منتخب کریں صفحہ

لافانی سیل

ثقافت پروٹوکول

 

امر سیل کلچر پروٹوکول

ہم ہارورڈ یونیورسٹی میں ڈاکٹر مارٹن ڈورف کا پی آر ایف سیل اینڈ ٹشو بینک کو فراخ دلی سے سیل لائنز تیار کرنے اور فراہم کرنے پر ان کا شکریہ ادا کرتے ہیں۔ شکریہ

مندرجہ ذیل پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے PRF سیل لائنوں کو امر کردیا گیا تھا۔

ریٹرو وائرس انفیکشن

A. وائرس تیار کرنا: منتقلی سے 12-24 گھنٹہ پہلے ، پیکیجنگ HEK293 خلیوں کو 100 ملی میٹر پلیٹ پر 60-80٪ سنگم پر چڑھایا گیا تھا۔ ہر پلیٹ میں 12μg ریٹرو وائرل کنسٹرکٹ پی بی بی ای پورو (ایس وی 40 ٹی) اور 12μg پی سی ایل-امفو ریٹرو وائرس پیکیجنگ ویکٹر کے ساتھ مشترکہ منتقلی کی گئی تھی۔ تمدن کے ذریعہ کلچر میڈیم 8-10 گھنٹوں کی خواہش مند تھا ، اور اس کی جگہ 10 ملی لٹر مکمل میڈیم سے لی گئی تھی۔ زیادہ سے زیادہ وائرل ٹائٹر حاصل کرنے کے ل The اس کلچر کو اضافی 48-72 گھنٹے کی ترغیب دی گئی تھی۔

B. ہدف خانوں کو متاثر کرنا: انفیکشن سے 100-12 گھنٹہ پہلے ہدف کے خلیوں کو 18 ملی میٹر پلیٹ پر چڑھایا گیا تھا۔ پیکیجنگ سیلز کا میڈیم 0.45 -mm سیلولوز ایسیٹیٹ یا پولی سلفونک فلٹر کے ذریعے جمع کیا گیا تھا اور اسے فلٹر کیا گیا تھا۔ ایک بار جب خلیات 40-60٪ متضاد تھے تو ، 8 ملی لیٹر وائرس پر مشتمل درمیانے درجے کی آخری حراستی کے ساتھ 10 μg / یمیل پولیبرین شامل کیا گیا تھا۔ انفیکشن کے تین راؤنڈ یکساں طور پر انجام دیئے گئے ، ~ 12 گھنٹے کے علاوہ۔ میڈیم 24 گھنٹے انکیوبیشن کے بعد تبدیل کیا گیا تھا۔

سی. مستحکم سیل لائنوں کا انتخاب: انفیکشن کے بعد 72 گھنٹوں کے بعد ، خلیوں کو ٹرپسنائز کیا گیا ، 1: 3 پر تقسیم ہوا اور 100 μg / ml puromycin کی موجودگی میں دو 3 ملی میٹر پلیٹوں میں ، نیز اینٹی بائیوٹک کے بغیر ایک کنٹرول پلیٹ میں منتقل کردیا گیا۔ مستحکم سیل لائنز تیار کرنے کے ل approximately تقریبا 2 سے 3 ہفتوں کے لئے ثقافت کا وسط ہر 2 یا 4 دن میں تبدیل کیا جاتا تھا۔

 

گروتھ میڈیا

ڈی ایم ای ایم - انویٹروجن # 11960-044 (L- گلوٹامین کے بغیر اعلی گلوکوز)

15٪ FBS برانن بویائن سیرم

1٪ (1x) Penicillin-Streptomycin (Invitrogen # 15140-122)

1٪ (1X) L-glutamine (Invitrogen # 25030-081)

0.75 μg / ml puromycin (InvivoGen # ant-pr-1)

ٹرپسن

ٹرپسن EDTA C .25٪ (انویٹروجن # 25200-056)

ہانک کا متوازن نمک حل

HBSS- (انویٹروجن # 14170 (1 ایکس) (-) کیلشیم کلورائد ، (-) میگنیشیم کلورائد ، (-) میگنیشیم سلفیٹ)

منجمد کرنے کے لئے ڈی ایم ایس او

سیل کلچر گریڈ DMSO

خشک برف پر خشک برف کے خانے تقریباUM 5 x 10 کی تعداد میں جمع ہوجائیں گے5خلیات / شیشی

fibroblasts پگھلنے کے لئے پروٹوکول

  1. 37 ° C پانی کے غسل میں خلیوں کو تیزی سے پگھلا دو۔
  2. 70٪ ایتھنول کے ساتھ شیشی کے باہر کا صفایا کریں۔
  3. پگھلے ہوئے خلیوں کو کسی T25 فلاسک میں منتقل کریں ، جس میں 5 ملی لیٹر پرپروومیسن کے بغیر نمو والے میڈیا شامل ہوں۔
  4. رات بھر 37. C انکیوبیٹر میں فلاسک رکھیں۔
  5. اگلے دن ، خلیوں کے ساتھ منسلک ہونے کو یقینی بنانے کے لئے خوردبین کے نیچے مشاہدہ کریں۔
  6. میڈیا کو ہٹا دیں اور تازہ نمو والے میڈیا کے ساتھ تبدیل کریں۔

