1. iPSC 非科学家背景信息

干细胞是尚未发育成任何一种细胞类型的“未成熟”细胞。它们具有可塑性，因为它们有可能发育成体内许多不同类型的成熟细胞，例如构成心脏或血管以及其他组织和器官的细胞。2007 年，研究人员发现了一种在实验室中创建干细胞的策略，即重新编程我们通常为研究目的而培养的成熟成体细胞。^{1, 2} 这些人工培育的干细胞被称为诱导性多能干细胞（“iPSC”）。对于早衰症领域来说，这是一个巨大的突破。科学家们现在首次可以培育早衰症干细胞，并探究干细胞在早衰症中如何发挥功能和发育。此前并没有人类早衰症干细胞的来源，因此无法得知早衰症干细胞与非早衰症人群的干细胞相比如何发挥功能。此外，科学家可以对早衰症干细胞进行重新编程，首次创造出成熟的早衰症血管、心脏细胞和其他类型的细胞。在此之前，还没有人类早衰症心脏或血管细胞的来源。  我们现在可以问关键 关于导致早衰症患者因心脏病发作和中风而过早死亡的心脏病的问题。我们可以将这些发现与普通人群中的心脏病和衰老进行比较，并发现更多关于影响我们所有人衰老的因素。目前已经发表了几篇使用早衰症干细胞的优秀研究。^3-5  早衰症研究基金会的目标是利用这一宝贵工具促进更多发现。有关干细胞的入门知识，请参阅美国政府网站： https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. 早衰症研究基金会生成和分配诱导性多能干细胞 (iPSC) 的目的

早衰症研究基金会的使命是寻找治疗和治愈哈钦森-吉尔福德早衰症及其与衰老相关的疾病的方法。2009 年，PRF 与加拿大多伦多大学由威廉·斯坦福博士领导的专家科学家团队合作，以生产高质量的早衰症 iPSC。斯坦福博士是加拿大综合干细胞生物学研究主席。截至 2011 年，PRF 继续与加拿大渥太华大学的斯坦福博士合作，他是渥太华大学医学院细胞和分子医学教授，也是渥太华医院研究所 Sprott 干细胞研究中心的高级科学家。

我们的目标是为全世界的研究人员提供这一宝贵的工具。这一新研究工具将用于开展有关早衰症及其与心脏病和衰老关系的全新创新研究。  

3. 哈钦森 - 吉尔福德早衰综合征诱导多能干细胞（iPSC）的产生

诱导性多能干细胞 (iPSC) 是使用 VSVG 假型逆转录病毒转导四种人类因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 进入成纤维细胞而获得的。iPSC 集落是在小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 上获得的。所用程序基本与之前所述相同，但不使用 EOS 报告基因 (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009)。 

4. 质量控制：验证和特性

目前可用的生产线已经经过了几个验证步骤（请参阅下面可下载的 PDF）：

5. 这些 iPS 细胞的原始起始材料

iPSC 来源于 PRF 细胞与组织库未转化成纤维细胞系。

所有 iPS 系使用的转导方法都是逆转录病毒 MKOS。

iPSC 系 ID	突变	性别和捐献年龄	起源细胞类型 点击这里.	支持数据
HGADFN003 iPS 1B	LMNA外显子 11， 1824 韓國	男性 2岁0个月	真皮成纤维细胞 HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA 外显子 11， 1824 韓國	男性 2岁0个月	真皮成纤维细胞 HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 1D 智能	LMNA 外显子 11， 1824 韓國	男性 2岁0个月	真皮成纤维细胞 HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA 外显子 11，1824 C>T	男性 8 岁 5 个月	真皮成纤维细胞 HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA 外显子 11，1824 C>T	男性 8 岁 5 个月	真皮成纤维细胞 HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	HGADFN167 的母亲（不受影响）	女性 37 岁 10 个月	真皮成纤维细胞 HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	HGADFN167 的母亲（不受影响）	女性 37 岁 10 个月	真皮成纤维细胞 HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	HGADFN167 的父亲（未受影响）	男性 40 岁 5个月	真皮成纤维细胞 HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	HGADFN167 的父亲（未受影响）	男性 40 岁 5个月	真皮成纤维细胞 HGFDFN168	168 iPS1P

