Увічнена клітина
Протоколи культури
Протокол імморталізованої культури клітин
Ми дякуємо доктору Мартіну Дорфу з Гарвардського університету за щедру генерацію та надання увічнених клітинних ліній PRF Cell & Tissue Bank. дякую
Клітинні лінії PRF були увічнені за допомогою наступного протоколу:
Ретровірусна інфекція
A. Виробник вірусу: За 12-24 години до трансфекції клітини HEK293, що упаковуються, висівали на 100-мм пластину при злитті 60-80%. Кожен планшет був спільно трансфікований 12 мкг ретровірусної конструкції pBABE-puro (SV40T) і 12 мкг pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector. Культуральне середовище відсмоктували через 8-10 годин після трансфекції та замінювали 10 мл повного середовища. Культуру інкубували протягом додаткових 48-72 годин для досягнення оптимального титру вірусу.
B. Інфікування клітин-мішеней: Цільові клітини висівали на 100-мм пластину за 12-18 годин до зараження. Середовище з пакувальних клітин збирали та фільтрували через 0,45-мкм ацетат целюлози або полісульфоновий фільтр. Коли клітини були конфлюентні 40-60%, додавали 8 мл середовища, що містить вірус, з кінцевою концентрацією полібрену 10 мкг/мл. Три раунди зараження проводили послідовно з інтервалом приблизно 12 годин. Середовище замінювали після 24 годин інкубації.
C. Відбір стабільних клітинних ліній: Через 72 години після інфікування клітини трипсинували, розділяли у співвідношенні 1:3 і переносили на дві 100-мм чашки в присутності 3 мкг/мл пуроміцину плюс одну контрольну чашку без антибіотика. Культуральне середовище змінювали кожні 2 або 3 дні протягом приблизно 2-4 тижнів для отримання стабільних клітинних ліній.
Growth Media
DMEM- Invitrogen #11960-044 (високий рівень глюкози без L-глутаміну)
15% FBS Ембріональна бичача сироватка
1% (1x) пеніцилін-стрептоміцин (Invitrogen#15140-122)
1% (1X) L-глутамін (Invitrogen#25030-081)
0,75 мкг/мл пуроміцину (InvivoGen #ant-pr-1)
Трипсин
Трипсин EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)
Збалансований сольовий розчин Хенка
HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) хлорид кальцію, (-) хлорид магнію, (-) сульфат магнію)
ДМСО для заморожування
Клітинна культура класу ДМСО
Клітини надходитимуть замороженими на сухому льоду в концентрації приблизно 5 x 105клітин/флакон
Протокол розморожування фібробластів
- Швидко розморозьте клітини на водяній бані при 37 °C.
- Протріть флакон зовні етанолом 70%.
- Перенесіть розморожені клітини в колбу T25, що містить 5 мл середовища для росту без пуроміцину.
- Помістіть колбу в інкубатор при 37°C на ніч.
- Наступного дня спостерігайте під мікроскопом, щоб переконатися, що клітини прикріпилися.
- Видаліть середовище та замініть його свіжим середовищем для росту.
Субкультура клітинних ліній PRF
1) Коли клітини створені та ростуть, почніть використовувати середовище, що містить 0,75 мкг/мл пуроміцину. Продовжуйте підтримувати клітини в середовищі, що містить 0,75 мкг/мл пуроміцину.
2) Клітини повинні бути розділені, коли зливаються.
3) Щоб розділити клітини (наведені об’єми припускаються, що клітини знаходяться в T25):
A. Використовуючи стерильну техніку, видаліть середовище та промийте колбу 2-3 мл стерильного HBSS. Видаліть і викиньте HBSS.
B. Додайте 1 мл трипсину та інкубуйте 2-3 хвилини. Клітини слід перевірити під інвертованим мікроскопом, щоб визначити, чи почали вони округлятися, підніматися та спливати. Якщо клітини не відокремлюються через 3 хвилини, ви можете інкубувати ще 1-2 хвилини
C. Затягніть кришку та обережно нахиліть колбу з боку в бік, щоб видалити всі клітини. За потреби колбу можна злегка постукати збоку, щоб послабити клітини.
D. Додайте 4 мл нового середовища в колбу, як тільки клітини спливуть, щоб інактивувати трипсин. Кілька разів промийте стінки колби новим середовищем, щоб змити всі клітини з пластику та потрапити в розчин. Видаліть всю рідину, що містить клітини, і перенесіть у конічну колбу об’ємом 15 мл (або 50 мл, якщо ви об’єднуєте 3 або більше колб).
E. Використовуючи стерильну техніку, відібрати аліквоту для підрахунку на гемацитометрі.
F. Поки ви підраховуєте клітини, решту розчину слід обертати в клінічній центрифузі протягом 5 хвилин при 1000 об/хв.
4) Після розрахунку кількості клітин помістіть клітини розміром 2,5 x 105 клітин на верхню колбу фільтра Т 25.
5) Клітини слід підживлювати кожні 2-3 дні свіжим ростовим середовищем, що містить 0,75 мкг/мл пуроміцину.
Заморожування:
Клітини слід заморожувати не менше ніж 5x105 клітин /мл/кріопробір у ростових середовищах містить 10% DMSO і 30% FBS без пуроміцину і згодом поміщають в ізопропанолову морозильну камеру при -80°C на ніч. Наступного дня переведіть у рідкий азот.
Для отримання додаткової інформації звертайтеся до:
Леслі Б. Гордон, доктор медичних наук, доктор філософії
Професор педіатричних досліджень Уоррен Альперт, медична школа Університету Брауна та кафедра педіатрії, дитяча лікарня Хасбро, Провіденс, штат Род-Айленд, відділ анестезії, дитяча лікарня Бостона та Гарвардська медична школа, Бостон, медичний директор, Фонд досліджень прогерії
Телефон: 978-535-2594
Факс: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
Венді Норріс
Телефон: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org