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成纤维细胞

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成纤维细胞传代培养和冷冻方案

生长培养基

DMEM – ThermoFisher #11960-044(不含 L-谷氨酰胺的高葡萄糖)

15% FBS 胎牛血清 – ThermoFisher #10437-028

1% (1X) 青霉素-链霉素 – ThermoFisher #15140-122

1%(1X)GlutaMAX——赛默飞世尔 #35050-061

胰蛋白酶

胰蛋白酶 EDTA C 0.25%(ThermoFisher #25200-056)

汉克平衡盐溶液

HBSS- (ThermoFisher #14170 (1X) (-) 氯化钙, (-) 氯化镁, (-) 硫酸镁

DMSO 冷冻

细胞培养级 DMSO – Sigma #D2438

解冻 PRF 细胞系

  1. 在 37˚C 水浴中快速解冻细胞。
  2. 使用 70% 乙醇擦拭小瓶外部。
  3. 将解冻的细胞转移到含有 5 毫升生长培养基的 T25 烧瓶中。
  4. 将烧瓶放入 37˚C 培养箱中过夜。
  5. 第二天,在显微镜下观察,确保细胞已经附着。
  6. 除去培养基并换上新鲜的生长培养基。

PRF 细胞系传代培养

  1. 细胞汇合时应分裂。
  2. 分裂细胞(给定的体积假设细胞在 T25 中):
    a) 使用无菌技术,取出培养基并用 2-3 ml 无菌 HBSS 冲洗培养瓶。取出并丢弃 HBSS。
    b) 加入 1 ml 胰蛋白酶,孵育 2-3 分钟。倒置显微镜下观察细胞是否开始变圆、上浮。如果 3 分钟后细胞仍未脱落,可再孵育 1-2 分钟。
    c) 拧紧瓶盖,轻轻地左右倾斜烧瓶,使所有细胞脱落。如有必要,可轻轻敲击烧瓶一侧,使细胞松动。
    d) 细胞浮起后立即向烧瓶中加入 4 毫升新培养基,以灭活胰蛋白酶。用新培养基多次冲洗烧瓶壁,将所有细胞从塑料上洗掉并洗入溶液中。取出所有含有细胞的液体,然后转移到 15 毫升锥形瓶中(如果要合并 3 个或更多烧瓶,则转移到 50 毫升锥形瓶中)。
    e) 使用无菌技术,取出一部分样品,放在血细胞计数器上进行计数。
    f) 当您计数细胞时,应将剩余溶液放入临床离心机中以 1000 rpm 的速度旋转 5 分钟。
  3. 计算细胞数量后,以 2.5 x 105 每个T25过滤顶瓶的细胞数。
  4. 每 2-3 天应给细胞补充一次新鲜的生长培养基。

冷冻:

细胞应冷冻在不少于 5 x 105 细胞/ml/冻存管置于含有 10% DMSO 和 30% FBS 的生长培养基中,然后放入异丙醇冷冻室中,在 -80˚C 下过夜。第二天转移到液氮中。

成纤维细胞传代培养和冷冻方案

如需了解更多信息,请联系:

Leslie B. Gordon 医学博士

布朗大学沃伦·阿尔珀特医学院儿科研究教授、罗德岛州普罗维登斯市孩之宝儿童医院儿科系、马萨诸塞州波士顿市波士顿儿童医院和哈佛医学院麻醉科、早衰症研究基金会医学主任

电话:978-535-2594
传真:508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

温迪·诺里斯
PRF 细胞和组织库
电话:401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org
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