трипсин

Трипсин ЭДТА C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Сбалансированный солевой раствор Хэнка

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) хлорид кальция, (-) хлорид магния, (-) сульфат магния)

ДМСО для заморозки

Культура клеток, класс ДМСО

Клетки поступят замороженными на сухом льду в концентрации приблизительно 5 x 10⁵клеток / флакон

Протокол оттаивания фибробластов

1. Клетки быстро оттаивают на водяной бане 37 ° C.
2. Протрите флакон снаружи 70% этанолом.
3. Перенести оттаявшие клетки в колбу T25, содержащую 5 мл ростовой среды без пуромицина.
4. Поместите колбу в инкубатор 37 ° C на ночь.
5. На следующий день наблюдайте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки прикрепились.
6. Удалите носитель и замените его свежим носителем.

Субкультивирование клеточных линий PRF

1) Когда клетки создаются и растут, начинают использовать носитель, содержащий 0.75 мкг / мл пуромицина. Продолжать поддерживать клетки в среде, содержащей 0.75 мкг / мл пуромицина.

2) Клетки должны быть разделены при слиянии.

3) Чтобы разделить ячейки (данные объемы предполагают, что ячейки находятся в T25):

А. Используя стерильную технику, удалите носитель и промойте колбу с 2-3 мл стерильного HBSS. Удалите и откажитесь от HBSS.

B. Добавьте 1 мл трипсина и инкубируйте в течение минут 2-3. Клетки должны быть проверены под инвертированным микроскопом, чтобы определить, начали ли они округляться, подниматься и плавать. Если клетки не отсоединяются после минут 3, вы можете инкубировать еще минуты 1-2

C. Затяните крышку и осторожно опрокините колбу из стороны в сторону, чтобы сместить все ячейки. Колбу можно слегка постукивать по боковой поверхности, чтобы при необходимости ослабить ячейки.

D. Добавить 4 мл новой среды в колбу, как только клетки плавают, чтобы инактивировать трипсин. Промойте боковые стороны колбы новой средой, чтобы смыть все клетки с пластика и растворить в нем. Удалите всю жидкость, содержащую клетки, и перенесите ее в конус 15ml (или мл 50, если вы собираете колбу 3 или более)

E. Используя стерильную технику, удалите аликвоту для подсчета на гемоцитометре.

F. Во время подсчета клеток оставшуюся часть раствора следует вращать в клинической центрифуге в течение минут 5 при оборотах 1000.

4) После подсчета количества клеток, планшеты размером 2.5 x 10.⁵ ячеек на T 25 верхнюю часть колбы фильтра.

5) Клетки следует кормить каждые 2-3 дни свежей питательной средой, содержащей 0.75 мкг / мл пуромицина.

Замораживание:

Клетки должны быть заморожены в не менее чем 5x 10⁵ клеток / мл / криопробирка в СМИ роста содержащие 10% DMSO и 30% FBS без пуромицина и затем помещают в морозильную камеру с изопропанолом при -80 ° C на ночь. Перейдите на жидкий азот на следующий день.

Венди Норрис