6. 加入我们的电子邮件列表，以便获取未来 iPSC 更新和新细胞系

我们正在继续生成 iPSC 系。如果您想定期了解 PRF 细胞和组织库中保存的 iPSC，请点击加入我们的电子邮件列表 这里

7. 有问题吗？

如有任何疑问或需要，请联系医学主任 Leslie Gordon 博士，电话： lgordon@progeriaresearch.org 或 978-535-2594

8. 订购 iPS 细胞系

2014 年，PRF 制定了不改变 MTA 的政策。这是与 14 个国家/地区的 70 个研究团队签订的 12 年合同安排的结果。PRF 及其顾问已考虑到该期间出现的问题并相应地修改了协议，最终形成了我们认为公平合理的条款。

对于美国联邦政府机构或有任何疑问，请联系 Wendy Norris： wnorris@brownhealth.org 或者 401-274-1122 x 48063.

步骤 1：完成申请和材料转让协议

非政府机构申请书及协议

非政府机构材料转让协议

第 2 步： 将填妥的申请表和材料转让协议寄回给 Wendy Norris，地址为 wnorris@brownhealth.org。一旦获得批准，您将收到一封电子邮件，确认您的订单和预计发货日期。 

步骤3： 斯坦福博士的实验室目前正在分发冷冻冷冻管中的细胞系。培养物发货后，实验室会通过电子邮件向您发送运输和跟踪信息。缺乏经验的研究人员将接受对人类胚胎干细胞/iPSC 工作至关重要的专业课程培训。

渥太华医院研究所的人类多能干细胞设施（由斯坦福博士负责）提供一对一虚拟培训，培训内容是针对早衰症 iPSC 细胞系的 iPSC 培养技术基础知识。培训选项和形式灵活，取决于科学家的经验水平。  如需了解更多信息，请发送电子邮件至 hpscf@ohri.ca.

步骤 4：渥太华大学将直接向您开具每条 iPSC 线路的发票，外加快递费用（如果有）。

9. HGPS 和控制 iPS 细胞培养基制备

iPSC 和 ESC 需要使用 Stem Cell Technologies (cat# 5825) 的 mTeSR Plus 进行喂养。请遵循供应商的建议进行储存。

10. 准备 Matrigel 板

笔记：所有涉及基质胶的步骤都应尽快完成，并尽可能保持低温。

1. 4 时解冻基质胶瓶°C. 检查该批次的分析证书以找到其蛋白质浓度。
2. 向解冻的基质胶中添加足够的冷 DMEM/F12 培养基，以达到 5mg/mL 的最终浓度。
3. 将步骤 2 中制备的基质胶制成 1mL 等分试样，放入预冷的 15mL falcon 管中。
4. 将所有试样冷冻并储存在-20°C.
5. 为了制作基质胶板，从-20°C 并加入 10mL 冷 DMEM/F12。充分混合直至颗粒解冻（不产生气泡，并始终保持溶液冷）。
6. 转移到 50mL 管中，然后加入 20mL 冷 DMEM/F12（1mL matrigel 分装件稀释在 30mL DMEM/F12 中），混匀。
7. 板（6 孔板 1mL/孔，12 孔板 0.5mL/孔，24 孔板 0.25mL/孔）。轻轻摇动板，确保溶液覆盖整个表面区域。不要重新冷冻任何剩余的基质胶。
8. 如果立即使用该板，请将其在室温下放置 1 小时（或在 37°C)、在显微镜下观察基质胶。基质胶应分散良好，不“结块”。
9. 如果在其他时间使用平板，请用保鲜膜包裹平板边缘并储存在 4°C 最多可持续 2 周。

