ಲಿಂಫೋಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಕೋಶ
ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ಗಳು
ರೂಪಾಂತರಗೊಂಡ ಲಿಂಫೋಸೈಟ್ಸ್ ಅನ್ನು ಬೆಳೆಸುವ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್
ಲಿಂಫೋಬ್ಲಾಸ್ಟ್ಗಳನ್ನು ಬೆಳೆಸುವ ಶಿಷ್ಟಾಚಾರ
ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮ
RPMI 1640 – ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ # 11875
15% ಭ್ರೂಣದ ಬೋವೈನ್ ಸೀರಮ್ (FBS) - ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ #10437-028
1% (1X) ಪೆನ್ಸಿಲಿನ್-ಸ್ಟ್ರೆಪ್ಟೊಮೈಸಿನ್ (ಐಚ್ಛಿಕ) – ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ #15140-122
ಸಾಮಾನ್ಯ ಟಿಪ್ಪಣಿಗಳು
- ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಯಾವಾಗಲೂ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್ನಲ್ಲಿ 37°C, 5% CO ನಲ್ಲಿ ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಬೇಕು.2 ಬಳಕೆಗೆ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಮೊದಲು
- ಯಾವಾಗಲೂ ವೆಂಟೆಡ್ ಕ್ಯಾಪ್ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.
- ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ಯಾವಾಗಲೂ ನೇರವಾದ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಕಾವು ಕೊಡಿ.
- T25 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ನಲ್ಲಿ 20 ಮಿಲಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಬಳಸಬಾರದು.
ಘನೀಕೃತ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸುವುದು
ಒಣಗಿದ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ 1 ಮಿಲಿ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸ್ವೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಾಗಿ ಕರಗುವವರೆಗೆ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಿ ಅಥವಾ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳನ್ನು ತಕ್ಷಣ ಪ್ರಾರಂಭಿಸದಿದ್ದರೆ ದ್ರವ ಸಾರಜನಕ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ. ಆದಾಗ್ಯೂ, ನಂತರದ ಬಳಕೆಗಾಗಿ ನೀವು ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು ಹೋದರೆ, ತಾಜಾ ಸ್ಟಾಕ್ಗಳನ್ನು ಬೆಳೆಸಲು ಮತ್ತು ಬಹು ಆಂಪೂಲ್ಗಳನ್ನು ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಕೋಶಗಳನ್ನು 45% RPMI-1640, 50% FBS, ಮತ್ತು 5% DMSO (ಅಂಗಾಂಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ದರ್ಜೆ) ನಲ್ಲಿ ಕ್ರಯೋಪ್ರೆಸರ್ವ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.
-
- 10 ಮಿಲಿ RPMI-1640, 15% ಭ್ರೂಣದ ಗೋವಿನ ಸೀರಮ್ (FBS), ± ಪ್ರತಿಜೀವಕಗಳನ್ನು T-25 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ನಲ್ಲಿ ವೆಂಟೆಡ್ ಕ್ಯಾಪ್ನೊಂದಿಗೆ ಇರಿಸಿ.
- 5% CO ನೊಂದಿಗೆ 37°C ಆರ್ದ್ರಗೊಳಿಸಿದ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್ನಲ್ಲಿ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಲು ಅನುಮತಿಸಿ.2 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಗಾಳಿಯಲ್ಲಿ. ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗಳನ್ನು ನೇರವಾದ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಇಡಬೇಕು.
- ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ಕೋಶಗಳ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಆಂಪೂಲ್ ಅಥವಾ ಸೀಸೆಯನ್ನು 37°C ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಬೆಚ್ಚಗಿನ ನೀರಿನ ಬೀಕರ್ನಲ್ಲಿ ಒಂದೊಂದಾಗಿ ಕರಗಿಸಿ.
- 70% ಎಥೆನಾಲ್ನಿಂದ ಆಂಪೂಲ್ ಅಥವಾ ಬಾಟಲಿಯ ಹೊರಭಾಗವನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಸ್ವಚ್ಛಗೊಳಿಸಿ. ಕೋಶಗಳು ಗಾಜಿನ ಆಂಪೂಲ್ನಲ್ಲಿದ್ದರೆ, ಬೆರಳುಗಳನ್ನು ಒಡೆದ ಗಾಜಿನಿಂದ ರಕ್ಷಿಸುವುದನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಆಂಪೂಲ್ ಅನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಒಡೆಯಿರಿ.
- 1 ಮಿಲಿ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಬರಡಾದ ಪೈಪೆಟ್ನಿಂದ ತೆಗೆದು 10 ಮಿಲಿ ಮಾಧ್ಯಮವಿರುವ ಟಿ -25 ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ. ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಕೋಶ ರೇಖೆಯನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿ.
- ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಅನ್ನು 5% CO ಹೊಂದಿರುವ 37°C ಆರ್ದ್ರಗೊಳಿಸಿದ ಇನ್ಕ್ಯುಬೇಟರ್ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ.2 ಗಾಳಿಯಲ್ಲಿ. ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ಗಳನ್ನು ನೇರವಾದ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಬೇಕು.
- 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ನ ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ ನೆಲೆಗೊಂಡಿರುವ ಲಿಂಫೋಸೈಟ್ಗಳಿಗೆ ತೊಂದರೆಯಾಗದಂತೆ ಮೇಲಿನಿಂದ 5 ಮಿಲಿ ಮಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಪೂರ್ವ-ಬೆಚ್ಚಗಾಗಿಸಿದ ಮಾಧ್ಯಮದ 5 ಮಿಲಿಯೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿ.
- ಲಿಂಫೋಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ನೊಂದಿಗೆ ಮುಂದುವರಿಯಿರಿ.
ಲಿಂಫೋಬ್ಲಾಸ್ಟ್ ಸಂಸ್ಕೃತಿ
-
- ಕರಗಿದ ಮೂರರಿಂದ ನಾಲ್ಕು ದಿನಗಳ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎಣಿಸಿ. ಕೋಶಗಳು ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಗುಂಪುಗಳಾಗಿ ಬೆಳೆಯುತ್ತವೆ. ಮೃದುವಾದ ಪೈಪ್ ಹಾಕುವ ಮೂಲಕ ಗುಂಪುಗಳನ್ನು ಒಡೆಯಿರಿ.
- ಕೋಶಗಳನ್ನು ಎಣಿಸಿ.
- ಆದರ್ಶಪ್ರಾಯವಾಗಿ, ಜೀವಕೋಶದ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 2 x 10 ಮೀರಬಾರದು.6 ಜೀವಕೋಶಗಳು/ಮಿ.ಲೀ.
- ಜೀವಕೋಶದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಪುನಃ ಪೋಷಿಸಿ, ವಿಭಜಿಸಿ ಅಥವಾ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಿ.
- 5-6 ಮಿಲಿ ಸಮತೋಲಿತ ಬೆಳವಣಿಗೆಯ ಮಾಧ್ಯಮವನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಮತ್ತೆ ತಿನ್ನಿಸಿ.
- 2 x 10 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿಲ್ಲದಂತೆ ಹೊಸ ಬೆಳೆಗಳನ್ನು ಬಿತ್ತನೆ ಮಾಡಿ.5 ಜೀವಕೋಶಗಳು/ಮಿ.ಲೀ.
- ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸರಿಸುಮಾರು 5 x 10 ನಲ್ಲಿ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಬೇಕು.6 ಜೀವಕೋಶಗಳು/ಮಿಲಿ. ಕೋಶ ಘನೀಕರಿಸುವ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಅನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ.
ಘನೀಕರಿಸುವ ಲಿಂಫೋಬ್ಲಾಸ್ಟ್ಗಳು
-
- ಕೋಶಗಳನ್ನು ಸರಿಸುಮಾರು 5 x 10 ನಲ್ಲಿ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಬೇಕು.6 ಜೀವಕೋಶಗಳು/ಮಿ.ಲೀ.
- 15 ಅಥವಾ 50 ಮಿಲಿ ಶಂಕುವಿನಾಕಾರದ ಕೊಳವೆಗೆ ಸೂಕ್ತ ಪ್ರಮಾಣದ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
- 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 100 xg ನಲ್ಲಿ 4°C ನಲ್ಲಿ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್.
- ಮಧ್ಯಮವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಿ ಮತ್ತು ಸರಿಯಾದ ಪ್ರಮಾಣದ ಶೀತ ಘನೀಕರಿಸುವ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಮತ್ತೆ ಇರಿಸಿ.
- ಪ್ರತಿಯೊಂದರಲ್ಲೂ 1 ಮಿಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕ್ರಯೋವಿಯಲ್ಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
- ಕ್ರಯೋವಿಯಲ್ಗಳನ್ನು ಫ್ರೀಜಿಂಗ್ ಚೇಂಬರ್ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಿಡೀ -80°C ತಾಪಮಾನದ ಫ್ರೀಜರ್ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಿ.
- ಮರುದಿನ ಕ್ರಯೋವಿಯಲ್ಗಳನ್ನು ದ್ರವ ಸಾರಜನಕಕ್ಕೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಿ.
ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ ದಯವಿಟ್ಟು ಸಂಪರ್ಕಿಸಿ:
ಲೆಸ್ಲಿ B. ಗಾರ್ಡನ್, MD, PhD
ಬ್ರೌನ್ ವಿಶ್ವವಿದ್ಯಾನಿಲಯದ ಪೀಡಿಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ಸಂಶೋಧನೆಯ ಪ್ರಾಧ್ಯಾಪಕ ವಾರೆನ್ ಆಲ್ಪರ್ಟ್ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಶಾಲೆ ಮತ್ತು ಪೀಡಿಯಾಟ್ರಿಕ್ಸ್ ವಿಭಾಗ, ಹ್ಯಾಸ್ಬ್ರೊ ಮಕ್ಕಳ ಆಸ್ಪತ್ರೆ, ಪ್ರಾವಿಡೆನ್ಸ್, ಅರಿವಳಿಕೆ RI ವಿಭಾಗ, ಮಕ್ಕಳ ಆಸ್ಪತ್ರೆ ಬೋಸ್ಟನ್ ಮತ್ತು ಹಾರ್ವರ್ಡ್ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಶಾಲೆ, ಬೋಸ್ಟನ್, MA ವೈದ್ಯಕೀಯ ನಿರ್ದೇಶಕ, ಪ್ರೊಜೆರಿಯಾ ಸಂಶೋಧನಾ ಪ್ರತಿಷ್ಠಾನ
ದೂರವಾಣಿ: 978-535-2594
ಫ್ಯಾಕ್ಸ್: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
ವೆಂಡಿ ನಾರ್ರಿಸ್
ದೂರವಾಣಿ: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org