Индукцияланған плюрипотент
Дің жасушалары
Progeria зерттеу қорының жасуша және тіндер банкі
Адамның индукцияланған плюрипотентті дің жасушалары (iPSC)
- Progeria iPSCs Ғалым еместерге арналған негізгі ақпарат
- Мақсаты Прогерия зерттеу қорының индукцияланған плюрипотентті дің жасушаларының пайда болуы және таралуы
- Хатчинсон-Гилфорд Прогерия синдромы индукцияланған-плюрипотентті дің жасушаларының (iPSCs) генерациясы
- Сапаны бақылау: Валидация және сипаттау
- iPSC алынған түпнұсқа бастапқы материал
- Болашақ iPSC жаңартулары мен жаңа ұяшық желілері үшін электрондық пошта тізімімізге қосылыңыз
- Сұрақтар? Бізбен хабарласыңы.
- iPSC желілеріне тапсырыс беру
- HGPS және Control iPSC Culture Media дайындау
- Матригель плиталарын дайындау
- hESC және iPSC жасушаларын еріту (әр криоқұтыға)
- hESC/iPSC жинау және күтім жасау
- Өткізу hESC/iPSC
- hESC/iPSC қату
1. iPSC Ғалым емес адамға арналған ақпарат
Дің жасушалары - бұл әлі бір жасуша түріне айналуға бел бумаған «жетілмеген» жасушалар. Олар икемді, өйткені оларда жүректі немесе қан тамырларын және басқа ұлпалар мен мүшелерді құрайтын жасушалар сияқты денедегі жетілген жасушалардың көптеген түрлеріне айналу мүмкіндігі бар. 2007 жылы зерттеушілер біз әдетте зерттеу мақсатында өсіретін жетілген ересек жасушаларды қайта бағдарламалау арқылы зертханада дің жасушаларын жасау стратегиясын тапты.1, 2 . Бұл жасанды түрде жасалған дің жасушалары индукцияланған плюрипотентті дің жасушалары («iPSCs») деп аталады. Прогерия саласы үшін бұл үлкен жетістік. Алғаш рет ғалымдар енді Progeria дің жасушаларын жасап, дің жасушаларының Прогерияда қалай жұмыс істейтіні және дамуы туралы сұрақтар қоя алады. Бұрын адамның Progeria дің жасушаларының көзі болмаған, сондықтан Progeria дің жасушаларының Прогериясы жоқ адамдардың дің жасушаларымен салыстырғанда қалай жұмыс істейтіні туралы ақпарат жоқ болатын. Сонымен қатар, ғалымдар Progeria дің жасушаларын алғаш рет жетілген Progeria қан тамырларын, жүрек жасушаларын және басқа жасуша түрлерін жасау үшін қайта бағдарламалай алады. Осы уақытқа дейін адамның жүрек немесе қан тамырлары жасушаларының Progeria көзі болған жоқ. Енді кілтті сұрай аламыз Прогерияда инфаркт пен инсульттан ерте өлімге әкелетін жүрек ауруы туралы сұрақтар. Біз бұл жаңалықтарды жүрек ауруымен және жалпы халықтың қартаюымен салыстыра аламыз және бәріміздің қартаюымызға не әсер ететіні туралы көбірек біле аламыз. Қазірдің өзінде Progeria дің жасушалары арқылы жарияланған бірнеше тамаша зерттеулер болды.3-5 Progeria Research Foundation-тағы мақсатымыз – осы баға жетпес құралды пайдалана отырып, көптеген жаңалықтар ашуға көмектесу. Дің жасушаларына праймер алу үшін АҚШ үкіметінің мына веб-сайтынан қараңыз: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm
-
- Такахаши К, Танабе К, Охнуки М, Нарита М, Ичисака Т, Томода К, Яманака С. Белгілі факторлар арқылы ересек адамның фибробласттарынан плюрипотентті дің жасушаларын индукциялау. Ұяшық. 2007;131:861-872.
- Ю Дж, Водяник МА, Смуга-Отто К, Антосевич-Бурже Дж, Фране Дж.Л., Тиан С, Ни Дж, Джонсдоттир Г.А., Руотти В, Стюарт Р, Слуквин, II, Томсон Джа. Адамның соматикалық жасушаларынан алынған индукцияланған плюрипотентті дің жасушалары. Ғылым. 2007;318:1917-1920.
