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Cellule Immortalisée

Protocoles de culture

 

Protocole de culture cellulaire immortalisée

Nous remercions le Dr Martin Dorf de l'Université de Harvard d'avoir généreusement généré et fourni les lignées cellulaires immortalisées à la banque de cellules et de tissus PRF. Merci.

Les lignées cellulaires de PRF ont été immortalisées en utilisant le protocole suivant:

Infection à rétrovirus

A. Virus producteur: 12 à 24 heures avant la transfection, les cellules HEK293 d'emballage ont été étalées sur une plaque de 100 mm à 60-80% de confluence. Chaque plaque a été co-transfectée avec 12 ug de construction rétrovirale pBABE-puro (SV40T) et 12 ug de vecteur d'empaquetage pCL-Ampho Retrovirus. Le milieu de culture a été aspiré 8 à 10 heures après la transfection et remplacé par 10 ml de milieu complet. La culture a été incubée pendant 48 à 72 heures supplémentaires pour atteindre un titre viral optimal.

B. Infecter les cellules cibles: Les cellules cibles ont été plaquées sur une plaque de 100 mm 12 à 18 heures avant l'infection. Le milieu des cellules de conditionnement a été collecté et filtré à travers un acétate de cellulose de 0.45 µm ou un filtre polysulfonique. Une fois que les cellules étaient à 40-60% de confluence, 8 ml de milieu contenant le virus avec une concentration finale de 10 ug / ml de polybrène ont été ajoutés. Trois cycles d'infection ont été effectués séquentiellement, à environ 12 heures d'intervalle. Le milieu a été remplacé après 24 heures d'incubation.

C. Sélection de lignées cellulaires stables: 72 h après l'infection, les cellules ont été trypsinisées, divisées à 1: 3 et transférées dans deux plaques de 100 mm en présence de 3 pg / ml de puromycine, plus une plaque témoin sans antibiotique. Le milieu de culture a été changé tous les 2 ou 3 jours pendant environ 2 à 4 semaines pour produire des lignées cellulaires stables.

 

Milieu de croissance

DMEM- Invitrogen # 11960-044 (taux de glucose élevé sans L-glutamine)

Sérum de veau fœtal 15% FBS

1% (1x) Pénicilline-Streptomycine (Invitrogen # 15140-122)

1% (1X) L-glutamine (Invitrogen # 25030-081)

0.75 μg / ml de puromycine (InvivoGen # ant-pr-1)

Trypsine

Trypsine EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Solution saline équilibrée de Hank

HBSS- (Invitrogen # 14170 (1X) (-) chlorure de calcium, (-) chlorure de magnésium, (-) sulfate de magnésium)

DMSO pour la congélation

Grade de culture cellulaire DMSO

Les cellules arriveront congelées sur de la neige carbonique à une concentration d'environ 5 x 105cellules / flacon

Protocole de décongélation des fibroblastes

  1. Décongeler rapidement les cellules dans un bain-marie 37 ° C.
  2. Essuyez l'extérieur du flacon avec 70% d'éthanol.
  3. Transférer les cellules décongelées dans un ballon T25 contenant 5 ml de milieu de croissance sans puromycine.
  4. Placer le ballon dans l'incubateur 37 ° C pendant la nuit.
  5. Le lendemain, observez au microscope pour vous assurer que les cellules sont bien attachées.
  6. Retirez le support et remplacez-le par un support de croissance frais.

Sous-culture de lignées de cellules PRF

1) Une fois les cellules établies et en croissance, commencez à utiliser un milieu contenant 0.75 μg / ml de puromycine. Continuez à maintenir les cellules dans un milieu contenant 0.75 μg / ml de puromycine.

2) Les cellules doivent être scindées lorsqu'elles sont confluentes.

3) Pour diviser des cellules (les volumes indiqués supposent que les cellules se trouvent dans un T25):

A. En utilisant une technique stérile, retirez le milieu et rincez le ballon avec 2-3 ml de HBSS stérile. Retirez et jetez HBSS.

B. Ajouter 1 ml de trypsine et incuber pendant minutes 2-3. Les cellules doivent être vérifiées au microscope inversé pour déterminer si elles ont commencé à se rassembler, se soulever et flotter. Si les cellules ne sont pas détachées après les minutes 3, vous pouvez incuber une autre minute 1-2.

C. Serrez le capuchon et basculez délicatement le ballon d'un côté à l'autre pour déloger toutes les cellules. La fiole peut être tapotée légèrement sur le côté pour décoller les cellules si nécessaire.

D. Ajouter 4 ml de nouveau milieu dans la fiole dès que les cellules flottent pour inactiver la trypsine. Rincez plusieurs fois les parois du ballon avec le nouveau milieu pour éliminer toutes les cellules du plastique et de la solution. Retirez tout le liquide contenant des cellules et transférez-le dans un 15ml conique (ou 50 ml si vous regroupez 3 ou plusieurs flacons).

E. En utilisant une technique stérile, prélevez une aliquote pour la compter sur un hémacytomètre.

F. Pendant que vous comptez les cellules, le reste de la solution doit être centrifugé dans la centrifugeuse clinique pendant quelques minutes 5 à 1000.

4) Après avoir calculé votre nombre de cellules, plaquez les cellules à 2.5 x 105 cellules par T flacon à filtre 25.

5) Les cellules doivent être alimentées tous les jours 2-3 avec un milieu de culture frais contenant du puromycine 0.75 en µg / ml.

Gel:

Les cellules doivent être congelées à au moins 5x 105 cellules / ml / cryovial dans les milieux de croissance contenant 10% DMSO et 30% FBS sans puromycine et ensuite placé dans une chambre de congélation d'isopropanol à -80 ° C pendant une nuit. Transférer dans l'azote liquide le lendemain.

Pour plus d'informations, veuillez contacter:

Leslie B. Gordon, MD, PhD

Professeur de recherche en pédiatrie Warren Alpert Medical School of Brown University and Department of Pediatrics, Hasbro Children's Hospital, Providence, RI Department of Anesthesia, Children's Hospital Boston and Harvard Medical School, Boston, MA Directeur médical, The Progeria Research Foundation

Téléphone: 978-535-2594
Fax: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

Wendy Norris
Banque de cellules et tissus PRF
Téléphone: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org