ಅಮರ ಕೋಶ

ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ಗಳು

ಇಮ್ಮಾರ್ಟಲೈಸ್ಡ್ ಸೆಲ್ ಕಲ್ಚರ್ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್

PRF ಸೆಲ್ ಮತ್ತು ಟಿಶ್ಯೂ ಬ್ಯಾಂಕ್‌ಗೆ ಅಮರವಾದ ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳನ್ನು ಉದಾರವಾಗಿ ಉತ್ಪಾದಿಸಿದ ಮತ್ತು ಒದಗಿಸಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಹಾರ್ವರ್ಡ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾನಿಲಯದ ಡಾ ಮಾರ್ಟಿನ್ ಡಾರ್ಫ್ ಅವರಿಗೆ ನಾವು ಧನ್ಯವಾದಗಳು. ಧನ್ಯವಾದಗಳು.

ಕೆಳಗಿನ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು PRF ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳನ್ನು ಅಮರಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ:

ರೆಟ್ರೋವೈರಸ್ ಸೋಂಕು

A. ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ವೈರಸ್: ವರ್ಗಾವಣೆಗೆ 12-24 ಗಂಟೆಗಳ ಮೊದಲು, ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ HEK293 ಕೋಶಗಳನ್ನು 60-80% ಸಂಗಮದಲ್ಲಿ 100-ಎಂಎಂ ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ರತಿ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು 12μg ರೆಟ್ರೊವೈರಲ್ ಕನ್ಸ್ಟ್ರಕ್ಟ್ pBABE-puro (SV40T) ಮತ್ತು 12μg pCL-Ampho Retrovirus ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ವೆಕ್ಟರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ವರ್ಗಾವಣೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ವರ್ಗಾವಣೆಯ ನಂತರ 8-10 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಆಕಾಂಕ್ಷೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 10ml ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು. ಸೂಕ್ತವಾದ ವೈರಲ್ ಟೈಟರ್ ಅನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚುವರಿ 48-72 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಲಾಯಿತು.

ಬಿ. ಗುರಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸೋಂಕು ಮಾಡುವುದು: ಸೋಂಕಿನ 12-18 ಗಂಟೆಗಳ ಮೊದಲು ಗುರಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು 100 ಎಂಎಂ ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಲೇಪಿಸಲಾಗಿದೆ. ಪ್ಯಾಕೇಜಿಂಗ್ ಕೋಶಗಳಿಂದ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು 0.45-μm ಸೆಲ್ಯುಲೋಸ್ ಅಸಿಟೇಟ್ ಅಥವಾ ಪಾಲಿಸಲ್ಫೋನಿಕ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಒಮ್ಮೆ ಜೀವಕೋಶಗಳು 40-60% ಸಂಗಮವಾಗಿದ್ದರೆ, 10 μg/ml ಪಾಲಿಬ್ರೆನ್‌ನ ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ 8 ಮಿಲಿ ವೈರಸ್-ಹೊಂದಿರುವ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು. ಮೂರು ಸುತ್ತಿನ ಸೋಂಕನ್ನು ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ~ 12 ಗಂಟೆಗಳ ಅಂತರದಲ್ಲಿ. 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ನಂತರ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸಲಾಯಿತು.

C. ಸ್ಥಿರ ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳ ಆಯ್ಕೆ: ಸೋಂಕಿನ ನಂತರ 72 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಟ್ರಿಪ್ಸಿನೈಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, 1:3 ನಲ್ಲಿ ವಿಭಜಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 3 μg/ml puromycin ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಎರಡು 100 mm ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು, ಜೊತೆಗೆ ಒಂದು ನಿಯಂತ್ರಣ ಫಲಕವು ಪ್ರತಿಜೀವಕವಿಲ್ಲದೆ. ಸ್ಥಿರ ಕೋಶ ರೇಖೆಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಸುಮಾರು 2 ರಿಂದ 4 ವಾರಗಳವರೆಗೆ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಪ್ರತಿ 2 ಅಥವಾ 3 ದಿನಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮಾಧ್ಯಮ

DMEM- ಇನ್ವಿಟ್ರೋಜನ್ #11960-044 (ಎಲ್-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ ಇಲ್ಲದೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್)

15% FBS ಫೆಟಲ್ ಬೋವಿನ್ ಸೀರಮ್

1% (1x) ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (Invitrogen#15140-122)

1% (1X) L-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ (Invitrogen#25030-081)

0.75 μg/ml puromycin (InvivoGen #ant-pr-1)

ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್

ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

ಹ್ಯಾಂಕ್ಸ್ ಸಮತೋಲಿತ ಉಪ್ಪು ಪರಿಹಾರ

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಕ್ಲೋರೈಡ್, (-)ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಕ್ಲೋರೈಡ್, (-) ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಸಲ್ಫೇಟ್)

ಘನೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ DMSO

ಸೆಲ್ ಕಲ್ಚರ್ ಗ್ರೇಡ್ DMSO

ಕೋಶಗಳು ಸುಮಾರು 5 x 10 ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಡ್ರೈ ಐಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದವು⁵ಜೀವಕೋಶಗಳು / ಸೀಸೆ

ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸಲು ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್

37 ° C ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಕರಗಿಸಿ.
70% ಎಥೆನಾಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಬಾಟಲಿಯ ಹೊರಭಾಗವನ್ನು ಒರೆಸಿ.
ಪ್ಯುರೊಮೈಸಿನ್ ಇಲ್ಲದೆ 5 ಮಿಲಿ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ T25 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗೆ ಕರಗಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು 37 ° C ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ.
ಮರುದಿನ, ಜೀವಕೋಶಗಳು ಲಗತ್ತಿಸಿರುವುದನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿ.
ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ತಾಜಾ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿ.

ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ PRF ಸೆಲ್ ಲೈನ್‌ಗಳು

1) ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಿದಾಗ ಮತ್ತು ಬೆಳೆಯುವಾಗ, 0.75 μg/ml puromycin ಹೊಂದಿರುವ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಬಳಸಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿ. 0.75 μg/ml puromycin ಹೊಂದಿರುವ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಮುಂದುವರಿಸಿ.

2) ಸಂಗಮವಾದಾಗ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸಬೇಕು.

3) ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸಲು (ಪರಿಮಾಣಗಳು ಕೋಶಗಳು T25 ನಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ):

A. ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 2-3 ಮಿಲಿ ಸ್ಟೆರೈಲ್ HBSS ನೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ. HBSS ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ತ್ಯಜಿಸಿ.

B. 1 ಮಿಲಿ ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 2-3 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ. ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸುತ್ತುವರಿಯಲು, ಎತ್ತಲು ಮತ್ತು ತೇಲಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿವೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕು. 3 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸದಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಇನ್ನೊಂದು 1-2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಬಹುದು

C. ಕ್ಯಾಪ್ ಅನ್ನು ಬಿಗಿಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೊರಹಾಕಲು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ಅಕ್ಕಪಕ್ಕಕ್ಕೆ ನಿಧಾನವಾಗಿ ತಿರುಗಿಸಿ. ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಡಿಲಗೊಳಿಸಲು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ಬದಿಯಲ್ಲಿ ಲಘುವಾಗಿ ಟ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಬಹುದು.

D. ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಜೀವಕೋಶಗಳು ತೇಲುತ್ತಿರುವ ತಕ್ಷಣ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗೆ 4 ಮಿಲಿ ಹೊಸ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್‌ನಿಂದ ಮತ್ತು ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ ತೊಳೆಯಲು ಹೊಸ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ನ ಬದಿಗಳನ್ನು ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ. ಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ದ್ರವವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 15ml ಶಂಕುವಿನಾಕಾರದ (ಅಥವಾ ನೀವು 3 ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂಲ್ ಮಾಡುತ್ತಿದ್ದರೆ 50 ಮಿಲಿ) ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.

E. ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಹೆಮಸೈಟೋಮೀಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ಎಣಿಕೆ ಮಾಡಲು ಅಲಿಕೋಟ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ.

ಎಫ್. ನೀವು ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎಣಿಸುವಾಗ, ಉಳಿದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್‌ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1000 ಆರ್‌ಪಿಎಮ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ತಿರುಗಿಸಬೇಕು.

4) ನಿಮ್ಮ ಕೋಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, 2.5 x 10 ನಲ್ಲಿ ಪ್ಲೇಟ್ ಕೋಶಗಳು⁵ T 25 ಫಿಲ್ಟರ್ ಟಾಪ್ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಪ್ರತಿ ಜೀವಕೋಶಗಳು.

5) 0.75 μg/ml puromycin ಹೊಂದಿರುವ ತಾಜಾ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿ 2-3 ದಿನಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ ಆಹಾರವನ್ನು ನೀಡಬೇಕು.

ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆ:

ಕೋಶಗಳನ್ನು 5x 10 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿಲ್ಲದಂತೆ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಬೇಕು⁵ ಜೀವಕೋಶಗಳು / ಮಿಲಿ / ಕ್ರಯೋವಿಯಲ್ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ 10% DMSO ಮತ್ತು 30% FBS ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ ಪುರೊಮೈಸಿನ್ ಇಲ್ಲದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ರಾತ್ರಿ -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಘನೀಕರಿಸುವ ಕೊಠಡಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮರುದಿನ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.

ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ ದಯವಿಟ್ಟು ಸಂಪರ್ಕಿಸಿ:

ಲೆಸ್ಲಿ B. ಗಾರ್ಡನ್, MD, PhD

ಬ್ರೌನ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾನಿಲಯದ ಪೀಡಿಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಪ್ರಾಧ್ಯಾಪಕ ವಾರೆನ್ ಆಲ್ಪರ್ಟ್ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಶಾಲೆ ಮತ್ತು ಪೀಡಿಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ವಿಭಾಗ, ಹ್ಯಾಸ್ಬ್ರೊ ಮಕ್ಕಳ ಆಸ್ಪತ್ರೆ, ಪ್ರಾವಿಡೆನ್ಸ್, ಅರಿವಳಿಕೆ RI ವಿಭಾಗ, ಮಕ್ಕಳ ಆಸ್ಪತ್ರೆ ಬೋಸ್ಟನ್ ಮತ್ತು ಹಾರ್ವರ್ಡ್ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಶಾಲೆ, ಬೋಸ್ಟನ್, MA ವೈದ್ಯಕೀಯ ನಿರ್ದೇಶಕ, ಪ್ರೊಜೆರಿಯಾ ಸಂಶೋಧನಾ ಪ್ರತಿಷ್ಠಾನ

ದೂರವಾಣಿ: 978-535-2594
ಫ್ಯಾಕ್ಸ್: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

ವೆಂಡಿ ನಾರ್ರಿಸ್

PRF ಸೆಲ್ ಮತ್ತು ಟಿಶ್ಯೂ ಬ್ಯಾಂಕ್
ದೂರವಾಣಿ: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org

ಸೈನ್ ಅಪ್ ಮಾಡಿ

ನಮ್ಮ

ನವೀಕರಣಗಳು!

ಈಗ ಸೈನ್ ಅಪ್ ಮಾಡಿ

ಒಟ್ಟಿಗೆ, ನಾವು

ತಿನ್ನುವೆ

ಚಿಕಿತ್ಸೆ ಹುಡುಕಿ!

ಈಗ ದಾನ ಮಾಡಿ