اماراتي حجره
د کلتور پروتوکولونه
د حجرو د فرهنګ اموریت پروتوکول
موږ په هارورډ پوهنتون کې د ډاکټر مارټین ډورف څخه مننه کوو چې د PRF حجرې او نسج بانک ته د املاکو حجرو لاینونو تولید او چمتو کولو لپاره په سخاوت سره. مننه.
د لاندې پروتوکول په کارولو سره د PRF ګرځنده تلیفونونه امور شوي:
ریٹرو وایرس انتان
د ویروس تولید: د لیږد دمخه 12-24 ساعته مخکې ، د HEK293 بسته بندي د 100-60 conf کنفیوژن په 80 ملي میتر کې پلیټ شوي و. هر پلیټ د 12μg retroviral جوړښت pBABE-puro (SV40T) او 12μg pCL-Ampho retrovirus بسته بندی ویکټر سره ګډ شوی و. د کلتور مینځمه د لیږد وروسته 8-10 ساعت وروسته تمه شوې ، او د 10ML بشپړ مینځپانګې سره ځای په ځای شوی. کلتور د اضافي 48-72 ساعت لپاره د مطلوب ویروس لقب ترلاسه کولو لپاره غوړ شوی و.
ب: د هدف حجرو باندې تاثیر کول: د هدف حجرې د ناروغۍ څخه دمخه د 100-12 ساعتونو په 18 ملي میتر کې پلیټ شوي و. د بسته بندۍ حجرو څخه مایع د 0.45-μm سیلولوز اسیتیټ یا پولیسلفونیک فلټر له لارې راټول شوي او فلټر شوي. یوځل چې حجرې 40-60 conf متناسب وې ، د 8 ملی لیترو ویروس لرونکي مایع د 10 μg / ml پولیبرین وروستی غلظت سره اضافه شوی. د انتاناتو درې پړاوونه په ترتیب ډول ترسره شوي ، د 12 ساعتونو سربیره. متوسط د 24 ساعت انکیوبیشن وروسته ځای په ځای شوی و.
ت) د ثابت حجرو لاینونو انتخاب: د انفیکشن څخه 72 ساعت وروسته ، حجرې تریپینس شوي ، په 1: 3 کې تقسیم شوي او دوه 100 ملي میتر ته د 3 omyg / ml puromycin په شتون کې لیږدول شوي ، جمع یو کنټرول پلیټ پرته د انټي بیوټیک څخه. د کلتور منځنۍ هره 2 یا 3 ورځې د نږدې 2 څخه تر 4 اونیو پورې بدل شوي ترڅو د حجرو مستحکم لاینونه تولید کړي.
وده میډیا
DMEM- Invitrogen # 11960-044 (له L - ګلوټامین پرته لوړ ګلوکوز)
د 15 F FBS جنین بیوین سیرم
د 1٪ (1x) پینسیلین - سټراټومیټین (انویټروجن # 15140-122)
1٪ (1X) L-glutamine (Invitrogen # 25030-081)
0.75 μg / ml puromycin (InvivoGen # ant-pr-1)
ټریپسن
د ټریپسن EDTA C. 25٪ (انویټروجن # 25200-056)
د هانک متوازن مالګه حل
HBSS- (د انټیټروجن # 14170 (1 X) (-) کلسیم کلورایډ ، (-) مګنیزیم کلوراید ، (-) مګنیزیم سلفیټ)
د یخولو لپاره DMSO
د سیل کلتور درجې DMSO
حجرې به د نږدې 5 x 10 غلظت کې په وچه یخ باندې منجمد راشي5حجرې / وایل
د فایبروبلاستونو ژوولو لپاره پروتوکول
- په 37 ° C د اوبو حمام کې په چټکۍ سره حجرې غوړ کړئ.
- د 70 et ایتانول سره د وایل بهر مسح کړئ.
- ژړل شوي حجرې د T25 فلاسک ته لیږدئ چې د 5 ملی لیتر ودې میډیا لري له پورومیسین پرته.
- په شپه کې په 37. C انکیوبیټر کې فلاسک ځای په ځای کړئ.
- په بله ورځ ، د مایکروسکوپ لاندې وګورئ ترڅو ډاډ ترلاسه کړئ چې حجرې تړلي دي.
