Tripsin

Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Hank's Balanced Salt Solution

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) kalsium Klorida, (-) magnesium klorida, (-) magnesium sulfat)

DMSO untuk Pembekuan

Kelas Kultur Sel DMSO

Sel akan tiba membeku di es kering pada konsentrasi sekitar 5 x 10⁵sel / vial

Protokol untuk pencairan fibroblas

1. Mencairkan sel dengan cepat dalam rendaman air 37 ° C.
2. Bersihkan bagian luar vial dengan 70% etanol.
3. Transfer sel-sel yang dicairkan ke labu T25 yang berisi 5 ml media pertumbuhan tanpa puromisin.
4. Tempatkan labu dalam inkubator 37 ° C semalaman.
5. Hari berikutnya, amati di bawah mikroskop untuk memastikan sel-selnya menempel.
6. Hapus media dan gantikan dengan media pertumbuhan baru.

Subkultur garis sel PRF

1) Ketika sel terbentuk dan tumbuh, mulailah menggunakan media yang mengandung 0.75 μg / ml puromisin. Teruskan mempertahankan sel-sel dalam media yang mengandung 0.75 μg / ml puromisin.

2) Sel harus dipecah saat confluent.

3) Untuk memecah sel (volume yang diberikan mengasumsikan sel dalam T25):

A. Menggunakan teknik steril, keluarkan media dan bilas labu dengan 2-3 ml HBSS steril. Hapus dan buang HBSS.

B. Tambahkan 1 ml trypsin dan inkubasi selama 2-3 menit. Sel harus diperiksa di bawah mikroskop terbalik untuk menentukan apakah mereka sudah mulai membulatkan, mengangkat dan mengapung. Jika sel tidak terlepas setelah 3 menit, Anda dapat menginkubasi 1-2 menit lainnya

C. Kencangkan tutup dan dengan perlahan ujung labu dari sisi ke sisi untuk mengusir semua sel. Labu dapat diketuk ringan di samping untuk melonggarkan sel jika diperlukan.

D. Tambahkan 4 ml media baru ke labu segera setelah sel mengambang untuk menonaktifkan trypsin. Bilas sisi-sisi labu beberapa kali dengan media baru untuk membersihkan semua sel dari plastik dan ke dalam larutan. Hapus semua sel yang mengandung cairan dan transfer ke kerucut 15ml (atau 50 ml jika Anda mengumpulkan 3 atau lebih banyak termos).

E. Menggunakan teknik steril, lepaskan alikuot untuk menghitung pada hemacytometer.

F. Saat Anda menghitung sel, sisa larutan harus dipintal dalam centrifuge klinis selama 5 menit di 1000 rpms.

4) Setelah menghitung jumlah sel Anda, lempeng sel pada 2.5 x 10⁵ sel per T 25 memfilter labu atas.

5) Sel harus diberi makan setiap 2-3 setiap hari dengan media pertumbuhan segar yang mengandung 0.75 μg / ml puromisin.

Pembekuan:

Sel harus dibekukan tidak kurang dari 5x 10⁵ sel / ml / cryovial di media pertumbuhan mengandung 10% DMSO dan 30% FBS tanpa puromisin dan selanjutnya ditempatkan dalam ruang pembekuan isopropanol pada -80 ° C semalam. Pindahkan ke nitrogen cair pada hari berikutnya.

Wendy Norris