Обрати сторінку

Увічнена клітина

Протоколи культури

 

Протокол імморталізованої культури клітин

Ми дякуємо доктору Мартіну Дорфу з Гарвардського університету за щедру генерацію та надання увічнених клітинних ліній PRF Cell & Tissue Bank. дякую

Клітинні лінії PRF були увічнені за допомогою наступного протоколу:

Ретровірусна інфекція

A. Виробник вірусу: За 12-24 години до трансфекції клітини HEK293, що упаковуються, висівали на 100-мм пластину при злитті 60-80%. Кожен планшет був спільно трансфікований 12 мкг ретровірусної конструкції pBABE-puro (SV40T) і 12 мкг pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector. Культуральне середовище відсмоктували через 8-10 годин після трансфекції та замінювали 10 мл повного середовища. Культуру інкубували протягом додаткових 48-72 годин для досягнення оптимального титру вірусу.

B. Інфікування клітин-мішеней: Цільові клітини висівали на 100-мм пластину за 12-18 годин до зараження. Середовище з пакувальних клітин збирали та фільтрували через 0,45-мкм ацетат целюлози або полісульфоновий фільтр. Коли клітини були конфлюентні 40-60%, додавали 8 мл середовища, що містить вірус, з кінцевою концентрацією полібрену 10 мкг/мл. Три раунди зараження проводили послідовно з інтервалом приблизно 12 годин. Середовище замінювали після 24 годин інкубації.

C. Відбір стабільних клітинних ліній: Через 72 години після інфікування клітини трипсинували, розділяли у співвідношенні 1:3 і переносили на дві 100-мм чашки в присутності 3 мкг/мл пуроміцину плюс одну контрольну чашку без антибіотика. Культуральне середовище змінювали кожні 2 або 3 дні протягом приблизно 2-4 тижнів для отримання стабільних клітинних ліній.

 

Growth Media

DMEM- Invitrogen #11960-044 (високий рівень глюкози без L-глутаміну)

15% FBS Ембріональна бичача сироватка

1% (1x) пеніцилін-стрептоміцин (Invitrogen#15140-122)

1% (1X) L-глутамін (Invitrogen#25030-081)

0,75 мкг/мл пуроміцину (InvivoGen #ant-pr-1)

Трипсин

Трипсин EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

Збалансований сольовий розчин Хенка

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) хлорид кальцію, (-) хлорид магнію, (-) сульфат магнію)

ДМСО для заморожування

Клітинна культура класу ДМСО

Клітини надходитимуть замороженими на сухому льоду в концентрації приблизно 5 x 105клітин/флакон

Протокол розморожування фібробластів

  1. Швидко розморозьте клітини на водяній бані при 37 °C.
  2. Протріть флакон зовні етанолом 70%.
  3. Перенесіть розморожені клітини в колбу T25, що містить 5 мл середовища для росту без пуроміцину.
  4. Помістіть колбу в інкубатор при 37°C на ніч.
  5. Наступного дня спостерігайте під мікроскопом, щоб переконатися, що клітини прикріпилися.
  6. Видаліть середовище та замініть його свіжим середовищем для росту.

Субкультура клітинних ліній PRF

1) Коли клітини створені та ростуть, почніть використовувати середовище, що містить 0,75 мкг/мл пуроміцину. Продовжуйте підтримувати клітини в середовищі, що містить 0,75 мкг/мл пуроміцину.

2) Клітини повинні бути розділені, коли зливаються.

3) Щоб розділити клітини (наведені об’єми припускаються, що клітини знаходяться в T25):

A. Використовуючи стерильну техніку, видаліть середовище та промийте колбу 2-3 мл стерильного HBSS. Видаліть і викиньте HBSS.

B. Додайте 1 мл трипсину та інкубуйте 2-3 хвилини. Клітини слід перевірити під інвертованим мікроскопом, щоб визначити, чи почали вони округлятися, підніматися та спливати. Якщо клітини не відокремлюються через 3 хвилини, ви можете інкубувати ще 1-2 хвилини

C. Затягніть кришку та обережно нахиліть колбу з боку в бік, щоб видалити всі клітини. За потреби колбу можна злегка постукати збоку, щоб послабити клітини.

D. Додайте 4 мл нового середовища в колбу, як тільки клітини спливуть, щоб інактивувати трипсин. Кілька разів промийте стінки колби новим середовищем, щоб змити всі клітини з пластику та потрапити в розчин. Видаліть всю рідину, що містить клітини, і перенесіть у конічну колбу об’ємом 15 мл (або 50 мл, якщо ви об’єднуєте 3 або більше колб).

E. Використовуючи стерильну техніку, відібрати аліквоту для підрахунку на гемацитометрі.

F. Поки ви підраховуєте клітини, решту розчину слід обертати в клінічній центрифузі протягом 5 хвилин при 1000 об/хв.

4) Після розрахунку кількості клітин помістіть клітини розміром 2,5 x 105 клітин на верхню колбу фільтра Т 25.

5) Клітини слід підживлювати кожні 2-3 дні свіжим ростовим середовищем, що містить 0,75 мкг/мл пуроміцину.

Заморожування:

Клітини слід заморожувати не менше ніж 5x105 клітин /мл/кріопробір у ростових середовищах містить 10% DMSO і 30% FBS без пуроміцину і згодом поміщають в ізопропанолову морозильну камеру при -80°C на ніч. Наступного дня переведіть у рідкий азот.

Для отримання додаткової інформації звертайтеся до:

Леслі Б. Гордон, доктор медичних наук, доктор філософії

Професор педіатричних досліджень Уоррен Альперт, медична школа Університету Брауна та кафедра педіатрії, дитяча лікарня Хасбро, Провіденс, штат Род-Айленд, відділ анестезії, дитяча лікарня Бостона та Гарвардська медична школа, Бостон, медичний директор, Фонд досліджень прогерії

Телефон: 978-535-2594
Факс: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Венді Норріс
PRF Банк клітин і тканин
Телефон: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
ukUkrainian