ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಕೋಶ
ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ಗಳು
ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮತ್ತು ಘನೀಕರಿಸುವ ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್ಗಳಿಗಾಗಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್
ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮಾಧ್ಯಮ
DMEM - ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ #11960-044 (ಎಲ್-ಗ್ಲುಟಾಮಿನ್ ಇಲ್ಲದೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಗ್ಲೂಕೋಸ್)
15% FBS ಫೆಟಲ್ ಬೋವಿನ್ ಸೀರಮ್ - ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ #10437-028
1% (1X) ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ - ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ #15140-122
1% (1X) GlutaMAX – ThermoFisher #35050-061
ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್
ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ EDTA C 0.25% (ThermoFisher #25200-056)
ಹ್ಯಾಂಕ್ಸ್ ಸಮತೋಲಿತ ಉಪ್ಪು ಪರಿಹಾರ
HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) ಕ್ಯಾಲ್ಸಿಯಂ ಕ್ಲೋರೈಡ್, (-) ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಕ್ಲೋರೈಡ್, (-) ಮೆಗ್ನೀಸಿಯಮ್ ಸಲ್ಫೇಟ್
ಘನೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ DMSO
ಸೆಲ್ ಕಲ್ಚರ್ ಗ್ರೇಡ್ DMSO - ಸಿಗ್ಮಾ #D2438
PRF ಸೆಲ್ ಲೈನ್ಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸುವುದು
- 37˚C ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವೇಗವಾಗಿ ಕರಗಿಸಿ.
- 70% ಎಥೆನಾಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಬಾಟಲಿಯ ಹೊರಭಾಗವನ್ನು ಒರೆಸಿ.
- ಕರಗಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು 5 ಮಿಲಿ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ T25 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
- ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು 37˚C ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ.
- ಮರುದಿನ, ಜೀವಕೋಶಗಳು ಲಗತ್ತಿಸಿರುವುದನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿ.
- ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ತಾಜಾ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿ.
ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ PRF ಸೆಲ್ ಲೈನ್ಗಳು
- ಸಂಗಮವಾದಾಗ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸಬೇಕು.
- ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸಲು (ಪರಿಮಾಣಗಳು ಕೋಶಗಳು T25 ನಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ):
a) ಬರಡಾದ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 2-3 ಮಿಲಿ ಸ್ಟೆರೈಲ್ HBSS ನೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ತೊಳೆಯಿರಿ. HBSS ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ತ್ಯಜಿಸಿ.
ಬಿ) 1 ಮಿಲಿ ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 2-3 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ. ಜೀವಕೋಶಗಳು ಸುತ್ತುವರಿಯಲು, ಎತ್ತಲು ಮತ್ತು ತೇಲಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿವೆಯೇ ಎಂದು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಬೇಕು. 3 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬೇರ್ಪಡಿಸದಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಇನ್ನೊಂದು 1-2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಬಹುದು.
ಸಿ) ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೊರಹಾಕಲು ಕ್ಯಾಪ್ ಅನ್ನು ಬಿಗಿಗೊಳಿಸಿ ಮತ್ತು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ಅಕ್ಕಪಕ್ಕಕ್ಕೆ ನಿಧಾನವಾಗಿ ತಿರುಗಿಸಿ. ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಡಿಲಗೊಳಿಸಲು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ಬದಿಯಲ್ಲಿ ಲಘುವಾಗಿ ಟ್ಯಾಪ್ ಮಾಡಬಹುದು.
ಡಿ) ಟ್ರಿಪ್ಸಿನ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಲು ಜೀವಕೋಶಗಳು ತೇಲುತ್ತಿರುವ ತಕ್ಷಣ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗೆ 4 ಮಿಲಿ ಹೊಸ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸೇರಿಸಿ. ಎಲ್ಲಾ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್ನಿಂದ ಮತ್ತು ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ತೊಳೆಯಲು ಹೊಸ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ನ ಬದಿಗಳನ್ನು ಹಲವಾರು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಿರಿ. ಕೋಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ದ್ರವವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು 15ml ಶಂಕುವಿನಾಕಾರದ (ಅಥವಾ ನೀವು 3 ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗಳನ್ನು ಪೂಲ್ ಮಾಡುತ್ತಿದ್ದರೆ 50 ಮಿಲಿ) ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
ಇ) ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕ ತಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿ, ಹೆಮೋಸೈಟೋಮೀಟರ್ನಲ್ಲಿ ಎಣಿಸಲು ಅಲಿಕೋಟ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ.
ಎಫ್) ನೀವು ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎಣಿಸುವಾಗ, ಉಳಿದ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ನಲ್ಲಿ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 1000 ಆರ್ಪಿಎಮ್ನಲ್ಲಿ ತಿರುಗಿಸಬೇಕು. - ನಿಮ್ಮ ಕೋಶಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, 2.5 x 10 ನಲ್ಲಿ ಪ್ಲೇಟ್ ಕೋಶಗಳು5 T25 ಫಿಲ್ಟರ್ ಟಾಪ್ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಪ್ರತಿ ಜೀವಕೋಶಗಳು.
- ತಾಜಾ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿ 2-3 ದಿನಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ ಜೀವಕೋಶಗಳಿಗೆ ಆಹಾರವನ್ನು ನೀಡಬೇಕು.
ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆ:
ಕೋಶಗಳನ್ನು 5 x 10 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿಲ್ಲದಂತೆ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಬೇಕು5 10% DMSO ಮತ್ತು 30% FBS ಹೊಂದಿರುವ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಜೀವಕೋಶಗಳು/ml/ಕ್ರಯೋವಿಯಲ್ ಮತ್ತು ನಂತರ ರಾತ್ರಿ -80˚C ನಲ್ಲಿ ಐಸೊಪ್ರೊಪನಾಲ್ ಘನೀಕರಿಸುವ ಕೊಠಡಿಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಮರುದಿನ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
ಉಪಸಂಸ್ಕೃತಿ ಮತ್ತು ಘನೀಕರಿಸುವ ಫೈಬ್ರೊಬ್ಲಾಸ್ಟ್ಗಳಿಗಾಗಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್
ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ ದಯವಿಟ್ಟು ಸಂಪರ್ಕಿಸಿ:
ಲೆಸ್ಲಿ B. ಗಾರ್ಡನ್, MD, PhD
ಬ್ರೌನ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾನಿಲಯದ ಪೀಡಿಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಪ್ರಾಧ್ಯಾಪಕ ವಾರೆನ್ ಆಲ್ಪರ್ಟ್ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಶಾಲೆ ಮತ್ತು ಪೀಡಿಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ವಿಭಾಗ, ಹ್ಯಾಸ್ಬ್ರೊ ಮಕ್ಕಳ ಆಸ್ಪತ್ರೆ, ಪ್ರಾವಿಡೆನ್ಸ್, ಅರಿವಳಿಕೆ RI ವಿಭಾಗ, ಮಕ್ಕಳ ಆಸ್ಪತ್ರೆ ಬೋಸ್ಟನ್ ಮತ್ತು ಹಾರ್ವರ್ಡ್ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಶಾಲೆ, ಬೋಸ್ಟನ್, MA ವೈದ್ಯಕೀಯ ನಿರ್ದೇಶಕ, ಪ್ರೊಜೆರಿಯಾ ಸಂಶೋಧನಾ ಪ್ರತಿಷ್ಠಾನ
ದೂರವಾಣಿ: 978-535-2594
ಫ್ಯಾಕ್ಸ್: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
ವೆಂಡಿ ನಾರ್ರಿಸ್
ದೂರವಾಣಿ: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org