- Лю GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3-ші, Izpisua Belmonte JC. Хатчинсон-Гилфорд прогерия синдромының iPSC көмегімен ерте қартаюдың рекапитуляциясы. Табиғат. 2011;472:221-225.
- Misteli T. HGPS арқылы алынған iPSCs ғасырлар үшін. Жасуша бағаналы жасуша. 2011;8:4-6.
2. Индукцияланған плюрипотентті дің жасушаларын (iPSC) генерациялау және The Progeria Research Foundation тарату мақсаты
Проджерия зерттеу қорының миссиясы Хатчинсон-Гилфорд прогерия синдромын және оның қартаюға байланысты бұзылыстарын емдеу және емдеу әдістерін табу болып табылады. 2009 жылы PRF жоғары сапалы Progeria iPSCs жасау үшін Торонто университетінің (Канада) ғалымдарының сарапшылар тобымен PhD докторы Уильям Стэнфордпен ынтымақтастық орнатты. Доктор Стэнфорд – интегративті дің жасушаларының биологиясы бойынша Канаданың ғылыми кафедрасы. 2011 жылдан бастап PRF Канаданың Оттава университетінде доктор Стэнфордпен ынтымақтастығын жалғастыруда, онда ол медицина факультетінің жасушалық және молекулалық медицина профессоры және Оттава госпиталінің ғылыми-зерттеу институтының Спротт дің жасушаларын зерттеу орталығының аға ғалымы.
Біздің мақсатымыз - бұл баға жетпес құралды бүкіл әлемдегі зерттеушілерге ұсыну. Бұл жаңа зерттеу құралы Прогерияда жаңа және инновациялық зерттеулерді, сондай-ақ оның жүрек ауруы мен қартаюмен байланысын жасау үшін пайдаланылады.
3. Хатчинсон-Гилфорд Прогерия синдромының индукцияланған-плюрипотентті дің жасушаларының (iPSCs) генерациясы
Индукцияланған-плюрипотентті дің жасушалары (iPSC) адам төрт факторының, Oct4, Sox2, Klf4 және c-Myc фибробласттарға VSVG-псевдотипті ретровирустық трансдукциясы арқылы алынды. iPSC колониялары тышқан-эмбриондық фибробласттарда (MEFs) алынған. Қолданылған процедура негізінен бұрын сипатталғандай болды, бірақ EOS репортері пайдаланылмады (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009).
4. Сапаны бақылау: Валидация және сипаттама
Қазіргі уақытта қол жетімді жолдар бірнеше тексеру қадамдарынан өтті (төменде жүктеп алынатын PDF файлдарын қараңыз):
-
- Әрбір жол үшін микоплазманы сынау: Доктор Стэнфорд зертханасы әрбір жасуша сызығы үшін ПТР арқылы микоплазмалық талдау жасады. Сонымен қатар, кеңейтілгеннен кейін және жасушаларды тасымалдау алдында сызықтар микоплазмаға қайта тексеріледі.
- Tra-1-60, Tra-1-81 және SSEA4 плюрипотентті маркерлерге арналған иммуностимуляция.
- Сілтілік фосфатаза бояуы плюрипотенттіліктің көрсеткіші ретінде
- Эмбриоидты дененің қалыптасуы және одан кейінгі үш ұрық қабатының маркерлеріне иммундық бояу. Тестіленген маркерлер βIII-Тубулин (эктодерма), тегіс бұлшықет актині (мезодерма) және Gata4 немесе AFP (энтодерма) болды.
- Кариотиптік талдау.
- Дифференцирленген жасушаларда А ламинінің қайта экспрессиясы
- Тератома талдаулары
Қосымша валидация барысында:
Кейбір желілерде қосымша деректерде көрсетілгендей тератома талдаулары аяқталды. Барлық басқа жолдар үшін тератома талдаулары орындалуда және осы талдаулар аяқталған сайын күй жаңартылады.
5. Осы iPS жасушалары алынған түпнұсқа бастапқы материал
iPSCs PRF Cell & Tissue Bank трансформацияланбаған фибробласт жасуша желілерінен алынған.
