পৃষ্ঠা নির্বাচন করুন

অমর কোষ

সংস্কৃতি প্রোটোকল

 

অমর কোষ সংস্কৃতি প্রোটোকল

আমরা হার্ভার্ড বিশ্ববিদ্যালয়ের ডঃ মার্টিন ডরফকে ধন্যবাদ জানাই PRF সেল এবং টিস্যু ব্যাঙ্কে অমর কোষ লাইনগুলি উদারভাবে তৈরি এবং প্রদান করার জন্য। ধন্যবাদ

পিআরএফ সেল লাইনগুলি নিম্নলিখিত প্রোটোকল ব্যবহার করে অমর হয়ে গিয়েছিল:

রেট্রোভাইরাস সংক্রমণ

উ: উৎপাদক ভাইরাস: ট্রান্সফেকশনের 12-24 ঘন্টা আগে, প্যাকেজিং HEK293 সেলগুলি 60-80% সঙ্গমে 100-মিমি প্লেটে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। প্রতিটি প্লেট 12μg রেট্রোভাইরাল কনস্ট্রাক্ট pBABE-puro (SV40T) এবং 12μg pCL-Ampho রেট্রোভাইরাস প্যাকেজিং ভেক্টরের সাথে সহ-স্থানান্তরিত হয়েছিল। ট্রান্সফেকশনের 8-10 ঘন্টা পরে সংস্কৃতির মাধ্যমটি উচ্চাকাঙ্খিত হয়েছিল এবং 10ml সম্পূর্ণ মাধ্যম দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। সর্বোত্তম ভাইরাল টাইটার অর্জনের জন্য সংস্কৃতিটি অতিরিক্ত 48-72 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল।

B. লক্ষ্য কোষকে সংক্রমিত করে: লক্ষ্য কোষগুলি সংক্রমণের 12-18 ঘন্টা আগে একটি 100 মিমি প্লেটে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। প্যাকেজিং কোষ থেকে মাধ্যমটি 0.45-μm সেলুলোজ অ্যাসিটেট বা পলিসালফোনিক ফিল্টারের মাধ্যমে সংগ্রহ এবং ফিল্টার করা হয়েছিল। একবার কোষগুলি 40-60% সঙ্গম হয়ে গেলে, 10 μg/ml পলিব্রিনের চূড়ান্ত ঘনত্বের সাথে 8 মিলি ভাইরাসযুক্ত মাধ্যম যোগ করা হয়েছিল। সংক্রমণের তিনটি রাউন্ড ক্রমান্বয়ে সঞ্চালিত হয়েছিল, ~ 12 ঘন্টার ব্যবধানে। 24 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পরে মাধ্যমটি প্রতিস্থাপিত হয়েছিল।

গ. স্থিতিশীল সেল লাইন নির্বাচন: সংক্রমণের 72 ঘন্টা পরে, কোষগুলিকে ট্রিপসিনাইজ করা হয়, 1:3 এ বিভক্ত করা হয় এবং 3 μg/ml পিউরোমাইসিনের উপস্থিতিতে দুটি 100 মিমি প্লেটে স্থানান্তরিত করা হয়, এছাড়াও অ্যান্টিবায়োটিক ছাড়াই একটি নিয়ন্ত্রণ প্লেট। স্থিতিশীল কোষ লাইন তৈরি করতে প্রায় 2 থেকে 4 সপ্তাহের জন্য প্রতি 2 বা 3 দিনে সংস্কৃতির মাধ্যম পরিবর্তন করা হয়েছিল।

 

গ্রোথ মিডিয়া

DMEM- ইনভিট্রোজেন #11960-044 (এল-গ্লুটামিন ছাড়া উচ্চ গ্লুকোজ)

15% FBS ফেটাল বোভাইন সিরাম

1% (1x) পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (ইনভিট্রোজেন#15140-122)

1% (1X) এল-গ্লুটামিন (ইনভিট্রোজেন#25030-081)

0.75 μg/ml puromycin (InvivoGen #ant-pr-1)

ট্রিপসিন

Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

হ্যাঙ্কের সুষম লবণ সমাধান

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) ক্যালসিয়াম ক্লোরাইড, (-)ম্যাগনেসিয়াম ক্লোরাইড, (-) ম্যাগনেসিয়াম সালফেট)

জমাট বাঁধার জন্য DMSO

সেল কালচার গ্রেড DMSO

কোষগুলি প্রায় 5 x 10 ঘনত্বে শুকনো বরফের উপর হিমায়িত হয়ে আসবে5কোষ/শিশি

ফাইব্রোব্লাস্ট গলানোর জন্য প্রোটোকল

  1. 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস জলের স্নানে কোষগুলিকে দ্রুত গলিয়ে ফেলুন।
  2. 70% ইথানল দিয়ে শিশির বাইরের অংশটি মুছুন।
  3. গলিত কোষগুলিকে একটি T25 ফ্লাস্কে স্থানান্তর করুন যাতে 5 মিলি গ্রোথ মিডিয়া পিউরোমাইসিন ছাড়াই থাকে।
  4. ফ্লাস্কটি রাতারাতি 37°C ইনকিউবেটরে রাখুন।
  5. পরের দিন, কোষ সংযুক্ত হয়েছে তা নিশ্চিত করতে মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করুন।
  6. মিডিয়া সরান এবং তাজা বৃদ্ধি মিডিয়া সঙ্গে প্রতিস্থাপন.