基质胶 - BD/Fisher，cat#CB-40230

DMEM/F12——生命技术，cat#11330-057

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11. 解冻 ES 或 iPS 细胞（每个冷冻瓶）

1. 将基质胶板从 4°C 中取出并在室温下加热一小时，或制作新鲜的基质胶板（参见准备基质胶板协议）。
2. 将 4mL mTeSR Plus 放入 15mL falcon 管中加热。
3. 从液氮罐中取出细胞，在 37°C 的恒温槽中旋转，直到只剩下一小块冰。小瓶应在 1-2 分钟内解冻。此步骤必须快速完成。
4. 将乙醇细胞管和猎鹰培养基管放入通风柜中。
5. 使用 1mL 张开嘴尖慢慢地 将细胞添加到 4mL 预热的培养基中（避免混合细胞悬浮液）。
6. 以 130 rcf 的速度旋转 5 分钟。
7. 除去上清液。
8. 加入 2mL PSC 培养基，用广口吸头 轻轻地打碎团块. 将培养基转移到 6 孔板的一个孔中，加入 2uL ROCK 抑制剂（Y27632，最终浓度为 10uM）。 将其放入一个基质胶包被的孔中（6 孔板中）。
9. 轻轻摇动细胞以均匀分布细胞，并放入缺氧培养箱（5%O₂, 10% 有限公司₂)。 播种后 24 小时内避免扰动培养皿。

   笔记： 避免过度分解团块或过度移液非常重要。这会显著降低存活率。接种时，细胞应保持 100-300 个细胞大小的块状。在动作轻柔的同时，一旦细胞解冻，请尝试快速操作，以尽量减少它们与冷冻保护剂接触的时间。​

10. 24 小时后移除培养基并添加 2mL PSC 培养基（6 孔板添加 1mL，12 孔板添加 1mL，24 孔板添加 0.5mL）。请参阅 hESC/iPSC 采集和护理方案。

PSC 媒体

mTeSR Plus 来自 Stem Cell Technologies (cat# 5825)。请遵循供应商的建议进行存储。

什么是 ROCK 抑制剂 Y27632？

ROCK 抑制剂 Y27632 是 Rho 相关激酶 p160 ROCK 的选择性抑制剂。使用 ROCK 抑制剂 Y27632 治疗可防止人类胚胎干细胞 (hESC) 和人类诱导性多能干细胞 (iPSC) 的解离诱导凋亡，从而提高存活率并在 hESC 和 hiPSC 的传代培养和解冻过程中保持多能性。ROCK 抑制剂 Y27632 还被证实可提高干细胞在冷冻保存过程中的存活率。请注意，Rock 抑制剂等分试样对光和重复的冻融循环很敏感。确保在供应商建议的保质期内使用这些等分试样。

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12. 采集和护理 hESC/iPSC

1. 细胞解冻后的第二天，在显微镜下观察它们以确定存活率。注意：观察到大量未附着的细胞是正常的。只要一些细胞附着，菌落就可以在 3 – 7 天内从中产生。
2. 从孔中取出培养基，每个孔吸取 2 mL（6 孔板吸取 1 mL，12 孔板吸取 1 mL，24 孔板吸取 0.5 mL）新鲜温热的 PSC 培养基。将板放回培养箱。
3. 喂养细胞直至 60-70% 汇合（按照供应商的建议）。
4. 从第 2 天开始，应观察细胞并清除可能正在生长的任何分化细胞。
5. 为了清洁细胞，请使用挑选罩并用移液器尖头刮掉分化的细胞。
6. 清洁细胞后，按照上述步骤更换培养基。