Барлық iPS желілері үшін қолданылатын трансдукция әдісі ретровирус MKOS болды.
iPSC желі идентификаторы | Мутация | Гендер және донорлық жас | Бастапқы жасуша түрі Мында басыңыз. | Қолдау деректері |
---|---|---|---|---|
HGADFN003 iPS 1B | LMNAExon 11, 1824 C>T | Ер 2 жас 0 ай | Тері фибробласттары HGADFN003 | 003 iPS1B |
HGADFN003 iPS 1C | LMNA Exon 11, 1824 C>T | Ер 2 жас 0 ай | Тері фибробласттары HGADFN003 | 003 iPS1C |
HGDFN003 iPS 1D | LMNA Exon 11, 1824 C>T | Ер 2 жас 0 ай | Тері фибробласттары HGADFN003 | 003 iPS1D |
HGADFN167 iPS 1J | LMNA Exon 11, 1824 C>T | Ер 8 жас 5 ай | Тері фибробласттары HGADFN167 | 167 PS 1J |
HGADFN167 iPS 1Q | LMNA Exon 11, 1824 C>T | Ер 8 жас 5 ай | Тері фибробласттары HGADFN167 | 167 iPS1Q |
HGMDFN090 iPS 1B | HGADFN167 анасы (зақымдалмаған) | Әйел 37 жас 10 ай | Тері фибробласттары HGMDFN090 | 090 iPS1B |
HGMDFN090 iPS 1C | HGADFN167 анасы (зақымдалмаған) | Әйел 37 жас 10 ай | Тері фибробласттары HGMDFN090 | 090 iPS1C |
HGFDFN168 iPS1 D2 | HGADFN167 әкесі (зақымдалмаған) | Ер 40 жас 5 ай | Тері фибробласттары HGFDFN168 | 168 iPS1 D2 |
HGFDFN168 iPS1P | HGADFN167 әкесі (зақымдалмаған) | Ер 40 жас 5 ай | Тері фибробласттары HGFDFN168 | 168 iPS1P |
6. Болашақ iPSC жаңартулары мен жаңа ұяшық желілері үшін электрондық пошта тізіміне қосылыңыз
Біз iPSC желілерін жасауды жалғастырудамыз. PRF Cell & Tissue банкінде өткізілетін iPSCs туралы мерзімді жаңартуларды алғыңыз келсе, түймесін басу арқылы электрондық пошталар тізіміне қосылыңыз. Мұнда
7. Сұрақтар?
Кез келген сұрақтарыңыз немесе қажеттіліктеріңіз бойынша Лесли Гордонмен, MD, PhD, медициналық директормен хабарласыңыз lgordon@progeriaresearch.org немесе 978-535-2594
8. iPS ұяшық желілеріне тапсырыс беру
2014 жылы PRF біздің MTA-ға ешқандай өзгеріс енгізу саясатын енгізді. Бұл 14 елдегі мекемелерде жұмыс істейтін 70 зерттеу тобымен 12 жылдық келісім-шарттың нәтижесі. PRF және оның адвокаты осы уақыт аралығында туындаған мәселелерді ескеріп, келісімді тиісінше өңдеді, нәтижесінде біз әділ және ақылға қонымды шарттар деп санаймыз.
АҚШ федералды үкіметінің институттары немесе сұрақтар бойынша Венди Норриске мына телефон арқылы хабарласыңыз: wnorris@brownhealth.org немесе 401
1-қадам: Өтінімді және материалды беру келісімін толтырыңыз
Мемлекеттік емес мекемелерге арналған өтінім және келісім
Мемлекеттік емес мекемелерге материалды тасымалдау туралы келісім
2-қадам: Толтырылған өтінімді және материалды беру келісімін Венди Норриске қайтарыңыз wnorris@brownhealth.org. Бекітілгеннен кейін сізге тапсырысыңызды және күтілетін жеткізу күнін растайтын электрондық хат аласыз.
3-қадам: Доктор Стэнфорд зертханасы қазір мұздатылған криовиалдардағы сызықтарды таратуда. Оның зертханасы культура жөнелтілген кезде сізге жөнелту және бақылау ақпараты бар электрондық поштаны жібереді. Тәжірибесіз зерттеушілер адамның эмбриондық дің жасушалары/iPSC жұмысына қажетті арнайы курстарда білім алуға бағытталған.
