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Unsterbliche Zelle

Kulturprotokolle

 

Immortalized Cell Culture Protocol

Wir danken Dr. Martin Dorf von der Harvard University für die großzügige Erzeugung und Bereitstellung der immortalisierten Zelllinien für die PRF Cell & Tissue Bank. Vielen Dank.

PRF-Zelllinien wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls immortalisiert:

Retrovirus-Infektion

A. Virus erzeugen: 12 bis 24 Stunden vor der Transfektion wurden Verpackungs-HEK293-Zellen auf einer 100 mm-Platte bei 60 bis 80% Konfluenz ausplattiert. Jede Platte wurde mit 12 & mgr; g retroviralem Konstrukt pBABE-puro (SV40T) und 12 & mgr; g pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector co-transfiziert. Das Kulturmedium wurde 8 bis 10 Stunden nach der Transfektion abgesaugt und durch 10 ml vollständiges Medium ersetzt. Die Kultur wurde weitere 48 bis 72 Stunden inkubiert, um einen optimalen Virustiter zu erreichen.

B. Infizieren von Zielzellen: Die Zielzellen wurden 100 bis 12 Stunden vor der Infektion auf eine 18 mm Platte ausplattiert. Das Medium aus Verpackungszellen wurde gesammelt und durch ein 0.45 & mgr; m Celluloseacetat- oder Polysulfonfilter filtriert. Sobald die Zellen zu 40-60% konfluent waren, wurden 8 ml virushaltiges Medium mit einer Endkonzentration von 10 & mgr; g / ml Polybren zugegeben. Drei Infektionsrunden wurden nacheinander im Abstand von ~ 12 Stunden durchgeführt. Das Medium wurde nach 24-stündiger Inkubation ersetzt.

C. Auswahl stabiler Zelllinien: 72 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen trypsiniert, 1: 3 aufgeteilt und in Gegenwart von 100 & mgr; g / ml Puromycin plus einer Kontrollplatte ohne Antibiotikum auf zwei 3 mm-Platten übertragen. Das Kulturmedium wurde etwa 2 bis 3 Wochen lang alle 2 oder 4 Tage gewechselt, um stabile Zelllinien herzustellen.

 

Wachstumsmedien

DMEM-Invitrogen # 11960-044 (hohe Glukose ohne L-Glutamin)

15% FBS Fötales Rinderserum

1% (1x) Penicillin-Streptomycin (Invitrogen # 15140-122)

1% (1X) L-Glutamin (Invitrogen # 25030-081)

0.75 μg / ml Puromycin (InvivoGen # ant-pr-1)

Trypsin

Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Hanks ausgewogene Salzlösung

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) Calciumchlorid, (-) Magnesiumchlorid, (-) Magnesiumsulfat)

DMSO zum Einfrieren

Zellkulturgrad DMSO

Die Zellen werden auf Trockeneis mit einer Konzentration von ungefähr 5 x 10 eingefroren ankommen5Zellen / Fläschchen

Protokoll zum Auftauen von Fibroblasten

  1. Tauen Sie die Zellen schnell in einem 37 ° C Wasserbad auf.
  2. Wischen Sie die Außenseite der Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab.
  3. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in einen T25-Kolben, der 5 ml Wachstumsmedium ohne Puromycin enthält.
  4. Den Kolben über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C stellen.
  5. Beobachten Sie am nächsten Tag unter dem Mikroskop, ob die Zellen angeheftet sind.
  6. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Wachstumsmedium.

Subkultur von PRF-Zelllinien

1) Wenn sich Zellen gebildet haben und wachsen, beginnen Sie mit der Verwendung von Medien, die 0.75 μg / ml Puromycin enthalten. Bewahren Sie die Zellen weiterhin in Medien auf, die 0.75 μg / ml Puromycin enthalten.

2) Zellen sollten geteilt werden, wenn sie zusammenfließen.

3) Aufteilen von Zellen (die angegebenen Volumes setzen voraus, dass sich die Zellen in einem T25 befinden):

A. Entfernen Sie das Medium unter Anwendung der Steriltechnik und spülen Sie den Kolben mit 2-3 ml sterilem HBSS aus. HBSS entfernen und entsorgen.

B. Gib 1 ml Trypsin hinzu und inkubiere für 2-3 Minuten. Die Zellen sollten unter einem umgekehrten Mikroskop überprüft werden, um festzustellen, ob sie angefangen haben, sich aufzurunden, anzuheben und zu schweben. Wenn sich die Zellen nach 3 Minuten nicht lösen, können Sie weitere 1-2 Minuten inkubieren

C. Den Deckel festziehen und den Kolben vorsichtig von einer Seite zur anderen kippen, um alle Zellen zu entfernen. Der Kolben kann bei Bedarf leicht seitlich angeklopft werden, um die Zellen zu lockern.

D. Gib 4 ml neues Medium in den Kolben, sobald die Zellen schwimmen, um das Trypsin zu inaktivieren. Die Flaschenseiten mehrmals mit dem neuen Medium abspülen, um alle Zellen vom Kunststoff und in die Lösung zu waschen. Entfernen Sie alle Flüssigkeiten, die Zellen enthalten, und übertragen Sie sie in einen konischen 15ml-Behälter (oder 50 ml, wenn Sie 3- oder mehrere Kolben zusammenlegen).

E. Mit steriler Technik ein Aliquot zum Zählen auf einem Hämazytometer entnehmen.

F. Während Sie die Zellen zählen, sollte der Rest der Lösung in der klinischen Zentrifuge für 5 Minuten bei 1000 U / min zentrifugiert werden.

4) Nachdem Sie Ihre Zellzahl berechnet haben, plattieren Sie die Zellen mit 2.5 x 105 Zellen pro T 25 Filterkolben.

5) Die Zellen sollten alle 2-3 Tage mit frischem Wachstumsmedium gefüttert werden, das 0.75 μg / ml Puromycin enthält.

Einfrieren:

Zellen sollten mit mindestens 5x 10 eingefroren werden5 Zellen / ml / Kryovial in Wachstumsmedien enthält 10% DMSO und 30% FBS ohne Puromycin und anschließend über Nacht bei -80 ° C in eine Isopropanol-Gefrierkammer gegeben. Am nächsten Tag in den flüssigen Stickstoff umfüllen.

Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Professor für Pädiatrieforschung Warren Alpert Medical School der Brown University und Abteilung für Pädiatrie, Hasbro Kinderkrankenhaus, Providence, RI Abteilung für Anästhesie, Kinderkrankenhaus Boston und Harvard Medical School, Boston, MA Ärztlicher Direktor, The Progeria Research Foundation

Telefon: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
Leslie_Gordon@brown.edu

Wendy Norris
PRF Cell and Tissue Bank
Telefon: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org