لافانی سیل
کلچر پروٹوکولز
لافانی سیل کلچر پروٹوکول
ہم ہارورڈ یونیورسٹی میں ڈاکٹر مارٹن ڈورف کا شکریہ ادا کرتے ہیں کہ انہوں نے PRF سیل اور ٹشو بینک کو لافانی سیل لائنیں تیار کرنے اور فراہم کیں۔ شکریہ
PRF سیل لائنوں کو مندرجہ ذیل پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے امر کر دیا گیا تھا۔
ریٹرو وائرس انفیکشن
A. وائرس پیدا کرنا: منتقلی سے 12-24 گھنٹے پہلے، پیکیجنگ HEK293 سیلز کو 100-mm پلیٹ پر 60-80% سنگم پر چڑھایا گیا تھا۔ ہر پلیٹ کو 12μg retroviral construct pBABE-puro (SV40T) اور 12μg pCL-Ampho Retrovirus پیکیجنگ ویکٹر کے ساتھ باہم منتقل کیا گیا تھا۔ کلچر میڈیم کو ٹرانسفیکشن کے 8-10 گھنٹے بعد تیار کیا گیا تھا، اور اسے 10 ملی لیٹر مکمل میڈیم سے بدل دیا گیا تھا۔ زیادہ سے زیادہ وائرل ٹائٹر حاصل کرنے کے لیے کلچر کو اضافی 48-72 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔
B. ٹارگٹ سیلز کو متاثر کرنا: ٹارگٹ سیلز کو انفیکشن سے 12-18 گھنٹے پہلے 100 ملی میٹر پلیٹ پر چڑھایا گیا تھا۔ پیکیجنگ سیلز سے میڈیم کو 0.45-μm سیلولوز ایسیٹیٹ یا پولی سلفونک فلٹر کے ذریعے اکٹھا اور فلٹر کیا گیا تھا۔ ایک بار جب خلیات 40-60% سنگم تھے، 10 μg/ml پولی برین کی حتمی حراستی کے ساتھ 8 ملی لیٹر وائرس پر مشتمل میڈیم شامل کیا گیا۔ انفیکشن کے تین راؤنڈ ترتیب وار کئے گئے، ~ 12 گھنٹے کے علاوہ۔ میڈیم کو 24 گھنٹے انکیوبیشن کے بعد تبدیل کیا گیا۔
C. مستحکم سیل لائنوں کا انتخاب: انفیکشن کے 72 گھنٹے بعد، خلیات کو ٹرپسنائز کیا گیا، 1:3 پر تقسیم کیا گیا اور 3 μg/ml puromycin کی موجودگی میں دو 100 mm پلیٹوں میں منتقل کر دیا گیا، نیز ایک کنٹرول پلیٹ بغیر اینٹی بائیوٹک کے۔ مستحکم سیل لائنز پیدا کرنے کے لیے کلچر میڈیم کو تقریباً 2 سے 4 ہفتوں کے لیے ہر 2 یا 3 دن میں تبدیل کیا جاتا تھا۔
گروتھ میڈیا
DMEM- Invitrogen #11960-044 (L-glutamine کے بغیر ہائی گلوکوز)
15% FBS فیٹل بووائن سیرم
1% (1x) Penicillin-Streptomycin (Invitrogen#15140-122)
1% (1X) L-glutamine (Invitrogen#25030-081)
0.75 μg/ml puromycin (InvivoGen #ant-pr-1)
ٹرپسن
Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)
ہانک کا متوازن نمک حل
HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) کیلشیم کلورائیڈ، (-)میگنیشیم کلورائیڈ، (-) میگنیشیم سلفیٹ)
منجمد کرنے کے لیے DMSO
سیل کلچر گریڈ DMSO
خلیے تقریباً 5 x 10 کے ارتکاز میں خشک برف پر منجمد ہو کر پہنچیں گے۔5خلیات/شیشی
فائبرو بلاسٹس کو پگھلانے کا پروٹوکول
- 37 ڈگری سینٹی گریڈ پانی کے غسل میں خلیوں کو تیزی سے پگھلا دیں۔
- 70% ایتھنول سے شیشی کے باہر کا حصہ صاف کریں۔
- پگھلے ہوئے خلیوں کو ایک T25 فلاسک میں منتقل کریں جس میں 5 ملی لیٹر گروتھ میڈیا پرومائیسن کے بغیر ہو۔
- فلاسک کو رات بھر 37 ° C انکیوبیٹر میں رکھیں۔
- اگلے دن، خلیات منسلک ہونے کو یقینی بنانے کے لیے خوردبین کے نیچے مشاہدہ کریں۔
- میڈیا کو ہٹا دیں اور تازہ گروتھ میڈیا سے تبدیل کریں۔
