অমর কক্ষ
সংস্কৃতি প্রোটোকল
অমর কোষ সংস্কৃতি প্রোটোকল
হার্ভার্ড বিশ্ববিদ্যালয়ে ডাঃ মার্টিন ডরফকে পিআরএফ সেল ও টিস্যু ব্যাংকে উদারভাবে সেল লাইনের উত্সাহ প্রদান ও সরবরাহ করার জন্য আমরা ধন্যবাদ জানাই। ধন্যবাদ.
নিম্নলিখিত প্রোটোকল ব্যবহার করে PRF সেল লাইনগুলি অমর করা হয়েছিল:
রেট্রোভাইরাস সংক্রমণ
উ: ভাইরাস উত্পাদনের: স্থানান্তরকরণের 12-24 ঘন্টা আগে, প্যাকেজিং HEK293 কোষগুলি 100-60% সঙ্গমে 80 মিমি প্লেটে ধাতুপট্টাবৃত ছিল। প্রতিটি প্লেট 12μg রেট্রোভাইরাল কনস্ট্রাক্ট পিবিএবিই-পুরো (এসভি 40 টি) এবং 12 ডিগ্রি পিসিএল-আম্ফো রেট্রোভাইরাস প্যাকেজিং ভেক্টরের সাথে সহ-স্থানান্তরিত হয়েছিল। সংশ্লেষের পরে সংস্কৃতি মাধ্যমটি 8-10 ঘন্টা আকাঙ্ক্ষিত হয়েছিল এবং সম্পূর্ণ 10 মিলিমিটারের সাথে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। অনুকূল ভাইরাল শিরোনাম অর্জনের জন্য সংস্কৃতিটি অতিরিক্ত 48-72 ঘন্টা সরবরাহ করা হয়েছিল।
বি। লক্ষ্য সেলগুলি সংক্রামিত করছে: লক্ষণ কোষগুলি সংক্রমণের আগে 100-12 ঘন্টা আগে একটি 18 মিমি প্লেটে লাগানো হয়েছিল। প্যাকেজিং সেলগুলি থেকে মিডিয়াম সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 0.45-μm সেলুলোজ অ্যাসিটেট বা পলিসুলফোনিক ফিল্টার মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল। একবার কোষগুলি 40-60% মিশ্রিত হয়ে গেলে, 8 মিলিগ্রাম / মিলি পলিব্রিনের চূড়ান্ত ঘনত্ব সহ 10 মিলি ভাইরাসযুক্ত মিডিয়াম যুক্ত করা হয়। সংক্রমণের তিনটি রাউন্ড যথাক্রমে সম্পাদিত হয়েছিল, h 12 ঘন্টা আলাদা। মাঝারিটি 24 ঘন্টা ইনকিউবেশন পরে প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল।
গ। স্থিতিশীল সেল লাইনের নির্বাচন: সংক্রমণের পরে h২ ঘন্টা পরে, কোষগুলি ট্রাইপসিনাইজ করা হয়, 72: 1 এ বিভক্ত হয় এবং 3 μg / মিলি পুরোমিসিনের উপস্থিতিতে দুটি 100 মিমি প্লেটে স্থানান্তরিত হয়, অ্যান্টিবায়োটিক ছাড়াই একটি নিয়ন্ত্রণ প্লেট plate স্থিতিশীল সেল লাইন তৈরি করতে প্রায় 3 থেকে 2 সপ্তাহের জন্য সংস্কৃতি মাধ্যমটি প্রতি 3 বা 2 দিন পরিবর্তন করা হয়েছিল।
গ্রোথ মিডিয়া
ডিএমইএম- ইনভিট্রোজেন # 11960-044 (এল-গ্লুটামিন ছাড়াই উচ্চ গ্লুকোজ)
