione retrovirale pseudotipata VSVG di quattro fattori umani, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc in fibroblasti. Le colonie iPSC sono state derivate su fibroblasti embrionali di topo (MEF). La procedura utilizzata era essenzialmente come descritta in precedenza ma senza l'uso del reporter EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Controllo di qualità: convalida e caratterizzazione

Le righe attualmente disponibili sono state sottoposte a diversi passaggi di convalida (vedere i PDF scaricabili di seguito):

5. Materiale di partenza originale da cui sono state derivate queste cellule iPS

Le iPSC sono state derivate da linee cellulari di fibroblasti non trasformate di PRF Cell & Tissue Bank.

Il metodo di trasduzione utilizzato per tutte le linee iPS era Retrovirus MKOS.

ID linea iPSC	Mutazione	Genere e donazione Età	Tipo di cellula originaria CLICCA QUI.	Dati di supporto
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Maschio 2yr 0mo	Fibroblasti cutanei HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Maschio 2yr 0mo	Fibroblasti cutanei HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Maschio 2yr 0mo	Fibroblasti cutanei HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Maschio 8yr 5mo	Fibroblasti cutanei HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Maschio 8yr 5mo	Fibroblasti cutanei HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Mother of HGADFN167 (non interessato)	Femmina 37yr 10mo	Fibroblasti cutanei HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Mother of HGADFN167 (non interessato)	Femmina 37yr 10mo	Fibroblasti cutanei HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Padre di HGADFN167 (non interessato)	Maschio 40yr 5mo	Fibroblasti cutanei HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Padre di HGADFN167 (non interessato)	Maschio 40yr 5mo	Fibroblasti cutanei HGFDFN168	168 iPS1P

6. Iscriviti alla nostra mailing list per futuri aggiornamenti iPSC e nuove linee cellulari

Stiamo continuando a generare linee iPSC. Se desideri aggiornamenti periodici sugli iPSC detenuti nella PRF Cell & Tissue Bank, iscriviti alla nostra mailing list facendo clic su qui

7. Domande?

Si prega di contattare Leslie Gordon, MD, PhD, direttore medico, per qualsiasi domanda o necessità, a lgordon@progeriaresearch.org o 978-535-2594

8. Ordinazione di linee cellulari iPS

In 2014, PRF ha istituito una politica di nessuna modifica al nostro MTA. Questo è il risultato degli anni 12 di accordi contrattuali con i team di ricerca 70 che lavorano presso istituzioni nei paesi 14. PRF e i suoi consulenti hanno preso in considerazione le questioni sorte in quel periodo di tempo e hanno modificato l'accordo di conseguenza, dando luogo a ciò che riteniamo termini eque e ragionevoli.

Per le istituzioni o le domande del governo federale degli Stati Uniti, contattare Wendy Norris all'indirizzo: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Passaggio 1: completare un accordo di trasferimento di materiale e domanda

Applicazione e accordo per le istituzioni non governative

Accordo di trasferimento materiale per istituzioni non governative

Passo 2: Restituire la domanda compilata e l'accordo di trasferimento del materiale a Wendy Norris all'indirizzo wnorris@lifespan.org. Una volta approvato, riceverai un'e-mail di conferma dell'ordine e data di spedizione anticipata. 

Passo 3: Il laboratorio del Dr. Stanford sta attualmente distribuendo linee in cryovial congelati. Il suo laboratorio ti invierà un'email quando la coltura è stata spedita, con le informazioni di spedizione e tracciabilità. I ricercatori inesperti sono diretti a ottenere una formazione in corsi specializzati essenziali per il lavoro sulle cellule staminali embrionali umane / iPSC.

La struttura di cellule staminali pluripotenti umane (diretta dal Dr. Stanford) presso l'Ottawa Hospital Research Institute offre una formazione virtuale individuale sulle basi delle tecniche di coltura iPSC specifiche per le linee cellulari di Progeria iPSC. Le opzioni e il formato della formazione sono flessibili a seconda del livello di esperienza degli scienziati.  Per ulteriori informazioni, inviare un'e-mail a hpscf@ohri.ca.

