پاڼه غوره کړئ

تل پاتې حجره

د کلتور پروتوکولونه

 

د امر شوي حجرې کلتور پروتوکول

موږ په هارورډ پوهنتون کې د ډاکټر مارتین دورف څخه مننه کوو چې په سخاوت سره یې د PRF حجرې او نسج بانک ته د تل پاتې حجرو لاینونه چمتو او چمتو کړي. له تاسو مننه.

د PRF سیل لینونه د لاندې پروتوکول په کارولو سره تل پاتې شوي:

Retrovirus انفیکشن

الف. د ویروس تولید: د انتقال څخه 12-24 ساعته مخکې، د HEK293 حجرې بسته بندي په 100-mm پلیټ کې د 60-80% کنفوسینسی کې پلی شوې. هر پلیټ د 12μg retroviral ساختمان pBABE-puro (SV40T) او 12μg pCL-Ampho Retrovirus بسته بندۍ ویکتور سره شریک شوی و. د کلتور منځنی د لیږد څخه 8-10 ساعته وروسته په تمه شوی، او د 10 ملی لیتر بشپړ منځنی سره بدل شوی. دا کولتور د 48-72 ساعتونو لپاره د اضافې لپاره انکیوب شوی و ترڅو غوره ویروس ټیکر ترلاسه کړي.

B. د هدف حجرو اخته کول: هدف حجرې د 12-18 ساعتو دمخه د 100 ملي میتر په تخته کې د انتان څخه مخکې پلی شوي. د بسته بندۍ حجرو څخه منځنی د 0.45-μm سیلولوز اسټیټ یا پولی سلفونیک فلټر له لارې راټول او فلټر شوی. یوځل چې حجرې د 40-60% سره یوځای شوي وي، 8 ملی لیتر ویروس لرونکی منځنی د 10 μg/ml پولیبرین وروستی غلظت سره اضافه شوی. د انفیکشن درې پړاوونه په ترتیب سره ترسره شوي، د 12 ساعتونو په توپیر. متوسط د 24 ساعتونو انکیوبیشن وروسته بدل شو.

ج. د مستحکم حجرو لینونو انتخاب: د انفیکشن څخه 72 ساعته وروسته، حجرې ټریپسین شوي، په 1:3 ویشل شوي او د 3 μg/ml puromycin په شتون کې دوه 100 mm پلیټونو ته لیږدول شوي، او همدارنګه د انټي بیوټیک پرته یو کنټرول پلیټ. د کلتور منځنی په هرو 2 یا 3 ورځو کې د نږدې 2 څخه تر 4 اونیو لپاره بدل شوی ترڅو د باثباته حجرو لینونه تولید کړي.

 

د ودې رسنۍ

DMEM- انویټروجن #11960-044 (د L-ګلوټامین پرته لوړ ګلوکوز)

15% FBS Fetal Bovine Serum

1% (1x) Penicillin-Streptomycin (Invitrogen#15140-122)

1% (1X) L-glutamine (Invitrogen#25030-081)

0.75 μg/ml puromycin (InvivoGen #ant-pr-1)

ټریپسین

Trypsin EDTA C.25% (Invitrogen#25200-056)

د هانک د متوازن مالګې حل

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) کلسیم کلورایډ، (-) مګنیزیم کلورایډ، (-) مګنیزیم سلفیټ)

د یخولو لپاره DMSO

د سیل کلتور درجه DMSO

حجرې به په وچه یخ کې منجمد شوي شاوخوا 5 x 10 غلظت کې راشي5حجرې/شیشې

د فایبروبلاستونو د غوړولو پروتوکول

  1. حجرې په چټکۍ سره د 37 درجې سانتي ګراد د اوبو حمام کې وغورځوئ.
  2. د شیشې بهر د 70% ایتانول سره پاک کړئ.
  3. پړسیدلي حجرې د T25 فلاسک ته انتقال کړئ چې 5 ملی لیتره د ودې میډیا لري پرته له puromycin.
  4. فلاسک د شپې په 37 درجو سانتي ګراد انکیوبیټر کې ځای په ځای کړئ.
  5. بله ورځ، د مایکروسکوپ لاندې وګورئ ترڅو ډاډ ترلاسه کړئ چې حجرې تړل شوي دي.
  6. رسنۍ لرې کړئ او د تازه ودې میډیا سره ځای په ځای کړئ.

