حدد صفحة

خلية خلدت

بروتوكولات الثقافة

 

بروتوكول ثقافة خلية خلد

نشكر الدكتور مارتن دورف في جامعة هارفارد لتوليد خطوط الخلايا الخالدة وتوفيرها لبنك PRF للخلايا والأنسجة. شكرا جزيلا.

تم خلد خطوط الخلايا PRF باستخدام البروتوكول التالي:

عدوى الفيروس الارتجاعي

أ. إنتاج الفيروسات: 12-24 ساعة قبل تعداء العدوى ، تم تغليف عبوات خلايا HEK293 على لوح 100 مم عند التقاء 60-80٪. تم نقل كل لوحة بشكل مشترك باستخدام 12 ميكروغرام من الفيروسات القهقرية pBABE-puro (SV40T) و 12 ميكروغرام من pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector. تم استنشاق وسط الاستزراع بعد 8-10 ساعات من تعداء العدوى ، واستبداله بـ 10 مل من وسط كامل. تم تحضين الثقافة لمدة 48-72 ساعة إضافية للوصول إلى العيار الفيروسي الأمثل.

إصابة الخلايا المستهدفة: تم طلاء الخلايا المستهدفة على لوح 100 مم قبل 12-18 ساعة من الإصابة. تم جمع الوسيط من خلايا التغليف وتصفيته من خلال 0.45 ميكرومتر أسيتات السليلوز أو مرشح متعدد السلفونيك. بمجرد أن تكون الخلايا متكدسة 40-60٪ ، تمت إضافة 8 مل من الوسط المحتوي على الفيروس بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل من البوليبرين. تم إجراء ثلاث جولات متتالية من العدوى ، بفارق 12 ساعة تقريبًا. تم استبدال الوسيط بعد 24 ساعة من الحضانة.

اختيار خطوط الخلايا المستقرة: بعد 72 ساعة من الإصابة ، تم تجريب الخلايا وتقسيمها عند 1: 3 ونقلها إلى لوحين 100 مم في وجود 3 ميكروغرام / مل من بوروميسين ، بالإضافة إلى لوحة تحكم واحدة بدون مضاد حيوي. تم تغيير وسط المزرعة كل يومين أو 2 أيام لمدة 3 إلى 2 أسابيع تقريبًا لإنتاج خطوط خلوية مستقرة.

 

وسائل الإعلام النمو

DMEM- Invitrogen # 11960-044 (نسبة الجلوكوز المرتفعة بدون الجلوتامين L)

15٪ FBS Serum Bovine Serum

1٪ (1x) البنسلين - الستربتومايسين (Invitrogen # 15140-122)

1٪ (1X) L- الجلوتامين (Invitrogen # 25030-081)

0.75 ميكروغرام / مل بوروميسين (InvivoGen # ant-pr-1)

التربسين

Trypsin EDTA C .25٪ (Invitrogen # 25200-056)

هانك في حل الملح المتوازن

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) كلوريد الكالسيوم ، (-) كلوريد المغنيسيوم ، (-) كبريتات المغنيسيوم)

DMSO للتجميد

خلية ثقافة الصف DMSO

سوف تصل الخلايا مجمدة على الثلج الجاف بتركيز 5 x 10 تقريبًا5خلية / قارورة

بروتوكول لذوبان الخلايا الليفية

  1. ذوبان الجليد الخلايا بسرعة في حمام مائي 37 ° C.
  2. امسح الجزء الخارجي من القارورة باستخدام 70٪ من الإيثانول.
  3. نقل الخلايا المذابة إلى قارورة T25 تحتوي على 5 مل من وسائط النمو دون بوروميسين.
  4. وضع قارورة في حاضنة 37 ° C بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم التالي ، لاحظ تحت المجهر للتأكد من تعلق الخلايا.
  6. قم بإزالة الوسائط واستبدالها بوسائط نمو جديدة.

subculturing خطوط الخلايا PRF

1) عندما يتم إنشاء الخلايا وتنموها ، ابدأ في استخدام الوسائط التي تحتوي على بوروميسين 0.75 ميكروغرام / مل. مواصلة الحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على 0.75 ميكروغرام / مل بوروميسين.

2) يجب تقسيم الخلايا عند التقاء.

3) لتقسيم الخلايا (تفترض وحدات التخزين المقدمة أن الخلايا موجودة في T25):

A. باستخدام تقنية معقمة ، قم بإزالة الوسائط وشطف القارورة باستخدام 2-3 ml من HBSS العقيمة. إزالة وتجاهل HBSS.

ب. أضف 1 ml trypsin واحتضان لمدة 2-3. يجب فحص الخلايا تحت المجهر المقلوب لتحديد ما إذا كانت قد بدأت في التقريب والرفع والعويم. إذا لم يتم فصل الخلايا بعد دقائق 3 ، فيمكنك احتضان دقائق 1-2 أخرى

جيم تشديد الغطاء وحافة بلطف قارورة من جانب إلى آخر لإزاحة جميع الخلايا. قد يتم استغلال القارورة بخفة على الجانب لتخفيف الخلايا إذا لزم الأمر.

D. أضف 4 ml من الوسائط الجديدة إلى قارورة بمجرد أن تطفو الخلايا لتعطيل التربسين. شطف أسفل جوانب القارورة عدة مرات مع وسائل الإعلام الجديدة لغسل جميع الخلايا من البلاستيك وفي الحل. إزالة جميع الخلايا التي تحتوي على السائل ونقل إلى مخروطي 15ml (أو 50 مل إذا كنت تجمع 3 أو أكثر من قوارير).

E. باستخدام تقنية معقمة ، وإزالة قسامة للعد على عدادة الكريات.

واو - أثناء عدّ الخلايا ، يجب أن تُنسج بقية المحلول في أجهزة الطرد المركزي السريرية لمدة 5 من الدقائق في 1000 rpms.

4) بعد حساب عدد الخلايا الخاصة بك ، لوحة الخلايا 2.5 × 105 الخلايا لكل T 25 تصفية القارورة العليا.

5) يجب تغذية الخلايا كل يوم 2-3 مع وسيط نمو جديد يحتوي على بوروميسين 0.75 ميكروغرام / مل.

تجميد:

يجب تجميد الخلايا في 5x 10 على الأقل5 خلايا / مل / cryovial في وسائل الإعلام النمو تحتوي على 10٪ DMSO و 30٪ FBS بدون بوروميسين وبعد ذلك وضعت في غرفة تجميد الأيزوبروبانول في -80 ° C بين عشية وضحاها. نقل إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي.

لمعلومات أكثر، يرجى الاتصال:

ليزلي ب. جوردون ، دكتوراه ، دكتوراه

أستاذ أبحاث طب الأطفال ، كلية الطب وارن ألبرت بجامعة براون وقسم طب الأطفال ، مستشفى هاسبرو للأطفال ، بروفيدانس ، قسم التخدير في معهد رود آيلاند ، مستشفى الأطفال في بوسطن وكلية الطب بجامعة هارفارد ، بوسطن ، ماجستير المدير الطبي ، مؤسسة أبحاث Progeria

Phone: 978-535-2594
الفاكس: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

ويندي نوريس
PRF خلية وبنك الأنسجة
الهاتف: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org

تسجيل

لنا

النشرة الإخبارية!

سجّل الآن

سويا نحن

ويل

العثور على علاج!

تبرع الآن