Passaggio 4: l'Università di Ottawa ti fatturerà direttamente per ogni linea iPSC più i costi del corriere, se presenti.

9. Preparazione di terreni di coltura cellulare HGPS e iPS di controllo

iPSC ed ESC devono essere alimentati con mTeSR Plus di Stem Cell Technologies (cat# 5825). Si prega di seguire le raccomandazioni del fornitore per la conservazione.

10. Preparazione delle piastre Matrigel

Note:: Tutti i passaggi che coinvolgono matrigel devono essere eseguiti il ​​più rapidamente possibile e devono rimanere il più freddi possibile.

1. Scongelare la bottiglia di matrigel a 4°C. Controllare il certificato di analisi su quel lotto per trovarne la concentrazione proteica.
2. Aggiungere abbastanza supporti DMEM/F12 freddi al matrigel scongelato per raggiungere una concentrazione finale di 5 mg/mL.
3. Preparare aliquote da 1 ml del matrigel preparato dal passaggio 2 in tubi di falco pre-refrigerati da 15 ml.
4. Congela e conserva tutte le aliquote a -20°C.
5. Per realizzare piastre matrigel, rimuovere un'aliquota di matrigel (1 ml) da -20°C e aggiungere 10 ml di DMEM/F12 freddo. Mescolare bene fino allo scongelamento del pellet (senza creare bolle e mantenere sempre la soluzione fredda).
6. Trasferire in una provetta da 50 ml, quindi aggiungere 20 ml di DMEM/F12 freddo (1 ml di aliquota di matrigel viene diluito in 30 ml di DMEM/F12), mescolare bene.
7. Piastra (1 ml/pozzetto per piastra a 6 pozzetti, 0.5 ml/pozzetto per piastra a 12 pozzetti, 0.25 ml/pozzetto per piastra a 24 pozzetti). Assicurarsi che la soluzione copra l'intera superficie agitando delicatamente la piastra. Non ricongelare il matrigel avanzato.
8. Se si utilizza il piatto immediatamente, lasciare riposare il piatto a temperatura ambiente per 1 ora (o 30 minuti a 37°C), osservare matrigel al microscopio. Matrigel deve essere ben disperso e non “grumoso”.
9. Se si utilizzano i piatti in un altro momento, avvolgere il bordo del piatto con parafilm e conservare a 4°C per un massimo di 2 settimane.

Matrigel - BD / Fisher, gatto # CB-40230

DMEM / F12 - Life Technologies, cat # 11330-057

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11 Scongelamento di cellule ES o iPS (per crio-fiala)

1. Prendere una piastra matrigel fuori da 4°C e scaldarla a temperatura ambiente per un'ora, oppure preparare una piastra matrigel fresca (vedere il protocollo per la preparazione della piastra matrigel).
2. Scaldare 4 ml di mTeSR Plus in una provetta Falcon da 15 ml.
3. Rimuovere le cellule dal serbatoio di azoto liquido e agitare in un bagno a 37 ° C fino a quando rimane solo un piccolo pezzo di ghiaccio. La fiala dovrebbe scongelarsi in 1-2 minuti. Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente.
4. Provetta per cella a etanolo e provetta per falco e posizionarla nella cappa.
5. Usa 1 ml punta della bocca larga per lentamente aggiungere le cellule a 4 ml di supporti preriscaldati (evitare di mescolare la sospensione cellulare).
6. Gira a 130 rcf per 5 minuti.
7. Rimuovere il supernatante.
8. Aggiungere 2 ml di supporto PSC e con una punta a bocca larga rompere delicatamente i grumi. Trasferire i media in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti aggiungere 2ul di inibitore ROCK (Y27632, concentrazione finale di 10uM). Piatto in un matrigel rivestito bene (di una piastra da 6 pozzetti).
9. Le cellule rocciose delicatamente per distribuire uniformemente le cellule e collocarle in un'incubatrice ipossica (5% O₂, 10% CO₂). Evitare il disturbo della piastra per 24 ore dopo la semina.