এক্সএনইউএমএক্স% এফবিএস ভ্রূণ বোভাইন সিরাম
এক্সএনইউএমএক্স% (এক্সএনএমএক্সএক্স) পেনিসিলিন-স্ট্রেপটোমাইসিন (ইনভিট্রোজেন # এক্সএনএমএক্স-এক্সএনএমএক্স)
এক্সএনইউএমএক্স% (এক্সএনএমএক্সএক্স) এল-গ্লুটামিন (ইনভিট্রোজেন # এক্সএনএমএক্স-এক্সএনএমএক্স)
0.75 Xg / ml puromycin (InvivoGen # ant-pr-1)
Trypsin
ট্রিপসিন ইডিটিএ সি। এক্সএনএমএক্স% (ইনভিট্রোজেন # এক্সএনএমএক্স-এক্সএনএমএক্স)
হ্যাঙ্কের ভারসাম্যযুক্ত লবণ সমাধান
এইচবিএসএস- (ইনভিট্রোজেন # 14170 (1 এক্স) (-) ক্যালসিয়াম ক্লোরাইড, (-) ম্যাগনেসিয়াম ক্লোরাইড, (-) ম্যাগনেসিয়াম সালফেট)
জমাট বাঁধার জন্য ডিএমএসও
সেল সংস্কৃতি গ্রেড ডিএমএসও
প্রায় 5 x 10 এর ঘনত্বে কোষগুলি শুষ্ক বরফের উপর হিমায়িত হয়ে আসবে5কোষ / শিশি
ফাইব্রোব্লাস্টগুলি গলানোর জন্য প্রোটোকল
- একটি 37। C জলের স্নানে দ্রুত কোষগুলি গলান।
- 70% ইথানল দিয়ে শিশিরের বাইরের অংশটি মুছুন।
- গন্ধযুক্ত কোষগুলি কোনও T25 ফ্লাস্কে স্থানান্তর করুন যাতে পুরোমিসিন ব্যতীত 5 মিলি গ্রোথ মিডিয়া থাকে।
- রাতারাতি 37। C ইনকিউবেটারে ফ্লাস্ক রাখুন।
- পরের দিন, কক্ষগুলি সংযুক্ত রয়েছে তা নিশ্চিত করতে মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করুন।
- মিডিয়া সরান এবং তাজা বৃদ্ধি মিডিয়া সঙ্গে প্রতিস্থাপন।
উপ-সংস্কৃতি PRF সেল লাইন
এক্সএনএমএক্স) যখন সেলগুলি স্থাপন করা হয় এবং বাড়তে থাকে তখন 1 μg / ml puromycinযুক্ত মিডিয়া ব্যবহার শুরু করুন। 0.75 μg / ml puromycinযুক্ত মিডিয়াতে কোষগুলি বজায় রাখা চালিয়ে যান।
এক্সএনএমএক্স) সংমিশ্রিত হলে ঘরগুলি বিভক্ত করা উচিত।
এক্সএনএমএক্স) কক্ষগুলি বিভক্ত করতে (প্রদত্ত খণ্ডগুলি কোষগুলি একটি T3- এ রয়েছে ধরে নেওয়া হচ্ছে):
উঃ জীবাণুমুক্ত কৌশল ব্যবহার করে মিডিয়া সরান এবং জীবাণুমুক্ত HBSS এর 2-3 মিলি দিয়ে ফ্লাস্ক ধুয়ে ফেলুন। এইচবিএসএস সরান এবং বাতিল করুন।
বি। এক্সএনএমএক্সএক্স মিলি ট্রিপসিন যুক্ত করুন এবং এক্সএনইউএমএক্স-এক্সএনএমএক্স মিনিটের জন্য প্রসারণ করুন। কোষগুলি বৃত্তাকার, উত্তোলন এবং ভাসমান শুরু করেছে কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য একটি উল্টানো মাইক্রোস্কোপের নীচে পরীক্ষা করা উচিত। 1 মিনিটের পরে যদি ঘরগুলি আলাদা না করা হয় তবে আপনি অন্য 2-3 মিনিট উত্সাহিত করতে পারেন