（参见冷冻 hESC/iPSC 或传递 hESC/iPSC）

笔记：

经确定，PSC 培养基在缺氧环境中的效率更高。我们还观察到，与常氧培养箱相比，在缺氧培养箱中生长的细胞分化较少。最后，使用缺氧培养箱时，接种细胞的存活率更高。

含氧量正常：37°C, 21% O₂, 5% 有限公司₂

缺氧：37°C, 5%O₂, 10% 有限公司₂

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13. 传递 hESC/iPSC

1. 将 2mL PSC 培养基添加到 6 孔基质胶涂层板中并放在一边。
2. 取出待传代的培养板，除去孔中的培养基，用 1mL PBS(-/-) 清洗一次。
3. 将 1mL EDTA 溶液加入孔中，在室温下放置 3-4 分钟。不要移动板，因为细胞可能会开始脱落。
4. 除去 EDTA 溶液并添加 1mL PSC 培养基。请勿将 EDTA 留在细胞上超过 4 分钟，因为这会导致细胞脱落。
5. 使用细胞刮刀刮取细胞，并将细胞分到含有 PSC 培养基的 6 个培养板孔中。避免过度破碎菌落碎片，刮取时动作要轻柔。尽量将细胞保持大块状态。如有必要，使用广口移液器吸头打碎团块。过度破碎细胞可能导致细胞死亡或传代后过度自发分化。
6. 37 度孵化°将细胞均匀分布于每个孔中（8 字形或 L 形摇动），然后 C。传代后 24 小时内避免扰动板。

笔记：一旦细胞被刮下，您就需要尽快将它们转移到新的培养皿中，因为细胞会很快重新附着（5 分钟内）。

如果 EDTA 停留在细胞上超过 4 分钟，细胞就会开始脱落。如果发生这种情况，只需将细胞收集到 15 毫升 falcon 中，加入 4 毫升 PSC 培养基。以 130 rcf 的速度旋转细胞 5 分钟。用 1 毫升培养基重新悬浮沉淀物，并将其均匀地分到 6 孔基质胶包被板中（每孔 160 微升）。

EDTA 溶液：将 500uL 0.5M EDTA（pH 8.0）加入 500mL DPBS（-/-）中。添加 0.9g NaCl。过滤溶液进行灭菌，并在 4°C 下保存长达 6 个月。

摘自论文：

在化学定义的培养条件下通过无酶解离进行人类多能干细胞的传代和菌落扩增

珍妮特·比尔斯,¹ 丹尼尔·R·古布兰森,^2,3 妮可·乔治,⁴劳伦·I·西尼斯卡尔奇,¹ 杰弗里·琼斯,^4,5 詹姆斯·A·汤姆森,^2,3,6 和 陈国凯^1,2

14. 冷冻 hESC/iPSC

1. 打开Bio-Cool（可控速率冷冻机）并将温度调节至-7°C。
2. 从培养箱中取出细胞并在显微镜下观察融合度和形态。
3. 如果孔是 70% 汇合的，则去除旧培养基并用 PBS(-/-) 清洗一次，然后每孔添加 1 mL EDTA 溶液（参见用 EDTA 溶液传递）。
4. 室温下孵育 3-4 分钟。
5. 吸出 EDTA 溶液并添加 1 mL 冷 mFreSR 培养基（cat#05855，干细胞技术）。
6. 使用细胞刮刀轻轻刮起细胞。尽可能保持细胞大块，避免上下移液。
7. 使用广口吸头将细胞/mFreSR 转移到冷冻管中。将小瓶放在冰上，直到准备好进行第 8 步。
8. 将管子放入 Bio-Cool 中并孵育 10 分钟。
9. 获取液氮。
10. 10 分钟后，将抹刀浸入液氮中并接触冷冻瓶侧面约 10-30 秒或直到在冷冻瓶侧面看到晶体形成，以此来播种细胞。
11. 按“PROG”按钮启动程序 1，再次按下按钮执行程序，您应该看到速率为 0.5°C/min，然后按“RUN”。
12. 一旦温度达到 -65°C，冷冻管就可以转移并储存在液氮中。

替代方案

另一种方法是将冷冻管放入冷冻容器 (Biocision-CoolCell) 中，并在 -80°C 下储存过夜。第二天将冷冻管移至液氮 (液相或气相) 中。

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