   NOTA: È molto importante evitare la rottura eccessiva dei grumi o il pipettaggio aggressivo. Questo può ridurre significativamente il tasso di sopravvivenza. Le cellule dovrebbero rimanere in blocchi di 100-300 cellule grandi al momento della semina. Pur essendo delicato, prova a lavorare rapidamente una volta scongelate le cellule per ridurre al minimo il tempo in cui sono a contatto con il crioprotettore.​

10. Rimuovere i supporti dopo 24 ore e aggiungere 2 ml di supporti PSC (per 6 pozzetti, 1 ml per 12 pozzetti e 0.5 ml per 24 pozzetti). Vedere Raccolta e cura del protocollo hESC/iPSC.

Supporti PSC

mTeSR Plus di Stem Cell Technologies (cat# 5825). Si prega di seguire le raccomandazioni del fornitore per la conservazione.

Che cos'è ROCK Inhibitor Y27632?

ROCK Inhibitor Y27632 è un inibitore selettivo della chinasi p160 ROCK associata a Rho. Il trattamento con ROCK Inhibitor Y27632 previene l'apoptosi indotta dalla dissociazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) e delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC), aumentando il tasso di sopravvivenza e mantenendo la pluripotenza durante la subcoltivazione e lo scongelamento di hESC e hiPSC. È stato inoltre dimostrato che l'inibitore ROCK Y27632 migliora il tasso di sopravvivenza delle cellule staminali durante la crioconservazione. Si noti che le aliquote dell'inibitore Rock sono sensibili alla luce e ai cicli di disgelo ripetitivi. Assicurati di utilizzare queste aliquote entro la durata di conservazione consigliata dal fornitore.

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12 Raccolta e cura di hESC/ iPSC

1. Il giorno dopo lo scongelamento delle cellule, osservale al microscopio per determinare il tasso di sopravvivenza. NOTA: è normale osservare un numero elevato di cellule staccate. Finché alcune cellule sono attaccate, le colonie possono nascere da esse entro 3-7 giorni.
2. Rimuovere i supporti dai pozzetti e pipettare 2 ml (per un 6 pozzetti, 1 ml per 12 pozzetti e 0.5 ml per 24 pozzetti) di supporti PSC freschi e caldi per pozzetto. Riportare la piastra nell'incubatrice.
3. Le cellule vengono alimentate fino al 60-70% di confluenza (seguire le raccomandazioni del fornitore).
4. A partire dal secondo giorno, le cellule dovrebbero essere osservate e ripulite da eventuali cellule differenziate che potrebbero crescere.
5. Per pulire le cellule, utilizzare la cappa di raccolta e raschiare le cellule differenziate con un puntale.
6. Una volta che le celle sono state pulite, cambiare il supporto come fatto nei passaggi precedenti.

(Vedere Congelamento hESC/iPSC o Passaggio hESC/iPSC)

NOTA:

Il supporto PSC è stato determinato per essere più efficiente in un ambiente ipossico. Abbiamo anche osservato che si verifica una minore differenziazione quando le cellule vengono coltivate in incubatrici ipossiche rispetto a normossiche. Infine, le cellule seminate hanno un tasso di sopravvivenza migliore quando si utilizza un'incubatrice ipossica.

