Өлмейтін жасуша
Мәдениет хаттамалары
Өлмейтін жасуша мәдениетінің хаттамасы
Біз Гарвард университетіндегі доктор Мартин Дорфқа PRF Cell & Tissue Bank-ке өлмейтін жасушалық желілерді жомарттықпен жасап, қамтамасыз еткені үшін алғыс айтамыз. Рақмет сізге.
PRF жасуша желілері келесі хаттама арқылы өлместендірілді:
Ретровирусты инфекция
A. Вирус өндіруші: Трансфекциядан 12-24 сағат бұрын HEK293 қаптамасының жасушалары 60-80% түйіскен жерінде 100 мм пластинаға салынды. Әрбір пластина 12 мкг ретровирустық құрылым pBABE-puro (SV40T) және 12 мкг pCL-Amfo ретровирусты орау векторымен бірге трансфекцияланды. Қоректік орта трансфекциядан кейін 8-10 сағаттан соң сорылып, 10 мл толық ортамен ауыстырылды. Оңтайлы вирустық титрге жету үшін культура қосымша 48-72 сағат инкубацияланды.
B. Мақсатты жасушаларды жұқтыру: Мақсатты жасушалар инфекциядан 12-18 сағат бұрын 100 мм пластинамен қапталған. Қаптама жасушаларындағы орта жиналып, 0,45 мкм целлюлоза ацетаты немесе полисульфониялық сүзгі арқылы сүзілді. Жасушалар 40-60% қосылғаннан кейін, соңғы концентрациясы 10 мкг/мл полибрен болатын 8 мл вирусы бар орта қосылды. Инфекцияның үш раундты ~12 сағат аралықпен дәйекті түрде орындалды. Орта 24 сағат инкубациядан кейін ауыстырылды.
C. Тұрақты жасуша сызықтарын таңдау: Инфекциядан кейін 72 сағаттан кейін жасушалар трипсинизацияланды, 1:3 қатынасында бөлініп, 3 мкг/мл пуромицин, плюс антибиотиксіз бір бақылау тақтасы қатысуымен екі 100 мм пластиналарға ауыстырылды. Тұрақты жасуша линияларын шығару үшін культура ортасы шамамен 2-4 апта бойы әрбір 2 немесе 3 күн сайын ауыстырылды.
Өсу медиасы
DMEM- Invitrogen #11960-044 (L-глутаминсіз жоғары глюкоза)
15% FBS ұрықтың сиыр сарысуы
1% (1x) пенициллин-стрептомицин (Инвитроген#15140-122)
1% (1X) L-глутамин (Invitrogen#25030-081)
0,75 мкг/мл пуромицин (InvivoGen #ant-pr-1)
Трипсин
Трипсин EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)
Хэнктің теңдестірілген тұз ерітіндісі
HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) кальций хлориді, (-) магний хлориді, (-) магний сульфаты)
Мұздату үшін DMSO
Жасуша мәдениетінің DMSO дәрежесі
Жасушалар шамамен 5 x 10 концентрациясында құрғақ мұзда мұздатылған күйде келеді5жасушалар/құты
Фибробласттарды еріту хаттамасы
- 37°C су моншасында жасушаларды тез ерітіңіз.
- Құты сыртын 70% этанолымен сүртіңіз.
- Ерітілген жасушаларды пуромицинсіз 5 мл өсу ортасы бар T25 колбаға ауыстырыңыз.
- Колбаны түні бойы 37°C инкубаторға салыңыз.
- Келесі күні жасушалардың бекітілгеніне көз жеткізу үшін микроскоп астында бақылаңыз.
- Баспа құралын алып тастап, жаңа өсу ортасымен ауыстырыңыз.
PRF жасуша желілерін субкультуралау
1) Жасушалар қалыптасып, өсіп жатқанда, құрамында 0,75 мкг/мл пуромицин бар ортаны пайдалана бастаңыз. Жасушаларды құрамында 0,75 мкг/мл пуромицин бар ортада ұстауды жалғастырыңыз.
2) Біріктірілген кезде жасушалар бөлінуі керек.
3) Ұяшықтарды бөлу үшін (берілген көлемдер ұяшықтар T25-те болса керек):
A. Стерильді техниканы қолданып, баспа материалын алып тастаңыз және колбаны 2-3 мл стерильді HBSS ерітіндісімен шайыңыз. HBSS жою және жою.
B. 1 мл трипсин қосып, 2-3 минут инкубациялайды. Жасушалардың дөңгелектене бастағанын, көтеріле бастағанын және қалқып кеткенін анықтау үшін инверттелген микроскоп астында тексеру керек. Егер жасушалар 3 минуттан кейін ажырамаса, тағы 1-2 минут инкубациялауға болады
C. Барлық ұяшықтарды шығару үшін қақпақты қатайтыңыз және колбаны бір жағынан екінші жағына ақырын тартыңыз. Қажет болса, ұяшықтарды босату үшін колбаны бүйірінен аздап соғуға болады.
D. Трипсинді инактивациялау үшін жасушалар қалқыған кезде колбаға 4 мл жаңа ортаны қосыңыз. Барлық жасушаларды пластмассадан жуып, ерітіндіге салу үшін колбаның бүйір жақтарын жаңа баспа құралдарымен бірнеше рет шайыңыз. Барлық сұйықтық бар жасушаларды алып тастаңыз және 15 мл конустық пішінге (немесе 3 немесе одан да көп колбаны біріктіріп жатсаңыз, 50 мл) ауыстырыңыз.
E. Стерильді техниканы қолданып, гемацитометрде санау үшін аликвотты алыңыз.
F. Сіз жасушаларды санап жатқанда, ерітіндінің қалған бөлігін клиникалық центрифугада 1000 айн/мин жылдамдықпен 5 минут бойы айналдыру керек.
4) Ұяшықтар санын есептегеннен кейін 2,5 x 10 өлшеміндегі ұяшықтарды табыңыз5 Т 25 сүзгі үстіңгі колбаға жасушалар.
5) Жасушаларды 2-3 күн сайын құрамында 0,75 мкг/мл пуромицин бар жаңа өсу ортасымен қоректендіру керек.
Мұздату:
Ұяшықтар 5х10-нан кем емес мұздатылған болуы керек5 жасушалар /мл/криовиальды өсу орталарында құрамында 10% DMSO және 30% FBS бар пуромицинсіз және кейіннен изопропанолды мұздату камерасына түні бойы -80°C температурада орналастырады. Келесі күні сұйық азотқа ауыстырыңыз.
Қосымша ақпарат алу үшін хабарласыңыз:
Лесли Б. Гордон, MD, PhD
Браун университетінің педиатрия зерттеулерінің профессоры Уоррен Альперт медициналық мектебі және педиатрия кафедрасы, Хасбро балалар ауруханасы, Провиденс, RI анестезия бөлімі, Бостон балалар ауруханасы және Гарвард медициналық мектебі, Бостон, MA медициналық директоры, Progeria зерттеу қоры
Телефон: 978-535-2594
Факс: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org
Венди Норрис
Телефон: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org