- میډیا لرې کړئ او د تازه ودې رسنۍ سره ځای په ځای کړئ.
د PRF سیل سیل کرښې سبکول
1) کله چې حجرې تاسیس شوي او وده کوي ، د 0.75 μg / ml puromycin لرونکي میډیا کارول پیل کړئ. په رسنیو کې د حجرو ساتلو ته دوام ورکړئ په 0.75 μg / ml puromycin مشتمل.
2) حجرې باید تقسیم شي کله چې متوافق وي.
3) د حجرو ویشلو لپاره (ورکړل شوي مقدارونه د فرض کولو حجرې په T25 کې دي):
الف. د بې تعصب تخنیک په کارولو سره ، میډیا لرې کړئ او فلاسک یې د 2-3 ملی لیتره جراحي HBSS سره ومینځئ. د HBSS لرې کول او ګوښه کول.
B. د 1 ملی لیتر ټریپزین اضافه کړئ او د 2-3 دقیقو لپاره غوړ کړئ. حجرې باید د متغیر مایکروسکوپ لاندې وکتل شي ترڅو معلومه کړي چې ایا دوی پورته ، پورته کولو او تیرولو پیل کړی که نه. که چیرې حجرې د 3 دقیقو وروسته قطع نه شي ، تاسو ممکن د 1-2 دقیقې غوړ کړئ
ت) کیپ ټینګ کړئ او په نرمۍ سره فلاسک له غاړې څخه بل خوا ته واچوئ ترڅو ټولې حجرې خارج کړئ. فلاسک ممکن د اړتیا په صورت کې د حجرو خلاصیدو لپاره په لږه اندازه سره ټیپ شي.
D. د 4 ملی لیتره نوي میډیا فلاسک ته اضافه کړئ ځکه چې حجرې د تپپیسین غیر فعال کولو لپاره تیریږي. د نوي میډیا سره د فلسک اړخونه څو ځله پاک کړئ ترڅو ټول حجرې له پلاستيک څخه وینځئ او حل ته یې ولرئ. ټول مایع لرونکي حجرې لرې کړئ او 15ML کونیکي (یا 50 ml ته لیږدئ که چیرې تاسو 3 حوض یا ډیر فلسکونه ولرئ).
E. د تعقیم ټیکنالوژۍ په کارولو سره ، د هیماسیتومیتر حساب کولو لپاره یو القاب لرې کړئ.
F. پداسې حال کې چې تاسو حجرې حساب کوئ ، پاتې حل باید په 5 دقیقو لپاره په 1000 دقیقې لپاره په کلینیکي سنټرفیوج کې سپن شي.
4) ستاسو د حجرې محاسبې وروسته ، پلیټ حجرې په 2.5 x 10 کې5 حجرې په T TNNXX سر فلسک.
5) حجرې باید هره 2-3 ورځو کې خواړه ورکړل شي د تازه ودې درملو سره چې 0.75 μg / ml puromycin لري.
يخ وهل:
حجرې باید د 5x 10 څخه لږ نه کنګل شي5 حجرې / ml / cryovial په وده میډیا کې په 10٪ DMSO او 30٪ FBS لرئ پرته له puromycin او بیا وروسته په 80 ° C کې د اسوپروپانول کنګل چیمبر کې ځای په ځای شو. بله ورځ مایع نایټروجن ته واستوئ.
د نورو معلوماتو لپاره مهرباني وکړئ اړیکه ونیسئ:
لیسلی بی ګورډن ، MD ، پی ایچ ډی
د براډن پوهنتون د پیډیاټریکس ریسرچ پروفیسر وارین الپرټ میډیکل سکول او د ماشومانو د څانګې څانګې ، د هسبرو ماشومانو روغتون ، پروویډینشن ، د انستیزیا RI ډیپارټمنټ ، د ماشومانو روغتون بوسټن او هارورډ میډیکل سکول ، بوسټن ، د MA پروجیریا ریسرچ فاونډیشن.
تيليفون: 978-535-2594
فاکس: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
وینډي نوریس
تلیفون: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org
ثبت نام
زموږ لپاره
خبر پا !ه!
په ګډه ، موږ
به وشی
درملنه یې ومومئ!
