Трипсин

Трипсин EDTA C .25% (Invitrogen # 25200-056)

Hank теңдестірілген тұзды ерітіндісі

HBSS- (Инвитроген # 14170 (1Х) (-) кальций хлориді, (-) магний хлориді, (-) магний сульфаты)

Мұздатуға арналған DMSO

DMSO клеткалық мәдениеті

Ұяшықтар шамамен 5 x 10 концентрациясында құрғақ мұз үстіне мұздатылған болады⁵жасушалар / құты

Фибробласттарды еріту протоколы

1. 37 ° C су моншасында тез еритін жасушалар.
2. Шишаның сыртын 70% этанолмен сүртіңіз.
3. Ерітілген жасушаларды пуромицинсіз 25 мл өсу ортасы бар T5 колбасына өткізіңіз.
4. Күнделікті 37 ° C инкубаторға колбаны салыңыз.
5. Келесі күні микроскоптың көмегімен жасушалардың бекітілгенін тексеріңіз.
6. Тасымалдағышты алып тастап, жаңа өсетін медиамен ауыстырыңыз.

Субкультура жасушалары PRF

1) Жасушалар құрылып, өсіп келе жатқанда, құрамында 0.75 мкг / мл пуромицин бар құралды қолдана бастаңыз. Құрамында 0.75 мкг / мл пуромицин бар медиа жасушаларын ұстауды жалғастырыңыз.

2) Жуылған кезде ұяшықтар бөлінуі керек.

3) Жасушаларға бөліну үшін (берілген көлемдер T25 ұяшықтарына жататын болады):

A. Стерильді техниканы қолданып, мультимедианы алыңыз және колбаны 2-3 мл стерильді HBSS құйыңыз. HBSS жойыңыз және тастаңыз.

B. 1 мл трипсинді қосып, 2-3 минутқа инкубациялаңыз. Ұяшықтарды дөңгелектеу, көтеру және жүзуді бастағанын анықтау үшін инверттелген микроскоптың көмегімен тексеру керек. Егер 3 минуттан кейін ұяшықтар бөлінбесе, сіз басқа 1-2 минутты инкубациялауыңыз мүмкін

C. Барлық жасушаларды шығару үшін қақпақты байлап, колбаны бүйірден екінші жаққа жайлап салыңыз. Қажет болса, жасушаларды босату үшін колбаны бүйірлік жағынан түртуге болады.

D. 4 мл жаңа медианы колбаға колбаға трипсинді белсендісыздандыруға кіріскен кезде қосыңыз. Пластмассадан және ерітіндіге кіретін барлық жасушаларды жуу үшін колбаның бүйірлерін бірнеше рет жаңа баспа құралмен шайыңыз. Құрамында барлық сұйықтық бар жасушаларды алып тастап, 15ml конустыққа (немесе 50 немесе одан да көп колбалар жинайтын болсаңыз, 3 мл) өтіңіз.

E. Стерильді әдісті қолданып, гемацетометрге санау үшін аликвот алыңыз.

F. Сіз жасушаларды санап жатқанда, қалған ерітіндіні клиникалық центрифугада 5 минутқа 1000 айн / мин жылдамдықпен айналдыру керек.

4) Ұяшықтар санын есептеп болғаннан кейін, пластиналар ұяшықтарын 2.5 х 10 құрайды⁵ T 25 сүзгісінің жоғарғы колбасына бір ұяшық.

5) Жасушаларды әр 2-3 күнде 0.75 мкг / мл пуромицині бар жаңа өсу ортасымен тамақтандыру керек.

Мұздату:

Ұяшықтар 5x 10-ден кем болмауы керек⁵ жасушалар / мл / криовиалды өсу ортасында құрамында 10% DMSO және 30% FBS бар пуромицинсіз содан кейін изопропанолды мұздатқыш камераға бір түнде -80 ° C температурасында қойыңыз. Келесі күні сұйық азотқа өткізіңіз.

Венди Норрис