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불멸의 세포

문화 프로토콜

 

불멸화 세포 배양 프로토콜

우리는 PRF 세포 및 조직 은행에 불멸화 된 세포주를 관대하게 생성하고 제공 한 하버드 대학의 Martin Dorf 박사에게 감사드립니다. 감사합니다.

PRF 세포주는 다음 프로토콜을 사용하여 불멸화되었다 :

레트로 바이러스 감염

A. 바이러스 생성 : 형질 감염 12-24 시간 전에, 패키징 HEK293 세포를 100-60 % 합류로 80-mm 플레이트에 플레이 팅 하였다. 각 플레이트를 12μg 레트로 바이러스 구축물 pBABE-puro (SV40T) 및 12μg pCL-Ampho 레트로 바이러스 패키징 벡터로 공동 형질 감염시켰다. 형질 감염 8-10 시간 후에 배양 배지를 흡인하고 10ml의 완전 배지로 교체 하였다. 최적의 바이러스 역가를 얻기 위해 배양 물을 추가 48-72 시간 동안 배양 하였다.

B. 감염 표적 세포 : 표적 세포를 감염 100-12 시간 전에 18mm 플레이트에 플레이 팅 하였다. 포장 셀의 배지를 수집하고 0.45μm 셀룰로오스 아세테이트 또는 폴리 설폰 필터를 통해 여과했습니다. 세포가 40-60 % 합류되면, 최종 농도가 8μg / ml 폴리 브렌 인 10ml 바이러스 함유 배지를 첨가했습니다. 세 라운드의 감염을 ~ 12 시간 간격으로 순차적으로 수행했습니다. 배지는 24 시간 배양 후 교체되었다.

C. 안정적인 세포주 선택 : 감염 72 시간 후, 세포를 트립신 처리하고, 1 : 3으로 분할하고, 100μg / ml 퓨로 마이신의 존재하에 3 개의 2mm 플레이트와 항생제가없는 대조군 플레이트로 옮겼다. 안정한 세포주를 생산하기 위해 약 3 ~ 2 주 동안 4 ~ XNUMX 일마다 배양액을 교체 하였다.

 

성장 미디어

DMEM-Invitrogen # 11960-044 (L- 글루타민이없는 고 포도당)

15 % FBS 태아 소 혈청

1 % (1x) 페니실린-스트렙토 마이신 (Invitrogen # 15140-122)

1 % (1X) L- 글루타민 (Invitrogen # 25030-081)

0.75 μg / ml 퓨로 마이신 (InvivoGen # ant-pr-1)

트립신

트립신 EDTA C .25 % (Invitrogen # 25200-056)

행크의 균형 잡힌 소금 솔루션

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) 염화칼슘, (-) 염화 마그네슘, (-) 황산 마그네슘)

냉동 용 DMSO

세포 배양 등급 DMSO

세포는 대략 5 x 10의 농도로 드라이 아이스에 얼려 도착합니다5세포 / 병

섬유 아세포 해동을위한 프로토콜

  1. 37 ° C 수조에서 빠르게 세포를 해동하십시오.
  2. 70 % 에탄올로 바이알 외부를 닦습니다.
  3. 푸로 마이신없이 25 ml의 성장 배지를 함유하는 T5 플라스크로 해동 된 세포를 옮긴다.
  4. 37 ° C 인큐베이터에 플라스크를 밤새 두십시오.
  5. 다음 날, 현미경으로 관찰하여 세포가 부착되었는지 확인하십시오.
  6. 미디어를 제거하고 새로운 성장 미디어로 교체하십시오.

PRF 세포주 배양

1) 세포가 확립되고 성장할 때, 0.75 μg / ml 푸로 마이신을 함유하는 배지를 사용하기 시작합니다. 0.75 μg / ml 퓨로 마이신을 함유하는 배지에서 세포를 계속 유지하십시오.

2) 셀은 합류 할 때 분할되어야합니다.

3) 셀을 분할하려면 (제공된 볼륨은 셀이 T25에 있다고 가정) :

A. 멸균 기술을 사용하여 2-3 ml의 멸균 HBSS로 배지를 제거하고 플라스크를 헹굽니다. HBSS를 제거하고 버립니다.

B. 1 ml 트립신을 첨가하고 2-3 분 동안 배양한다. 세포가 거꾸로 올라가고 올라 가기 시작했는지 확인하기 위해 역 현미경으로 세포를 점검해야합니다. 3 분 후에 셀이 분리되지 않으면 다른 1-2 분을 배양 할 수 있습니다

C. 뚜껑을 조이고 플라스크를 좌우로 부드럽게 기울여 모든 세포를 제거하십시오. 필요한 경우 플라스크를 가볍게 두드려 셀을 느슨하게 할 수 있습니다.

D. 트립신을 불 활성화시키기 위해 세포가 부유하자마자 4 ml의 새로운 배지를 플라스크에 첨가한다. 새로운 매체로 플라스크의 측면을 여러 번 헹구어 모든 세포를 플라스틱에서 용액으로 씻으십시오. 세포를 포함하는 모든 액체를 제거하고 15ml 원뿔형 (또는 50 이상의 플라스크를 모으는 경우 3 ml)으로 옮깁니다.

E. 멸균 기술을 사용하여 혈구 계수기를 세는 분취 량을 제거합니다.

F. 세포를 세는 동안 나머지 용액을 5 rpm에서 1000 분 동안 임상 원심 분리기에서 회전시켜야합니다.

4) 세포 수를 계산 한 후 2.5 x 10으로 세포를 플레이트합니다.5 T 25 필터 탑 플라스크 당 세포.

5) 2 μg / ml 퓨로 마이신을 함유 한 새로운 성장 배지를 3-0.75 일마다 세포에 공급해야합니다.

동결:

세포는 5x 10 이상에서 동결되어야합니다5 세포 / ml / 냉이 성장 미디어에서 10 % DMSO 및 30 % FBS 포함 퓨로 마이신없이 이어서 -80 ℃에서 밤새 이소프로판올 동결 챔버에 배치 하였다. 다음날 액체 질소로 옮깁니다.

자세한 내용은 다음 연락처로 문의하십시오.

Leslie B. Gordon, MD, PhD

브라운 대학교 워렌 알퍼트 의과 대학 및 소아과, 하스브로 아동 병원, 프로비던스, RI 마취과, 보스턴 아동 병원, 하버드 의과 대학, 보스턴, 매사추세츠 주, The Progeria Research Foundation 의료 이사

전화 번호 :978-535-2594
팩스 : 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

웬디 노리스
PRF 세포 및 조직 은행
전화 : 401-274-1122은 48063을 X
wnorris@lifespan.org