د PRF سیل لینونو فرعي کلتور کول

1) کله چې حجرې جوړې او وده وکړي، د میډیا کارول پیل کړئ چې 0.75 μg/ml puromycin لري. په رسنیو کې د حجرو ساتلو ته دوام ورکړئ چې 0.75 μg/ml puromycin لري.

2) حجرې باید تقسیم شي کله چې یو ځای شي.

3) د حجرو ویشلو لپاره (د ورکړل شویو حجمونو څخه فرض کیږي چې حجرې په T25 کې دي):

الف. د جراثیم ضد تخنیک په کارولو سره، میډیا لرې کړئ او فلاسک د 2-3 ملی لیتر جراثیمي HBSS سره وینځئ. HBSS لرې او رد کړئ.

B. 1 ملی لیتر ټریپسین اضافه کړئ او د 2-3 دقیقو لپاره یې وینځئ. حجرې باید د التهاب مایکروسکوپ لاندې وڅیړل شي ترڅو معلومه کړي چې ایا دوی ګردیدل، پورته کول او تیریدل پیل کړي دي. که حجرې د 3 دقیقو وروسته جلا نه شي، تاسو ممکن د 1-2 دقیقو لپاره بل ځای ونیسئ

C. کیپ ټینګ کړئ او په نرمۍ سره فلاسک له یوې خوا څخه بلې خوا ته وخورئ ترڅو ټولې حجرې له مینځه ویسي. فلاسک ممکن د اړتیا په صورت کې د حجرو د خلاصولو لپاره په یو اړخ کې په نرمۍ سره ټپ شي.

D. کله چې حجرې د ټریپسین غیر فعالولو لپاره تیریږي نو په فلاسک کې 4 ملی لیتر نوي میډیا اضافه کړئ. د فلاسک اړخونه څو ځله د نوي میډیا سره مینځل کړئ ترڅو ټول حجرې له پلاستیک څخه پاک او محلول ته دننه کړئ. ټول مایع چې حجرې لري لرې کړئ او د 15 ملی لیتر مخروط (یا 50 ملی لیتر) ته یې واستوئ که تاسو 3 یا ډیر فلاسکونه راټول کړئ.

E. د جراثیم ضد تخنیک په کارولو سره، د هیماسایټومیټر د شمیرلو لپاره الیکوټ لرې کړئ.

F. پداسې حال کې چې تاسو د حجرو شمیرل کوئ، پاتې محلول باید په کلینیکي سنټرفیوج کې د 5 دقیقو لپاره په 1000 rpms کې واچول شي.

4) د خپل حجرو شمیر محاسبه کولو وروسته، په 2.5 x 10 کې حجرې پلیټ کړئ5 حجرې د T 25 فلټر ټاپ فلاسک لپاره.

5) حجرې باید په هرو 2-3 ورځو کې د تازه ودې په منځ کې چې 0.75 μg/ml puromycin ولري تغذیه شي.

یخ کول:

حجرې باید له 5x 10 څخه کم نه وي منجمد شي5 حجرې/ml/cryovial په وده رسنیو کې 10% DMSO او 30% FBS لري پرته له puromycin او وروسته د شپې په -80 ° C کې د isopropanol په یخچال کې کیښودل شي. بله ورځ مایع نایټروجن ته انتقال کړئ.

د نورو معلوماتو لپاره مهرباني وکړئ اړیکه ونیسئ:

لیسلي بی ګورډن، MD، PhD

د براون پوهنتون د ماشومانو د څیړنې پروفیسور وارن الپرټ طبي ښوونځي او د پیډیاټریکس ډیپارټمنټ ، د هاسبرو ماشومانو روغتون ، پروویډنس ، د انستیزیا RI څانګه ، د ماشومانو روغتون بوسټن او هارورډ میډیکل ښوونځی ، بوسټن ، د MA طبي رییس ، د پروجیریا ریسرچ فاونډیشن

تلیفون: 978-535-2594
فکس: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

وینډي نوریس
د PRF سیل او نسج بانک
تلیفون: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
psPashto