अमर सेल
संस्कृती प्रोटोकॉल
अमर सेल कल्चर प्रोटोकॉल
हार्वर्ड विद्यापीठातील डॉ. मार्टिन डोर्फ यांनी पीआरएफ सेल Tन्ड टिश्यू बॅंकेला अमर सेलच्या ओळी उदारपणे निर्माण केल्याबद्दल आणि त्यांचे आभार मानतो. धन्यवाद.
खालील प्रोटोकॉलचा वापर करुन PRF सेल लाईन्स अमर झाल्या आहेत:
रेट्रोवायरस संसर्ग
ए. व्हायरस तयार करणे: ट्रान्सफॅक्शनच्या 12-24 तासापूर्वी, एचकेके 293 पेशी पॅकेजिंग 100-60% संगमावर 80 मिमीच्या प्लेटवर प्लेट केलेले होते. प्रत्येक प्लेटमध्ये 12μg रेट्रोवाइरल कन्स्ट्रक्शन पीबीएबी-पुरो (एसव्ही 40 टी) आणि 12μg पीसीएल-अ‍ॅम्फो रेट्रोवायरस पॅकेजिंग वेक्टर सह एकत्रित होते. रक्तसंक्रमणानंतर संस्कृती माध्यम 8-10 तासाने आकांक्षी बनले आणि संपूर्ण 10 मि.लि.सह बदलले. इष्टतम व्हायरल टायटर मिळविण्यासाठी अतिरिक्त 48-72 तासासाठी संस्कृती ओतली गेली.
ब. लक्ष्य सेल्समध्ये संक्रमित करणे: लक्ष्य पेशी संसर्ग होण्याच्या 100-12 तास आधी 18 मिमी प्लेटवर प्लेट केली होती. पॅकेजिंग सेल्समधील माध्यम 0.45-μm सेल्युलोज एसीटेट किंवा पॉलिसेल्फॉनिक फिल्टरद्वारे गोळा केले गेले आणि फिल्टर केले गेले. एकदा पेशी -०- conf०% संगम होते, तर १० मिलीग्राम / मि.ली. पॉलिब्रिनच्या अंतिम एकाग्रतेसह 40 मिलीलीटर विषाणू-युक्त माध्यम जोडले गेले. संक्रमणाच्या तीन फे sequ्या अनुक्रमे करण्यात आल्या, 60 तासांच्या अंतरावर. माध्यम 8 तास उष्मायन नंतर बदलले होते.
सी. स्थिर सेल लाईनची निवडः Infection२ तासाच्या संसर्गा नंतर, पेशींचे ट्रिप्सिन केलेले होते, ते १: at वाजता विभाजित केले गेले आणि 72 μg / मिली पुरोमाइसिनच्या उपस्थितीत दोन 1 मिमी प्लेट्समध्ये, तसेच प्रतिजैविक नसलेल्या एक कंट्रोल प्लेटमध्ये हस्तांतरित केले. स्थिर सेल लाइन तयार करण्यासाठी अंदाजे 3 ते 100 आठवड्यांसाठी प्रत्येक 3 किंवा 2 दिवसांनी संस्कृती माध्यम बदलले गेले.
ग्रोथ मीडिया
डीएमईएम- इनव्हिट्रोजन # एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स (एल ग्लूटामाइनशिवाय उच्च ग्लूकोज)
एक्सएनयूएमएक्स% एफबीएस फेटल बोवाइन सीरम
एक्सएनयूएमएक्स% (एक्सएनयूएमएक्सएक्स) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (इनविट्रोजन # एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स)
एक्सएनयूएमएक्स% (एक्सएनयूएमएक्सएक्स) एल-ग्लूटामाइन (इनविट्रोजन # एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स)
एक्सएनयूएमएक्स μg / मिली पुरोमाइसिन (इनव्हिव्होजेन # अँटी-पीआर-एक्सएनयूएमएक्स)
ट्रिप्सिन
ट्रिप्सिन ईडीटीए सी. एक्सएनयूएमएक्स% (इनविट्रोजन # एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स)
हँकची संतुलित मीठ सोल्यूशन
एचबीएसएस- (इनविट्रोजन # 14170 (1 एक्स) (-) कॅल्शियम क्लोराईड, (-) मॅग्नेशियम क्लोराईड, (-) मॅग्नेशियम सल्फेट)
अतिशीत करण्यासाठी डीएमएसओ
सेल कल्चर ग्रेड डीएमएसओ
कोरड्या बर्फावर अंदाजे एक्सएनयूएमएक्स एक्स एक्सएनयूएमएक्सच्या एकाग्रतेवर सेल गोठविल्या जातील5पेशी / कुपी
फायब्रोब्लास्ट वितळवण्यासाठी प्रोटोकॉल
- एक्सएनयूएमएक्स ° से वॉटर बाथमध्ये वेगाने पेशी वितळवा.
- 70% इथेनॉल सह कुपीच्या बाहेरील भाग पुसून टाका.
- विरघळलेल्या पेशींना पुरोमाइसिनशिवाय 25 मिलीलीटर वाढीचे माध्यम असलेल्या T5 फ्लास्कमध्ये स्थानांतरित करा.
- रात्रभर एक्सएनयूएमएक्स ° से इनक्यूबेटरमध्ये फ्लास्क ठेवा.
