tripsina

Tripsina EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

La soluzione salina bilanciata di Hank

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) cloruro di calcio, (-) cloruro di magnesio, (-) solfato di magnesio)

DMSO per il congelamento

Grado di coltura cellulare DMSO

Le cellule arriveranno congelate su ghiaccio secco ad una concentrazione di circa 5 x 10⁵cellule / fiala

Protocollo per lo scongelamento dei fibroblasti

1. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua 37 ° C.
2. Pulire l'esterno della fiala con 70% etanolo.
3. Trasferire le cellule scongelate in un matraccio T25 contenente 5 ml di terreno di crescita senza puromicina.
4. Collocare il pallone nell'incubatrice 37 ° C durante la notte.
5. Il giorno seguente, osservare al microscopio per assicurarsi che le cellule si siano attaccate.
6. Rimuovere i supporti e sostituirli con nuovi supporti di crescita.

Linee cellulari PRF per sottocultura

1) Una volta che le cellule sono state stabilite e in crescita, iniziare a utilizzare terreni contenenti 0.75 μg / ml di puromicina. Continuare a mantenere le cellule nei media contenenti 0.75 μg / ml di puromicina.

2) Le celle devono essere divise quando confluenti.

3) Per dividere le celle (i volumi indicati presuppongono che le celle si trovino in un T25):

A. Usando la tecnica sterile, rimuovere il materiale e sciacquare il pallone con 2-3 ml di HBSS sterile. Rimuovere ed eliminare HBSS.

B. Aggiungere 1 ml di tripsina e incubare per 2-3 minuti. Le cellule dovrebbero essere controllate al microscopio invertito per determinare se hanno iniziato ad arrotondare, sollevare e galleggiare. Se le cellule non vengono staccate dopo 3 minuti, è possibile incubare altri 1-2 minuti

C. Stringere il tappo e inclinare delicatamente il pallone da un lato all'altro per rimuovere tutte le celle. Il pallone può essere picchiettato leggermente sul lato per allentare le cellule se necessario.

D. Aggiungere 4 ml di nuovo media nel pallone non appena le cellule galleggiano per inattivare la tripsina. Risciacquare più volte i lati del pallone con il nuovo supporto per lavare tutte le cellule dalla plastica e nella soluzione. Rimuovere tutte le cellule contenenti liquido e trasferirle in un 15ml conico (o 50 ml se si raggruppano 3 o più boccette).

E. Utilizzando una tecnica sterile, rimuovere un'aliquota per contare su un emacitometro.

F. Durante il conteggio delle cellule, il resto della soluzione deve essere centrifugato nella centrifuga clinica per 5 minuti a 1000 rpms.

4) Dopo aver calcolato il conteggio delle cellule, placca le celle a 2.5 x 10⁵ celle per il pallone superiore del filtro T 25.

5) Le cellule devono essere alimentate ogni 2-3 giorni con terreno di crescita fresco contenente 0.75 μg / ml di puromicina.

Congelamento:

Le celle devono essere congelate a non meno di 5x 10⁵ cellule / ml / cryovial nei mezzi di crescita contenente 10% DMSO e 30% FBS senza puromicina e successivamente posto in una camera di congelamento isopropanolo a -80 ° C durante la notte. Trasferimento nell'azoto liquido il giorno successivo.

Wendy Norris