গ। ক্যাপটি শক্ত করুন এবং সমস্ত কক্ষগুলি অপসারণের জন্য আলতো করে পাশ থেকে একপাশে ফ্লাস্ক করুন। প্রয়োজনবোধে কোষ আলগা করতে ফ্লাস্ক হালকাভাবে আলতো চাপতে পারে।
D. ট্রিপসিনটি নিষ্ক্রিয় করতে কোষগুলি ভেসে উঠার সাথে সাথেই ফ্লাস্কে এক্সএনএমএক্সএক্স নতুন মিডিয়া যুক্ত করুন। প্লাস্টিকের বাইরে থেকে সমস্ত ঘরের ধোয়া এবং সমাধানের জন্য নতুন মিডিয়া দিয়ে ফ্লাস্কের পক্ষগুলি কয়েকবার ধুয়ে ফেলুন। সমস্ত তরলযুক্ত তরল সরিয়ে একটি 4ML শঙ্কুতে স্থানান্তর করুন (বা আপনি যদি 15 বা আরও বেশি ফ্লাস্ক পুল করছেন তবে এক্সএনএমএক্সএক্স মিলি)।
E. জীবাণুমুক্ত কৌশল ব্যবহার করে, একটি হেম্যাসিটোমিটারে গণনার জন্য একটি অ্যালিকোট সরান।
এফ। আপনি সেলগুলি গণনা করার সময়, বাকী সমাধানটি 5 আরপিএমসে 1000 মিনিটের জন্য ক্লিনিকাল সেন্ট্রিফিউজে কাটা উচিত।
4) আপনার সেল গণনা গণনা করার পরে, প্লেট সেলগুলি 2.5 x 10 এ5 প্রতি X 25 টির উপরে ফ্লাস্ক ফিল্টার করুন।
এক্সএনইউএমএক্স) প্রতিটি এক্সএনইউএমএক্স-এক্সএনএমএমএক্স XLUMX mg / মিলি পুরোমিসিনযুক্ত তাজা বৃদ্ধির মাধ্যম সহ ঘরগুলি খাওয়ানো উচিত।
ঠাণ্ডা:
কক্ষগুলি 5x 10 এর চেয়ে কম হিমায়িত করা উচিত5 কোষ / মিলি / ক্রিওভিয়াল বৃদ্ধি মিডিয়াতে 10% DMSO এবং 30% FBS রয়েছে পুরোমিসিন ছাড়াই এবং পরবর্তীকালে -80। C এ একটি আইসোপ্রোপানল হিমশীতল চেম্বারে স্থাপন করা হয়। পরের দিন তরল নাইট্রোজেনে স্থানান্তর করুন।
আরও তথ্যের জন্য যোগাযোগ করুন:
লেসেলি বি গর্ডন, এমডি, পিএইচডি
পেডিয়াট্রিক্স গবেষণা অধ্যাপক ওয়ারেন আল্পার্ট মেডিকেল স্কুল ব্রাউন ইউনিভার্সিটি অফ পেডিয়াট্রিক্স বিভাগ, হাসব্রো চিলড্রেনস হসপিটাল, প্রভিডেন্স, অ্যানাস্থেসিয়া বিভাগের আরআই বিভাগ, শিশুদের হাসপাতাল বোস্টন এবং হার্ভার্ড মেডিকেল স্কুল, বোস্টন, এমএ মেডিকেল ডিরেক্টর, প্রোজেরিয়া রিসার্চ ফাউন্ডেশন
ফোন: 978-535-2594
ফ্যাক্স: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
ভেন্ডি নরিস
ফোন: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org
নিবন্ধন করুন
আমাদের জন্য
নিউজলেটার!
আমরা একসাথে
উইল
নিরাময়ের সন্ধান করুন!
