불멸화된 세포
문화 프로토콜
불멸화된 세포 배양 프로토콜
하버드 대학의 마틴 도르프 박사가 PRF 세포 및 조직 은행에 불멸화된 세포주를 생성하여 제공해 주신 데 대해 감사드립니다. 감사합니다.
PRF 세포주는 다음 프로토콜을 사용하여 불멸화되었습니다.
레트로바이러스 감염
A. 바이러스 생성: 형질감염 12-24시간 전에 HEK293 패키징 세포를 60-80% 컨플루언시에서 100mm 플레이트에 도말했습니다. 각 플레이트는 12μg의 역전사 바이러스 구성체 pBABE-puro(SV40T)와 12μg의 pCL-Ampho 역전사 바이러스 패키징 벡터로 공동 형질감염되었습니다. 형질감염 8-10시간 후에 배양 배지를 흡인하고 10ml의 완전 배지로 교체했습니다. 배양물을 추가로 48-72시간 동안 배양하여 최적의 바이러스 역가를 얻었습니다.
B. 표적 세포 감염: 표적 세포는 감염 12-18시간 전에 100mm 플레이트에 도말했습니다. 포장 세포에서 배지를 수집하여 0.45-μm 셀룰로스 아세테이트 또는 폴리설폰 필터로 여과했습니다. 세포가 40-60% 합류되면 최종 농도가 10μg/ml 폴리브렌인 8ml 바이러스 함유 배지를 첨가했습니다. 3회 감염을 연속적으로 수행했으며, 약 12시간 간격을 두었습니다. 배지는 24시간 배양 후 교체했습니다.
C. 안정된 세포주 선택: 감염 72시간 후, 세포를 트립신 처리하고 1:3으로 분할하여 3 μg/ml 푸로마이신과 항생제가 없는 대조군 플레이트 1개가 있는 두 개의 100 mm 플레이트로 옮겼습니다. 배양 배지는 약 2~4주 동안 2~3일마다 교체하여 안정적인 세포주를 생산했습니다.
성장 매체
DMEM- Invitrogen #11960-044(L-글루타민이 없는 고농도 포도당)
15% FBS 태아우혈청
1%(1x) 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen#15140-122)
1%(1X) L-글루타민(Invitrogen#25030-081)
0.75 μg/ml 푸로마이신(InvivoGen #ant-pr-1)
트립신
트립신 EDTA C .25%(인비트로겐#25200-056)
핸크의 균형 소금 솔루션
HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) 염화칼슘, (-) 염화마그네슘, (-) 황산마그네슘)
동결을 위한 DMSO
세포 배양 등급 DMSO
세포는 약 5 x 10의 농도로 건조 얼음 위에 동결되어 도착합니다.5세포/바이알
섬유아세포 해동 프로토콜
- 37°C 수조에서 세포를 빠르게 녹입니다.
- 70% 에탄올로 바이알 외부를 닦습니다.
- 해동된 세포를 퓨로마이신이 없는 5ml의 성장 배지가 들어 있는 T25 플라스크로 옮깁니다.
- 플라스크를 37°C 인큐베이터에 밤새 넣어둡니다.
- 다음 날, 현미경으로 관찰하여 세포가 부착되었는지 확인하세요.
- 배지를 제거하고 새로운 성장 배지로 교체합니다.
PRF 세포주 하위 배양
1) 세포가 확립되고 성장하면 0.75 μg/ml puromycin이 포함된 배지를 사용하기 시작합니다. 0.75 μg/ml puromycin이 포함된 배지에서 세포를 계속 유지하십시오.
2) 세포는 합류할 때 분할되어야 합니다.
3) 셀 분할(주어진 볼륨은 셀이 T25에 있다고 가정함):
A. 멸균 기술을 사용하여 배지를 제거하고 2-3ml의 멸균 HBSS로 플라스크를 헹굽니다. HBSS를 제거하고 폐기합니다.
B. 트립신 1ml를 넣고 2-3분간 배양합니다. 세포를 역현미경으로 검사하여 둥글게 뭉쳐지고, 들어올려지고, 떠다니기 시작했는지 확인해야 합니다. 3분 후에도 세포가 분리되지 않으면 1-2분 더 배양할 수 있습니다.
C. 캡을 조이고 플라스크를 좌우로 살짝 기울여 모든 세포를 제거합니다. 필요한 경우 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 느슨하게 할 수 있습니다.
D. 세포가 떠다니는 즉시 플라스크에 새로운 배지 4ml를 넣어 트립신을 불활성화합니다. 플라스크 측면을 새로운 배지로 여러 번 헹구어 플라스틱에서 모든 세포를 씻어내고 용액으로 옮깁니다. 세포가 들어 있는 모든 액체를 제거하고 15ml 원뿔형(또는 3개 이상의 플라스크를 모을 경우 50ml)으로 옮깁니다.
E. 무균 기술을 사용하여 혈액을 채취하여 혈구계산기로 측정합니다.
F. 세포를 세는 동안 나머지 용액은 임상용 원심분리기에서 1000rpm으로 5분 동안 회전시켜야 합니다.
4) 세포 수를 계산한 후, 세포를 2.5 x 105 T 25 필터 상부 플라스크당 세포.
5) 세포에는 0.75 μg/ml의 퓨로마이신이 함유된 신선한 성장 배지를 2~3일마다 공급해야 합니다.
동결:
세포는 최소 5x 105 세포 /ml/cryovial 성장 매체에서 10% DMSO 및 30% FBS를 함유 푸로마이신 없이 그리고 그 후 -80°C의 이소프로판올 냉동실에 밤새 두었다. 다음 날 액체 질소로 옮긴다.
자세한 내용은 다음 주소로 문의하세요.
Leslie B. Gordon, MD, PhD
브라운 대학교의 Warren Alpert 의대 소아과 연구 교수, 로드아일랜드 주 프로비던스에 있는 Hasbro 어린이 병원 소아과, 보스턴 어린이 병원 마취과, 매사추세츠 주 보스턴에 있는 Harvard 의대, Progeria Research Foundation 의료 책임자
전화: 978-535-2594
팩스: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
웬디 노리스
전화: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org