সাবকালচারিং PRF সেল লাইন

1) যখন কোষগুলি প্রতিষ্ঠিত হয় এবং বৃদ্ধি পায়, তখন 0.75 μg/ml puromycin ধারণকারী মিডিয়া ব্যবহার করা শুরু করুন। 0.75 μg/ml puromycin ধারণকারী মিডিয়াতে কোষ বজায় রাখা চালিয়ে যান।

2) সঙ্গম হলে কোষ বিভক্ত করা উচিত।

3) কোষগুলিকে বিভক্ত করতে (প্রদত্ত ভলিউমগুলি ধরে নেওয়া হচ্ছে যে কোষগুলি একটি T25-এ রয়েছে):

উ: জীবাণুমুক্ত কৌশল ব্যবহার করে, মিডিয়া অপসারণ করুন এবং 2-3 মিলি জীবাণুমুক্ত HBSS দিয়ে ফ্লাস্ক ধুয়ে ফেলুন। HBSS সরান এবং বাতিল করুন।

B. 1 মিলি ট্রিপসিন যোগ করুন এবং 2-3 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন। কোষগুলিকে একটি উল্টানো অণুবীক্ষণ যন্ত্রের নীচে পরীক্ষা করা উচিত যে তারা গোলাকার, উত্তোলন এবং ভাসতে শুরু করেছে কিনা। যদি 3 মিনিটের পরে কোষগুলি বিচ্ছিন্ন না হয় তবে আপনি আরও 1-2 মিনিটের মধ্যে ইনকিউবেট করতে পারেন

C. টুপি শক্ত করুন এবং সমস্ত কোষগুলিকে অপসারণ করতে আলতোভাবে ফ্লাস্ককে পাশ থেকে এপাশে টিপ দিন। প্রয়োজনে কোষ আলগা করতে ফ্লাস্ককে পাশে হালকাভাবে ট্যাপ করা যেতে পারে।

D. ট্রিপসিন নিষ্ক্রিয় করার জন্য কোষগুলি ভেসে যাওয়ার সাথে সাথে ফ্লাস্কে 4 মিলি নতুন মিডিয়া যোগ করুন। প্লাস্টিক থেকে সমস্ত কোষ ধুয়ে দ্রবণে প্রবেশ করতে নতুন মিডিয়া দিয়ে ফ্লাস্কের পাশগুলি কয়েকবার ধুয়ে ফেলুন। কোষ ধারণকারী সমস্ত তরল সরান এবং একটি 15 মিলি শঙ্কুতে স্থানান্তর করুন (বা 50 মিলি যদি আপনি 3 বা তার বেশি ফ্লাস্ক পুল করেন)।

E. জীবাণুমুক্ত কৌশল ব্যবহার করে, একটি হেমাসিটোমিটারে গণনার জন্য একটি অ্যালিকোট সরান৷

F. যখন আপনি কোষ গণনা করছেন, বাকি দ্রবণটি ক্লিনিকাল সেন্ট্রিফিউজে 1000 rpms এ 5 মিনিটের জন্য কাটা উচিত।

4) আপনার সেল সংখ্যা গণনা করার পরে, 2.5 x 10 এ প্লেট কোষ5 কোষ প্রতি T 25 ফিল্টার শীর্ষ ফ্লাস্ক.

5) কোষগুলিকে প্রতি 2-3 দিনে 0.75 μg/ml পিউরোমাইসিনযুক্ত তাজা বৃদ্ধির মাধ্যম খাওয়াতে হবে।

জমে যাওয়া:

কোষগুলি 5x 10 এর কম নয় হিমায়িত করা উচিত5 কোষ /ml/cryovial বৃদ্ধির মিডিয়াতে 10% DMSO এবং 30% FBS রয়েছে৷ পিউরোমাইসিন ছাড়া এবং পরবর্তীতে রাতারাতি -80 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় একটি আইসোপ্রোপ্যানল ফ্রিজিং চেম্বারে রাখা হয়। পরের দিন তরল নাইট্রোজেনে স্থানান্তর করুন।

আরও তথ্যের জন্য অনুগ্রহ করে যোগাযোগ করুন:

লেসলি বি গর্ডন, এমডি, পিএইচডি

ব্রাউন ইউনিভার্সিটির পেডিয়াট্রিক্স রিসার্চ ওয়ারেন অ্যালপার্ট মেডিকেল স্কুল এবং পেডিয়াট্রিক্স বিভাগের অধ্যাপক, হাসব্রো চিলড্রেন হাসপাতাল, প্রভিডেন্স, অ্যানেস্থেশিয়ার RI বিভাগ, শিশু হাসপাতাল বোস্টন এবং হার্ভার্ড মেডিকেল স্কুল, বোস্টন, এমএ মেডিকেল ডিরেক্টর, প্রোজেরিয়া রিসার্চ ফাউন্ডেশন

ফোন: 978-535-2594
ফ্যাক্স: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

ওয়েন্ডি নরিস
পিআরএফ সেল এবং টিস্যু ব্যাংক
ফোন: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
bn_BDBengali