ಪುಟ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ

ಅಮರ ಕೋಶ

ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ಗಳು

 

ಅಮರ ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್

ಪಿಆರ್ಎಫ್ ಸೆಲ್ ಮತ್ತು ಟಿಶ್ಯೂ ಬ್ಯಾಂಕ್‌ಗೆ ಅಮರ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಉದಾರವಾಗಿ ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ ಮತ್ತು ಒದಗಿಸಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಹಾರ್ವರ್ಡ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾಲಯದ ಡಾ. ಮಾರ್ಟಿನ್ ಡಾರ್ಫ್ ಅವರಿಗೆ ಧನ್ಯವಾದಗಳು. ಧನ್ಯವಾದಗಳು.

ಈ ಕೆಳಗಿನ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಬಳಸಿ ಪಿಆರ್ಎಫ್ ಸೆಲ್ ರೇಖೆಗಳನ್ನು ಅಮರಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು:

ರೆಟ್ರೊವೈರಸ್ ಸೋಂಕು

ಎ. ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ವೈರಸ್: ವರ್ಗಾವಣೆಗೆ 12-24 ಗಂ ಮೊದಲು, ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ HEK293 ಕೋಶಗಳನ್ನು 100-ಎಂಎಂ ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ 60-80% ಸಂಗಮದಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು 12μg ರೆಟ್ರೊವೈರಲ್ ಕನ್ಸ್ಟ್ರಕ್ಟ್ pBABE-puro (SV40T) ಮತ್ತು 12μg pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector ನೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ವರ್ಗಾವಣೆಯ ನಂತರ 8-10 ಗಂಗೆ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಅಪೇಕ್ಷಿಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಅದರ ಬದಲಿಗೆ 10 ಮಿಲಿ ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ನೀಡಲಾಯಿತು. ಸೂಕ್ತವಾದ ವೈರಲ್ ಟೈಟರ್ ಪಡೆಯಲು ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚುವರಿ 48-72 ಗಂಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು.

ಬಿ. ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸೋಂಕು ತಗುಲಿಸುವುದು: ಗುರಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸೋಂಕಿನ ಮೊದಲು 100-12 ಗಂಗೆ 18 ಎಂಎಂ ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಯಿತು. ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಕೋಶಗಳಿಂದ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು 0.45-cellm ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಸಿಟೇಟ್ ಅಥವಾ ಪಾಲಿಸಲ್ಫೋನಿಕ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು. ಜೀವಕೋಶಗಳು 40-60% ಸಂಗಮವಾದ ನಂತರ, 8 ಮಿಲಿ ವೈರಸ್-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ 10 μg / ml ಪಾಲಿಬ್ರೆನ್ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಮೂರು ಸುತ್ತಿನ ಸೋಂಕನ್ನು ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, h 12 ಗಂಟೆಗಳ ಅಂತರದಲ್ಲಿ. 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ನಂತರ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು.

ಸಿ. ಸ್ಥಿರ ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳ ಆಯ್ಕೆ: ಸೋಂಕಿನ ನಂತರ 72 ಗಂ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಟ್ರಿಪ್ಸೈನೈಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, 1: 3 ಕ್ಕೆ ವಿಭಜಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 100 μg / ml ಪ್ಯೂರೊಮೈಸಿನ್ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಎರಡು 3 ಎಂಎಂ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು, ಜೊತೆಗೆ ಪ್ರತಿಜೀವಕವಿಲ್ಲದ ಒಂದು ನಿಯಂತ್ರಣ ಫಲಕ. ಸ್ಥಿರವಾದ ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಸುಮಾರು 2 ರಿಂದ 3 ವಾರಗಳವರೆಗೆ ಪ್ರತಿ 2 ಅಥವಾ 4 ದಿನಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು.