ذیلی ثقافتی PRF سیل لائنیں

1) جب خلیات قائم اور بڑھتے ہیں تو ، 0.75 μg / ml puromycin پر مشتمل میڈیا استعمال کرنا شروع کریں۔ 0.75 μg / ml puromycin پر مشتمل میڈیا میں خلیوں کو برقرار رکھنا جاری رکھیں۔

2) ملحق ہونے پر خلیوں کو تقسیم کرنا چاہئے۔

3) خلیوں کو تقسیم کرنے کے ل given (دی گئی مقدار میں یہ خیال کیا جارہا ہے کہ خلیات T25 میں ہیں):

A. جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے ، میڈیا کو ہٹا دیں اور جراثیم سے پاک HBSS کے 2-3 ملی لیٹر کے ساتھ فلاسک کللا دیں۔ HBSS کو ہٹا دیں اور خارج کردیں۔

B. 1 ملی لیٹر ٹرپسن شامل کریں اور 2-3 منٹ کے لئے تیار کریں۔ سیلوں کو الٹی مائکروسکوپ کے تحت جانچنا چاہئے تاکہ اس بات کا پتہ لگایا جاسکے کہ آیا انھوں نے پکڑ دھکڑ ، لفٹ اور تیرنا شروع کردیا ہے۔ اگر خلیوں کو 3 منٹ کے بعد علیحدہ نہیں کیا گیا ہے تو ، آپ دوسرا 1-2 منٹ انکیوبیٹ کرسکتے ہیں۔

C. تمام خلیوں کو بے دخل کرنے کے ل cap ٹوپی کو مضبوطی سے اور آہستہ سے فلاسک کو ٹپ کریں۔ ضرورت پڑنے پر خلیوں کو ڈھیلنے کے لئے فلاسک کو ہلکے سے ٹیپ کیا جاسکتا ہے۔

D. جیسے ہی خلیات ٹرپسن کو غیر فعال کرنے کے لئے تیر رہے ہوں تو فلاسک میں 4 ملی لیٹر نئے میڈیا کو شامل کریں۔ پلاسٹک سے دور اور حل کے ل all ، تمام خلیوں کو دھونے کے ل new ، نئے میڈیا کے ساتھ کئی بار فلاسک کے اطراف کو کللا دیں۔ تمام مائع والے خلیوں کو ہٹا دیں اور ایک 15ML مخروطہ پر منتقل کریں (یا اگر آپ 50 یا اس سے زیادہ فلاسکس لگا رہے ہو تو 3 ملی لیٹر)۔

E. جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے ، hemacytometer پر گنتی کے لئے ایک الیوکوٹ کو ہٹا دیں۔

F. جب آپ خلیوں کی گنتی کررہے ہیں تو ، باقی حل 5 rpms پر 1000 منٹ کے لئے کلینیکل سنٹری فیوج میں کٹانا چاہئے۔

4) اپنے خلیے کی گنتی کے حساب سے ، پلیٹ سیلز 2.5 x 10 پر5 سیل فی T 25 فلٹر ٹاپ فلاسک۔

5) خلیوں کو ہر 2-3 دن کھلایا جانا چاہئے جس میں 0.75 μg / ml puromycin پر مشتمل تازہ اضافہ ہوتا ہے۔

منجمد:

خلیات کو 5x 10 سے کم نہیں منجمد ہونا چاہئے5 خلیات / ملی لیٹر / cryovial نمو میڈیا میں 10٪ DMSO اور 30٪ FBS پر مشتمل ہے بغیر کسی puromycin کے اور اس کے بعد -80 ° C پر راتوں رات ایک آئوسوپروانول فریزنگ چیمبر میں رکھا گیا۔ اگلے دن مائع نائٹروجن میں منتقل کریں۔

مزید معلومات کے لئے رابطہ کریں:

لیسلی بی گورڈن ، ایم ڈی ، پی ایچ ڈی

پیڈیاٹرکس ریسرچ پروفیسر وارین الپرٹ میڈیکل اسکول آف براؤن یونیورسٹی اور شعبہ اطفالیات ، ہسبرو چلڈرن ہسپتال ، پروویڈنس ، آر آئی ڈیپارٹمنٹ اینستھیزیا ، چلڈرن ہسپتال بوسٹن اور ہارورڈ میڈیکل اسکول ، بوسٹن ، ایم اے میڈیکل ڈائریکٹر ، پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن

فون: 978-535-2594
فیکس: 508 543 0377
lgordon@progeriaresearch.org

وینڈی نورس
PRF سیل اور ٹشو بینک
فون: 401-274-1122 x 48063
wnorris@lifespan.org