Трипсин

Трипсин EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Збалансований сольовий розчин Ханка

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) хлорид кальцію, (-) хлорид магнію, (-) сульфат магнію)

DMSO для заморожування

Культура клітин класу DMSO

Клітини надійдуть замороженими на сухому льоду в концентрації приблизно 5 x 10⁵клітини / флакон

Протокол відтавання фібробластів

1. Клітини відтають швидко на водяній бані 37 ° C.
2. Протріть зовнішню сторону флакона 70% етанолом.
3. Переморожені клітини перенесіть у колбу T25, що містить 5 мл ростового середовища без пуроміцину.
4. Поставте колбу в інкубатор 37 ° C на ніч.
5. Наступного дня спостерігайте під мікроскопом, щоб переконатися, що клітини прикріпилися.
6. Видаліть носії та замініть свіжими носіями для росту.

Субкультура PR-клітинних ліній

1) Коли клітини створюються і ростуть, починають використовувати носії, що містять 0.75 мкг / мл пуроміцину. Продовжуйте підтримувати клітини в середовищі, що містить 0.75 мкг / мл пуроміцину.

2) Клітини слід розщеплювати при злитті.

3) Для розділення комірок (наведені томи припускають, що клітини знаходяться в T25):

A. Використовуючи стерильну техніку, видаліть носій і промийте колбу 2-3 мл стерильного HBSS. Видаліть та відкиньте HBSS.

B. Додайте трипсин 1 ml та інкубуйте протягом 2-3 хв. Клітини слід перевірити під перевернутим мікроскопом, щоб визначити, чи почали вони округлятися, підніматися та плавати. Якщо комірки не відокремлюються через 3 хв., Ви можете інкубувати ще 1-2 хв.

C. Затягніть ковпачок і обережно наконечником колбу з боку в бік, щоб перемістити всі комірки. Колбу можна злегка натиснути на бік, щоб послабити комірки, якщо потрібно.

D. Додайте 4 мл нового носія в колбу, як тільки клітини пливуть, щоб інактивувати трипсин. Кілька разів промийте сторони колби новим носієм, щоб вимити всі клітини із пластику та розчину. Видаліть всі клітини, що містять рідину, і перенесіть у коні 15ml (або 50 ml, якщо ви об'єднуєте колби 3 або більше).

E. Використовуючи стерильну техніку, видаліть аликвоту для підрахунку гемацитометра.

F. Поки ви підраховуєте клітини, решту розчину слід закрутити в клінічній центрифузі протягом 5 хв при 1000 rpms.

4) Після підрахунку кількості клітин, клітини планшета мають розмір 2.5 х 10⁵ комірки на верхню колбу фільтра X 25.

5) Клітини слід годувати кожні 2-3 дня свіжим ростовим середовищем, що містить 0.75 мкг / мл пуроміцину.

Заморожування:

Клітини повинні бути заморожені не менше ніж 5x 10⁵ клітини / мл / кріоїаль у ЗМІ для зростання містять 10% DMSO і 30% FBS без пуроміцину і потім поміщають в камеру заморожування ізопропанолу при температурі -80 ° C протягом ночі. Перенесіть до рідкого азоту на наступний день.

Венді Норріс