 

ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮ

DMEM- ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್ # 11960-044 (ಎಲ್-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ ಇಲ್ಲದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್)

15% FBS ಭ್ರೂಣದ ಬೋವಿನ್ ಸೀರಮ್

1% (1x) ಪೆನಿಸಿಲಿನ್-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್ # 15140-122)

1% (1X) ಎಲ್-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್ # 25030-081)

0.75 μg / ml ಪ್ಯೂರೊಮೈಸಿನ್ (ಇನ್ವಿವೊಜೆನ್ # ಇರುವೆ- pr-1)

ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್

ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಇಡಿಟಿಎ ಸಿ .25% (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್ # 25200-056)

ಹ್ಯಾಂಕ್‌ನ ಸಮತೋಲಿತ ಉಪ್ಪು ಪರಿಹಾರ

ಎಚ್‌ಬಿಎಸ್‌ಎಸ್- (ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್ # 14170 (1 ಎಕ್ಸ್) (-) ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಕ್ಲೋರೈಡ್, (-) ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಕ್ಲೋರೈಡ್, (-) ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಸಲ್ಫೇಟ್)

ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆಗಾಗಿ ಡಿಎಂಎಸ್ಒ

ಸೆಲ್ ಕಲ್ಚರ್ ಗ್ರೇಡ್ ಡಿಎಂಎಸ್ಒ

ಸರಿಸುಮಾರು 5 x 10 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳು ಒಣಗಿದ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟುತ್ತವೆ5ಜೀವಕೋಶಗಳು / ಸೀಸೆ

ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸುವ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್

  1. 37 water C ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವೇಗವಾಗಿ ಕರಗಿಸಿ.
  2. 70% ಎಥೆನಾಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಸೀಸೆಯ ಹೊರಭಾಗವನ್ನು ತೊಡೆ.
  3. ಕರಗಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ಯುರೊಮೈಸಿನ್ ಇಲ್ಲದೆ 25 ಮಿಲಿ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ T5 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
  4. ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 37 inc C ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್ನಲ್ಲಿ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಇರಿಸಿ.
  5. ಮರುದಿನ, ಜೀವಕೋಶಗಳು ಲಗತ್ತಿಸಿವೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿ.
  6. ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ತಾಜಾ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿ.

ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪಿಆರ್ಎಫ್ ಸೆಲ್ ರೇಖೆಗಳು

1) ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸ್ಥಾಪನೆಯಾದಾಗ ಮತ್ತು ಬೆಳೆಯುತ್ತಿರುವಾಗ, 0.75 μg / ml ಪ್ಯೂರೊಮೈಸಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬಳಸಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ. 0.75 μg / ml ಪ್ಯೂರೊಮೈಸಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿನ ಕೋಶಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವುದನ್ನು ಮುಂದುವರಿಸಿ.

2) ಸಂಗಮವಾದಾಗ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸಬೇಕು.

3) ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸಲು (ಕೊಟ್ಟಿರುವ ಸಂಪುಟಗಳು ಜೀವಕೋಶಗಳು T25 ನಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು are ಹಿಸುತ್ತವೆ):

ಎ. ಬರಡಾದ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಎಚ್‌ಬಿಎಸ್‌ಎಸ್‌ನ 2-3 ಮಿಲಿ ಯೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ. HBSS ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ತ್ಯಜಿಸಿ.

B. 1 ml ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 2-3 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ. ಕೋಶಗಳನ್ನು ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಬೇಕು, ಅವುಗಳು ಸುತ್ತುವರಿಯಲು, ಎತ್ತುವ ಮತ್ತು ತೇಲುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿವೆ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು. 3 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸದಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಇನ್ನೊಂದು 1-2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಬಹುದು

ಸಿ. ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸ್ಥಳಾಂತರಿಸಲು ಕ್ಯಾಪ್ ಅನ್ನು ಬಿಗಿಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ನಿಧಾನವಾಗಿ ತುದಿಯನ್ನು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಮಾಡಿ. ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಡಿಲಗೊಳಿಸಲು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ಬದಿಯಲ್ಲಿ ಲಘುವಾಗಿ ಟ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಬಹುದು.

ಡಿ. ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಕೋಶಗಳು ತೇಲುತ್ತಿರುವ ತಕ್ಷಣ ಹೊಸ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು 4 ಮಿಲಿ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗೆ ಸೇರಿಸಿ. ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್‌ನಿಂದ ತೊಳೆಯಲು ಮತ್ತು ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ ಹೊಸ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ನ ಬದಿಗಳನ್ನು ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ. ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ದ್ರವಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 15ml ಶಂಕುವಿನಾಕಾರಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ (ಅಥವಾ ನೀವು 50 ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂಲ್ ಮಾಡುತ್ತಿದ್ದರೆ 3 ml).

