Trypsin

Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Hanks ausgewogene Salzlösung

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) Calciumchlorid, (-) Magnesiumchlorid, (-) Magnesiumsulfat)

DMSO zum Einfrieren

Zellkulturgrad DMSO

Die Zellen werden auf Trockeneis mit einer Konzentration von ungefähr 5 x 10 eingefroren ankommen⁵Zellen / Fläschchen

Protokoll zum Auftauen von Fibroblasten

1. Tauen Sie die Zellen schnell in einem 37 ° C Wasserbad auf.
2. Wischen Sie die Außenseite der Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab.
3. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in einen T25-Kolben, der 5 ml Wachstumsmedium ohne Puromycin enthält.
4. Den Kolben über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C stellen.
5. Beobachten Sie am nächsten Tag unter dem Mikroskop, ob die Zellen angeheftet sind.
6. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Wachstumsmedium.

Subkultur von PRF-Zelllinien

1) Wenn sich Zellen gebildet haben und wachsen, beginnen Sie mit der Verwendung von Medien, die 0.75 μg / ml Puromycin enthalten. Bewahren Sie die Zellen weiterhin in Medien auf, die 0.75 μg / ml Puromycin enthalten.

2) Zellen sollten geteilt werden, wenn sie zusammenfließen.

3) Aufteilen von Zellen (die angegebenen Volumes setzen voraus, dass sich die Zellen in einem T25 befinden):

A. Entfernen Sie das Medium unter Anwendung der Steriltechnik und spülen Sie den Kolben mit 2-3 ml sterilem HBSS aus. HBSS entfernen und entsorgen.

B. Gib 1 ml Trypsin hinzu und inkubiere für 2-3 Minuten. Die Zellen sollten unter einem umgekehrten Mikroskop überprüft werden, um festzustellen, ob sie angefangen haben, sich aufzurunden, anzuheben und zu schweben. Wenn sich die Zellen nach 3 Minuten nicht lösen, können Sie weitere 1-2 Minuten inkubieren

C. Den Deckel festziehen und den Kolben vorsichtig von einer Seite zur anderen kippen, um alle Zellen zu entfernen. Der Kolben kann bei Bedarf leicht seitlich angeklopft werden, um die Zellen zu lockern.

D. Gib 4 ml neues Medium in den Kolben, sobald die Zellen schwimmen, um das Trypsin zu inaktivieren. Die Flaschenseiten mehrmals mit dem neuen Medium abspülen, um alle Zellen vom Kunststoff und in die Lösung zu waschen. Entfernen Sie alle Flüssigkeiten, die Zellen enthalten, und übertragen Sie sie in einen konischen 15ml-Behälter (oder 50 ml, wenn Sie 3- oder mehrere Kolben zusammenlegen).

E. Mit steriler Technik ein Aliquot zum Zählen auf einem Hämazytometer entnehmen.

F. Während Sie die Zellen zählen, sollte der Rest der Lösung in der klinischen Zentrifuge für 5 Minuten bei 1000 U / min zentrifugiert werden.

4) Nachdem Sie Ihre Zellzahl berechnet haben, plattieren Sie die Zellen mit 2.5 x 10⁵ Zellen pro T 25 Filterkolben.

5) Die Zellen sollten alle 2-3 Tage mit frischem Wachstumsmedium gefüttert werden, das 0.75 μg / ml Puromycin enthält.

Einfrieren:

Zellen sollten mit mindestens 5x 10 eingefroren werden⁵ Zellen / ml / Kryovial in Wachstumsmedien enthält 10% DMSO und 30% FBS ohne Puromycin und anschließend über Nacht bei -80 ° C in eine Isopropanol-Gefrierkammer gegeben. Am nächsten Tag in den flüssigen Stickstoff umfüllen.

Wendy Norris