ಪಿಆರ್ಎಫ್ ಸೆಲ್ ರೇಖೆಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸುವುದು

1. 37˚C ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವೇಗವಾಗಿ ಕರಗಿಸಿ.
2. 70% ಎಥೆನಾಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಸೀಸೆಯ ಹೊರಭಾಗವನ್ನು ತೊಡೆ.
3. ಕರಗಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು 25 ಮಿಲಿ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ T5 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
4. ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ 37˚C ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್ನಲ್ಲಿ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಇರಿಸಿ.
5. ಮರುದಿನ, ಜೀವಕೋಶಗಳು ಲಗತ್ತಿಸಿವೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿ.
6. ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ತಾಜಾ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿ.

ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪಿಆರ್ಎಫ್ ಸೆಲ್ ರೇಖೆಗಳು

1. ಸಂಗಮವಾದಾಗ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸಬೇಕು.
2. ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸಲು (ಕೊಟ್ಟಿರುವ ಸಂಪುಟಗಳು ಜೀವಕೋಶಗಳು T25 ನಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು are ಹಿಸುತ್ತವೆ):
   ಎ) ಬರಡಾದ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 2-3 ಮಿಲಿ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ಎಚ್‌ಬಿಎಸ್‌ಎಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ. HBSS ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ತ್ಯಜಿಸಿ.
   ಬೌ) 1 ಮಿಲಿ ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 2-3 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ. ಕೋಶಗಳನ್ನು ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಬೇಕು, ಅವುಗಳು ಸುತ್ತುವರಿಯಲು, ಎತ್ತುವ ಮತ್ತು ತೇಲುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿವೆ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು. 3 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸದಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಇನ್ನೊಂದು 1-2 ನಿಮಿಷಗಳನ್ನು ಕಾವುಕೊಡಬಹುದು.
   ಸಿ) ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸ್ಥಳಾಂತರಿಸಲು ಕ್ಯಾಪ್ ಅನ್ನು ಬಿಗಿಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ನಿಧಾನವಾಗಿ ತುದಿಯನ್ನು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಮಾಡಿ. ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಡಿಲಗೊಳಿಸಲು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ಬದಿಯಲ್ಲಿ ಲಘುವಾಗಿ ಟ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಬಹುದು.
   ಡಿ) ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಕೋಶಗಳು ತೇಲುತ್ತಿರುವ ತಕ್ಷಣ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗೆ 4 ಮಿಲಿ ಹೊಸ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್‌ನಿಂದ ಮತ್ತು ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ತೊಳೆಯಲು ಹೊಸ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ನ ಬದಿಗಳನ್ನು ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ. ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ದ್ರವಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 15 ಮಿಲಿ ಶಂಕುವಿನಾಕಾರಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ (ಅಥವಾ ನೀವು 50 ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್‌ಗಳನ್ನು ಪೂಲ್ ಮಾಡುತ್ತಿದ್ದರೆ 3 ಮಿಲಿ).
   ಇ) ಬರಡಾದ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಹಿಮೋಸೈಟೋಮೀಟರ್ ಅನ್ನು ಎಣಿಸಲು ಆಲ್ಕೋಟ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ.
   ಎಫ್) ನೀವು ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎಣಿಸುತ್ತಿರುವಾಗ, ಉಳಿದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಯಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1000 ಆರ್‌ಪಿಎಂನಲ್ಲಿ ತಿರುಗಿಸಬೇಕು.
3. ನಿಮ್ಮ ಸೆಲ್ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಿದ ನಂತರ, 2.5 x 10 ನಲ್ಲಿ ಪ್ಲೇಟ್ ಕೋಶಗಳು⁵ ಪ್ರತಿ T25 ಫಿಲ್ಟರ್ ಟಾಪ್ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಕೋಶಗಳು.
4. ಪ್ರತಿ 2-3 ದಿನಗಳಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳನ್ನು ತಾಜಾ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ನೀಡಬೇಕು.

ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆ:

ಕೋಶಗಳನ್ನು 5 x 10 ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿಲ್ಲ⁵ ಜೀವಕೋಶಗಳು / ಮಿಲಿ / ಕ್ರಯೋವಿಯಲ್ 10% ಡಿಎಂಎಸ್ಒ ಮತ್ತು 30% ಎಫ್‌ಬಿಎಸ್ ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ತರುವಾಯ ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ -80˚ ಸಿ ಯಲ್ಲಿ ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಘನೀಕರಿಸುವ ಕೊಠಡಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮರುದಿನ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.

ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮತ್ತು ಘನೀಕರಿಸುವ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್