ಇ. ಬರಡಾದ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಹೆಮಾಸೈಟೋಮೀಟರ್ ಅನ್ನು ಎಣಿಸಲು ಆಲ್ಕೋಟ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ.

ಎಫ್. ನೀವು ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎಣಿಸುತ್ತಿರುವಾಗ, ಉಳಿದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಯಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1000 rpms ನಲ್ಲಿ ತಿರುಗಿಸಬೇಕು.

4) ನಿಮ್ಮ ಕೋಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ನಂತರ, ಪ್ಲೇಟ್ ಕೋಶಗಳು 2.5 x 105 ಪ್ರತಿ T 25 ಫಿಲ್ಟರ್ ಟಾಪ್ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಕೋಶಗಳು.

5) ಪ್ರತಿ 2-3 ದಿನಗಳಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ 0.75 / g / ml ಪ್ಯೂರೊಮೈಸಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ ತಾಜಾ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಆಹಾರವನ್ನು ನೀಡಬೇಕು.

ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆ:

ಕೋಶಗಳನ್ನು 5x 10 ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿಲ್ಲ5 ಜೀವಕೋಶಗಳು / ಮಿಲಿ / ಕ್ರಯೋವಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ 10% DMSO ಮತ್ತು 30% FBS ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ ಪ್ಯೂರೊಮೈಸಿನ್ ಇಲ್ಲದೆ ತದನಂತರ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ -80 at C ನಲ್ಲಿ ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಘನೀಕರಿಸುವ ಕೊಠಡಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮರುದಿನ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.

ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ ದಯವಿಟ್ಟು ಸಂಪರ್ಕಿಸಿ:

ಲೆಸ್ಲಿ ಬಿ. ಗಾರ್ಡನ್, ಎಂಡಿ, ಪಿಎಚ್‌ಡಿ

ಪೀಡಿಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ರಿಸರ್ಚ್ ಪ್ರಾಧ್ಯಾಪಕ ವಾರೆನ್ ಆಲ್ಪರ್ಟ್ ಮೆಡಿಕಲ್ ಸ್ಕೂಲ್ ಆಫ್ ಬ್ರೌನ್ ಯೂನಿವರ್ಸಿಟಿ ಮತ್ತು ಪೀಡಿಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ವಿಭಾಗ, ಹಸ್ಬ್ರೋ ಮಕ್ಕಳ ಆಸ್ಪತ್ರೆ, ಪ್ರಾವಿಡೆನ್ಸ್, ಆರ್ಐ ಅರಿವಳಿಕೆ ಇಲಾಖೆ, ಮಕ್ಕಳ ಆಸ್ಪತ್ರೆ ಬೋಸ್ಟನ್ ಮತ್ತು ಹಾರ್ವರ್ಡ್ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಶಾಲೆ, ಬೋಸ್ಟನ್, ಎಂಎ ವೈದ್ಯಕೀಯ ನಿರ್ದೇಶಕ, ದಿ ಪ್ರೊಜೀರಿಯಾ ರಿಸರ್ಚ್ ಫೌಂಡೇಶನ್

ದೂರವಾಣಿ: 978-535-2594
ಫ್ಯಾಕ್ಸ್: 508 543 0377-
lgordon@progeriaresearch.org

ವೆಂಡಿ ನಾರ್ರಿಸ್
ಪಿಆರ್ಎಫ್ ಸೆಲ್ ಮತ್ತು ಟಿಶ್ಯೂ ಬ್ಯಾಂಕ್
ಫೋನ್: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org

ಸೈನ್ ಅಪ್

ನಮ್ಮ

ಸುದ್ದಿಪತ್ರ!

ಈಗ ಸೈನ್ ಅಪ್ ಮಾಡಿ

ಒಟ್ಟಿಗೆ, ನಾವು

ವಿಲ್

ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಹುಡುಕಿ!

ಈಗ ನೀಡಿ