PRF سیل لائنوں کی ذیلی ثقافت
1) جب خلیے قائم اور بڑھ رہے ہوں تو 0.75 μg/ml puromycin پر مشتمل میڈیا استعمال کرنا شروع کریں۔ 0.75 μg/ml puromycin پر مشتمل میڈیا میں خلیات کو برقرار رکھنا جاری رکھیں۔
2) سنگم ہونے پر خلیات کو تقسیم کیا جانا چاہئے۔
3) خلیات کو تقسیم کرنے کے لیے (دیے گئے حجم یہ فرض کر رہے ہیں کہ خلیات T25 میں ہیں):
A. جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے، میڈیا کو ہٹا دیں اور فلاسک کو 2-3 ملی لیٹر جراثیم سے پاک HBSS سے دھو لیں۔ HBSS کو ہٹائیں اور ضائع کریں۔
B. 1 ملی لیٹر ٹرپسن شامل کریں اور 2-3 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔ خلیات کو الٹی خوردبین کے نیچے چیک کیا جانا چاہئے تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا انہوں نے گول کرنا، اٹھانا اور تیرنا شروع کر دیا ہے۔ اگر خلیات 3 منٹ کے بعد الگ نہیں ہوتے ہیں، تو آپ مزید 1-2 منٹ تک انکیوبیٹ کر سکتے ہیں۔
C. ٹوپی کو سخت کریں اور تمام خلیات کو ہٹانے کے لیے فلاسک کو ایک طرف سے دوسری طرف آہستہ سے ٹپ کریں۔ اگر ضرورت ہو تو خلیات کو ڈھیلا کرنے کے لیے فلاسک کو ایک طرف ہلکے سے ٹیپ کیا جا سکتا ہے۔
D. جیسے ہی خلیے ٹرپسن کو غیر فعال کرنے کے لیے تیر رہے ہوں فلاسک میں 4 ملی لیٹر نیا میڈیا شامل کریں۔ فلاسک کے اطراف کو کئی بار نئے میڈیا کے ساتھ کللا کریں تاکہ تمام خلیات کو پلاسٹک سے ہٹا کر محلول میں داخل کیا جا سکے۔ خلیوں پر مشتمل تمام مائع کو ہٹا دیں اور 15 ملی لیٹر مخروطی (یا 50 ملی لیٹر اگر آپ 3 یا اس سے زیادہ فلاسکس جمع کر رہے ہیں) میں منتقل کریں۔
E. جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے، ہیماسیٹومیٹر پر شمار کرنے کے لیے ایک ایلی کوٹ کو ہٹا دیں۔
F. جب آپ خلیات کی گنتی کر رہے ہوں، باقی محلول کو 1000 rpms پر 5 منٹ کے لیے کلینکل سینٹری فیوج میں کاتا جانا چاہیے۔
4) اپنے سیل کی گنتی کا حساب لگانے کے بعد، سیل کو 2.5 x 10 پر پلیٹ کریں۔5 سیل فی ٹی 25 فلٹر ٹاپ فلاسک۔
5) خلیوں کو ہر 2-3 دن بعد تازہ گروتھ میڈیم کے ساتھ کھلایا جانا چاہیے جس میں 0.75 μg/ml puromycin ہو۔
جمنا:
خلیوں کو 5x 10 سے کم پر منجمد کیا جانا چاہئے۔5 خلیات /ml/cryovial نمو میڈیا میں 10% DMSO اور 30% FBS پر مشتمل ہے۔ puromycin کے بغیر اور اس کے بعد رات بھر -80 ° C پر ایک isopropanol فریزنگ چیمبر میں رکھا جاتا ہے۔ اگلے دن مائع نائٹروجن میں منتقل کریں۔
مزید معلومات کے لیے برائے مہربانی رابطہ کریں:
لیسلی بی گورڈن، ایم ڈی، پی ایچ ڈی
براؤن یونیورسٹی کے پیڈیاٹرکس ریسرچ وارن الپرٹ میڈیکل سکول کے پروفیسر اور شعبہ اطفال، ہاسبرو چلڈرن ہسپتال، پروویڈنس، RI ڈیپارٹمنٹ آف اینستھیزیا، چلڈرن ہسپتال بوسٹن اور ہارورڈ میڈیکل سکول، بوسٹن، ایم اے میڈیکل ڈائریکٹر، دی پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن۔
فون: 978-535-2594
فیکس: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
وینڈی نورس
فون: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org