normossico: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

ipossico: 37°C, 5% O₂, 10% CO₂

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13 Superamento di hESC/iPSC

1. Aggiungere 2 ml di supporti PSC a una piastra rivestita di matrigel da 6 pozzetti e mettere da parte.
2. Prendere la piastra da far passare e rimuovere il supporto dal pozzo e lavare una volta con 1 ml di PBS(-/-).
3. Aggiungere 1 ml di soluzione di EDTA nel pozzetto e lasciare per 3-4 minuti a temperatura ambiente. Non spostare la piastra perché le cellule possono iniziare a staccarsi.
4. Rimuovere la soluzione EDTA e aggiungere 1 ml di supporto PSC. Non lasciare EDTA sulle cellule per più di 4 minuti in quanto ciò causerà il sollevamento delle cellule.
5. Raschiare le cellule utilizzando un raschietto cellulare e dividere le cellule tra i 6 pozzetti della piastra contenenti supporti PSC. Evita la rottura eccessiva dei pezzi della colonia e cerca di essere gentile con la raschiatura. Cerca di mantenere le cellule in grossi pezzi. Utilizzare una punta di pipetta a bocca larga per rompere i grumi, se necessario. Un'eccessiva rottura delle cellule può causare la morte cellulare o un'eccessiva differenziazione spontanea dopo il passaggio.
6. Incubare a 37°C dopo aver distribuito uniformemente le cellule in ciascun pozzetto (8 figure o scuotimento a forma di L). Evitare il disturbo della placca per 24 ore dopo il passaggio.

NOTA: Una volta che le cellule sono state raschiate, trasferirle sulla nuova piastra il prima possibile perché le cellule si ricollegheranno rapidamente (entro 5 minuti).

Se EDTA viene lasciato sulle cellule per più di 4 minuti, le cellule possono iniziare a staccarsi. Se ciò accade, raccogli semplicemente le cellule in un falco da 15 ml con 4 ml di supporto PSC. Spin celle a 130 rcf per 5 minuti. Risospendere il pellet con 1 ml di supporto e dividerlo uniformemente in una piastra rivestita di matrigel da 6 pozzetti (160 ul per pozzetto).

Soluzione EDTA: aggiungere 500 ul di EDTA 0.5 M (pH 8.0) in 500 ml di DPBS (-/-). Aggiungere 0.9 g di NaCl. Filtrare la soluzione da sterilizzare e conservarla a 4°C per un massimo di 6 mesi.

Dalla carta:

Espansione del passaggio e delle colonie di cellule staminali pluripotenti umane mediante dissociazione senza enzimi in condizioni di coltura definite chimicamente

Jeanette Beers,¹ Daniel R. Gulbranson,^2,3 Nicole George,⁴Lauren I. Siniscalchi,¹ Jeffrey Jones,^4,5 James A. Thomson,^2,3,6 ed Guokai Chen^1,2

14 Congelamento hESC/iPSC

1. Accendere Bio-Cool (congelatore a velocità controllata) e regolare la temperatura a -7°C.
2. Rimuovere le cellule dall'incubatrice e osservare la confluenza e la morfologia al microscopio.
3. Se i pozzetti sono confluenti al 70%, rimuovere i vecchi supporti e lavare una volta con PBS(-/-), quindi aggiungere 1 mL di soluzione di EDTA (vedi passaggio con la soluzione di EDTA) per pozzetto.
4. Incubare a temperatura ambiente per 3-4 minuti.
5. Aspirare la soluzione di EDTA e aggiungere 1 ml di supporto mFreSR freddo (cat#05855, Stem Cell Technologies).
6. Utilizzare un raschietto cellulare per sollevare delicatamente le cellule. Mantenere le cellule in grandi pezzi il più possibile ed evitare di pipettare su e giù.
7. Trasferire le cellule/mFreSR in un criotubo utilizzando una punta a bocca larga. Conservare le fiale in ghiaccio fino al momento del passaggio 8.
8. Mettere le provette in Bio-Cool e incubare per 10 minuti.
9. Ottieni azoto liquido.
10. Dopo 10 minuti, seminare le cellule immergendo una spatola nell'azoto liquido e toccando il lato della criofiala per circa 10-30 secondi o finché non si vede una forma cristallina sul lato della criofiala.
11. Avviare il programma 1 premendo il tasto “PROG” e proseguendo il programma premendo nuovamente il tasto si dovrebbe vedere la velocità di 0.5°C/min. , quindi premere "Esegui".
12. Una volta che la temperatura raggiunge i -65°C, i criotubi possono essere trasferiti e conservati in azoto liquido.

Alternative

Un'altra opzione consiste nel posizionare le crio-provette in un contenitore di congelamento (Biocision-CoolCell) e conservarle a -80°C per una notte. Spostare i crio-tubi in azoto liquido (fase liquida o vapore) il giorno successivo.

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