- दुसर्‍या दिवशी, पेशी संलग्न झाल्या आहेत याची खात्री करण्यासाठी सूक्ष्मदर्शकाखाली निरीक्षण करा.
- मीडिया काढा आणि नवीन ग्रोथ मीडियासह पुनर्स्थित करा.
उपसमूह पीआरएफ सेल लाइन
एक्सएनयूएमएक्स) जेव्हा पेशी स्थापित केल्या जातात आणि वाढतात तेव्हा एक्सएनयूएमएक्स μg / एमएल पुरोमाइसिन असलेले मीडिया वापरण्यास सुरवात करा. एक्सएनयूएमएक्स μg / एमएल पुरोमाइसिन असलेल्या मीडियामधील सेलची देखभाल करणे सुरू ठेवा.
एक्सएनयूएमएक्स) संगम असतांना सेल विभाजित केले जावे.
एक्सएनयूएमएक्स) सेल विभाजित करण्यासाठी (दिलेली व्हॉल्यूम पेशी टीएक्सएनयूएमएक्समध्ये आहेत असे गृहीत धरून आहेत):
उदा. निर्जंतुकीकरण तंत्राचा वापर करून, मिडिया काढून टाका आणि निर्जंतुकीकरण एचबीएसएसच्या एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स मिलीसह फ्लास्क स्वच्छ धुवा. एचबीएसएस काढा आणि टाकून द्या.
ब. एक्सएनयूएमएक्स मिली ट्रीपसीन जोडा आणि एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स मिनिटांसाठी इनक्युबेट करा. सेलने गोल करणे, लिफ्ट करणे आणि फ्लोट करण्यास सुरवात केली आहे की नाही हे ठरविण्यासाठी एका व्युत्पन्न सूक्ष्मदर्शकाखाली तपासणी केली पाहिजे. जर एक्सएनयूएमएक्स मिनिटांनंतर पेशी विलग न झाल्यास आपण आणखी एक एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स मिनिटे उष्मायन करू शकता.
सी. सर्व पेशी काढून टाकण्यासाठी कॅप घट्ट आणि हळूवारपणे फ्लास्क टिप करा. आवश्यक असल्यास पेशी सोडविण्यासाठी फ्लास्क बाजूला हलके टॅप केले जाऊ शकते.
डी. ट्रिप्सिन अकार्यक्षम करण्यासाठी सेल फ्लोटिंग होताच फ्लास्कवर 4 मिलीलीटर नवीन मीडिया जोडा. प्लॅस्टिकमधून आणि सोल्यूशनमध्ये सर्व पेशी धुण्यासाठी नवीन माध्यमांसह कित्येक वेळा फ्लास्कच्या बाजू खाली धुवा. सेल असलेले सर्व द्रव काढा आणि एक एक्सएनयूएमएक्सएक्सएमएल शंकूच्या आकारात स्थानांतरित करा (किंवा आपण एक्सएनयूएमएक्स किंवा अधिक फ्लास्क टाकत असल्यास 15 मिली).
ई. निर्जंतुकीकरण तंत्राचा वापर करून, हेमॅसिटोमीटर मोजण्यासाठी एक अलिकोट काढा.
एफ. आपण पेशी मोजत असताना, उर्वरित सोल्यूशन एक्सएनयूएमएक्स आरपीएमएसवर एक्सएनयूएमएक्स मिनिटांकरिता क्लिनिकल सेंट्रीफ्यूजमध्ये कापावे.
4) आपल्या सेलची गणना केल्यानंतर, प्लेट्स सेल 2.5 x 10 वाजता5 प्रति टी एक्सएनयूएमएक्स सेल टॉप फ्लास्क.
एक्सएनयूएमएक्स) दर एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स दिवसात सेलमध्ये एक्सएनयूएमएक्स μg / मिली पुरोमाइसिन असलेले ताजे वाढ मध्यम द्यावे.
अतिशीत:
एक्सएनयूएमएक्सएक्स एक्सएनयूएमएक्सपेक्षा कमी सेलमध्ये गोठविलेले असावेत5 पेशी / मिली / क्रायोव्हियल ग्रोथ मीडियामध्ये 10% DMSO आणि 30% FBS असलेले पुरोमाइसिनशिवाय आणि त्यानंतर -80 डिग्री सेल्सियस वर रात्री एक आयसोप्रॉपानॉल फ्रीझिंग चेंबरमध्ये ठेवली. दुसर्‍या दिवशी लिक्विड नायट्रोजनमध्ये स्थानांतरित करा.
अधिक माहितीसाठी कृपया संपर्क साधा:
लेस्ली बी. गॉर्डन, एमडी, पीएचडी
ब्राउन युनिव्हर्सिटीचे बालरोगशास्त्र संशोधन वारेन अल्पर्ट मेडिकल स्कूलचे प्रोफेसर आणि बालरोग विभाग, हॅसब्रो चिल्ड्रन्स हॉस्पिटल, प्रोव्हिडन्स, estनेस्थेसियाचा आरआय विभाग, चिल्ड्रन्स हॉस्पिटल बोस्टन आणि हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए मेडिकल डायरेक्टर, प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन
फोन: 978-535-2594
फॅक्स: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
वेंडी नॉरिस
फोन: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org
साइन अप करा
आमच्यासाठी
वृत्तपत्र!
एकत्र, आम्ही
करणार
उपचार शोधा!
