Célula imortalizada
Protocolos de Cultura
Protocolo de Cultura Celular Imortalizado
Agradecemos ao Dr. Martin Dorf, da Harvard University, por generosamente gerar e fornecer as linhas de células imortalizadas ao PRF Cell & Tissue Bank. Obrigado.
As linhas celulares de PRF foram imortalizadas usando o seguinte protocolo:
Infecção por Retrovírus
A. Produzindo vírus: 12-24 horas antes da transfecção, células HEK293 de empacotamento foram colocadas em uma placa de 100 mm em 60-80% de confluência. Cada placa foi co-transfectada com 12μg de construção retroviral pBABE-puro (SV40T) e 12μg pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector. O meio de cultura foi aspirado 8-10 horas após a transfecção e substituído por 10ml de meio completo. A cultura foi incubada por 48-72 horas adicionais para atingir o título viral ideal.
B. Infectando células alvo: As células alvo foram colocadas em placas de 100 mm 12-18 horas antes da infecção. O meio das células de empacotamento foi coletado e filtrado por meio de acetato de celulose de 0.45 μm ou filtro polissulfônico. Uma vez que as células estavam 40-60% confluentes, 8 ml de meio contendo vírus com uma concentração final de 10 μg / ml de polibreno foi adicionado. Três rodadas de infecção foram realizadas sequencialmente, com ~ 12 horas de intervalo. O meio foi substituído após 24 horas de incubação.
C. Seleção de linhas celulares estáveis: 72 horas após a infecção, as células foram tripsinizadas, divididas em 1: 3 e transferidas para duas placas de 100 mm na presença de puromicina 3 μg / ml, mais uma placa controle sem antibiótico. O meio de cultura foi trocado a cada 2 ou 3 dias por aproximadamente 2 a 4 semanas para produzir linhas celulares estáveis.
Meios de crescimento
DMEM- Invitrogen # 11960-044 (glicose alta sem L-glutamina)
Soro fetal bovino 15% FBS
1% (1x) Penicilina-Estreptomicina (Invitrogen # 15140-122)
1% (1X) L-glutamina (Invitrogen # 25030-081)
0.75 μg / ml de puromicina (InvivoGen # ant-pr-1)
Trypsin
Tripsina EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)
Solução salina equilibrada de Hank
HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) cloreto de cálcio, (-) cloreto de magnésio, (-) sulfato de magnésio)
DMSO para congelamento
Classe de cultura celular DMSO
As células chegarão congeladas em gelo seco a uma concentração de aproximadamente 5 x 105células / frasco
Protocolo para descongelamento de fibroblastos
- Descongele as células rapidamente em um banho de água 37 ° C.
- Limpe a parte externa do frasco com etanol 70%.
- Transfira as células descongeladas para um balão T25 contendo 5 ml de meio de crescimento sem puromicina.
- Coloque o balão na incubadora 37 ° C durante a noite.
- No dia seguinte, observe ao microscópio para garantir que as células estejam conectadas.
- Remova a mídia e substitua por uma nova mídia de crescimento.
Subcultura de linhas celulares PRF
1) Quando as células são estabelecidas e crescem, comece a usar mídia contendo 0.75 μg / ml de puromicina. Continue a manter as células em meios contendo 0.75 μg / ml de puromicina.
2) As células devem ser divididas quando confluentes.
3) Para dividir células (os volumes fornecidos estão assumindo que as células estão em um T25):
A. Usando a técnica estéril, remova a mídia e enxágue o balão com 2-3 ml de HBSS estéril. Remova e descarte o HBSS.
B. Adicione 1 ml de tripsina e incube por minutos 2-3. As células devem ser verificadas sob um microscópio invertido para determinar se começaram a arredondar, levantar e flutuar. Se as células não forem desconectadas após os minutos 3, você poderá incubar outros minutos 1-2
C. Aperte a tampa e incline suavemente o balão de um lado para o outro para desalojar todas as células. O balão pode ser levemente batido na lateral para soltar as células, se necessário.
D. Adicione 4 ml de nova mídia ao balão assim que as células estiverem flutuando para desativar a tripsina. Lave as laterais do balão várias vezes com a nova mídia para lavar todas as células do plástico e entrar na solução. Remova todas as células que contêm líquidos e transfira para um cônico 15ml (ou 50 ml, se estiver reunindo balões 3 ou mais).
E. Usando a técnica estéril, remova uma alíquota para contar com um hemacitômetro.
F. Enquanto você conta células, o restante da solução deve ser girado na centrífuga clínica por minutos do 5 a 1000 rpms.
4) Depois de calcular sua contagem de células, placas de células em 2.5 x 105 células por balão superior do filtro T 25.
5) As células devem ser alimentadas todos os dias 2-3 com meio de crescimento fresco contendo 0.75 μg / ml de puromicina.
Congelando:
As células devem ser congeladas a pelo menos 5x 105 células / ml / criotubo em meios de crescimento contendo 10% DMSO e 30% FBS sem puromicina e subsequentemente colocado em uma câmara de congelamento de isopropanol a -80 ° C durante a noite. Transfira para o nitrogênio líquido no dia seguinte.
Para mais informação, por favor contactar:
Leslie B. Gordon, MD, PhD
Professor de Pediatrics Research Warren Alpert Medical School da Brown University e do Departamento de Pediatria, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Department of Anesthesia, Children's Hospital Boston e Harvard Medical School, Boston, MA Diretor Médico, The Progeria Research Foundation
Telefone: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
Wendy Norris
Telefone: 401-274 1122-x 48063
wnorris@lifespan.org
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