Оттава госпиталінің ғылыми-зерттеу институтындағы адамның плюрипотентті дің жасушаларының қондырғысы (директоры доктор Стэнфорд) Progeria iPSC ұяшық желілеріне тән iPSC культурасының әдістерінің негіздері бойынша виртуалды жеке оқытуды ұсынады. Оқыту нұсқалары мен форматы ғалымдардың тәжірибе деңгейіне байланысты икемді. Қосымша ақпарат алу үшін hpscf@ohri.ca электрондық поштасын жіберіңіз.
4-қадам: Оттава университеті сізге әрбір iPSC желісі және бар болса, курьерлік шығындар үшін тікелей шот-фактура жасайды.
9. HGPS және Control iPS Cell Culture Media дайындау
iPSC және ESCs Stem Cell Technologies (cat# 5825) mTeSR Plus арқылы қоректенуі керек. Сақтау бойынша жеткізушінің ұсыныстарын орындаңыз.
10. Матригель плиталарын дайындау
Ескерту: Матригельге қатысты барлық қадамдар мүмкіндігінше тез орындалып, мүмкіндігінше салқын болуы керек.
- Матригель бөтелкесін 4 градуста ерітіңіз°C. Ақуыз концентрациясын табу үшін сол лот бойынша талдау сертификатын тексеріңіз.
- 5 мг/мл соңғы концентрацияға жету үшін еріген матригельге жеткілікті суық DMEM/F12 ортасын қосыңыз.
- Алдын ала салқындатылған 15 мл сұңқар түтіктеріне 2-қадамдағы дайындалған матригелдің 1 мл аликвотын жасаңыз.
- Барлық аликвоттарды -20 температурада мұздатыңыз және сақтаңыз°C.
- Матригель пластиналарын жасау үшін -20-дан бір аликвоттық матригельді (1 мл) алыңыз°C және 10 мл суық DMEM/F12 қосыңыз. Түйіршіктер ерігенше жақсылап араластырыңыз (көпіршіктер жасамай, ерітіндіні әрқашан салқын ұстаңыз).
- 50 мл түтікке құйыңыз, содан кейін 20 мл суық DMEM/F12 қосыңыз (1 мл матригель аликвоты 30 мл DMEM/F12 ішінде сұйылтылған), жақсылап араластырыңыз.
- Пластина (6 шұңқырлы пластина үшін 1 мл/ұңғыма, 12 ұңғыма пластинасы үшін 0,5 мл/ұңғыма, 24 ұңғыма тақтасы үшін 0,25 мл/ұңғы). Пластинаны ақырын шайқау арқылы ерітіндінің бүкіл бет аймағын жауып тұрғанына көз жеткізіңіз. Қалған матригельді қайта қатырмаңыз.
- Пластинаны дереу пайдалансаңыз, тақтайшаны бөлме температурасында 1 сағатқа (немесе 37 температурада 30 минут) қалдырыңыз.°C) микроскоппен матригельді бақылаңыз. Матригель жақсы дисперсті болуы керек және «тұтас» емес.
- Пластиналарды басқа уақытта пайдалансаңыз, пластинаның шетін парафильммен орап, 4 градуста сақтаңыз°C 2 аптаға дейін.
Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230
DMEM/F12 – Life Technologies, cat#11330-057
Доктор Уильям Стэнфорд-2022
11. ES немесе iPS жасушаларын еріту (әр криоқұтыға)
- Матригель пластинасын 4°C-тан алыңыз және бөлме температурасында бір сағат бойы жылытыңыз немесе жаңа матригель пластинасын жасаңыз (матригель пластинасының протоколын дайындау бөлімін қараңыз).
- 15 мл сұңқар түтігінде 4 мл mTeSR Plus жылытыңыз.
- Сұйық азот резервуарынан ұяшықтарды алып тастаңыз және 37°C ваннада кішкене мұз бөлігі ғана қалғанша айналдырыңыз. Құты 1-2 минут ішінде еруі керек. Бұл қадамды тез орындау керек.
- Этанол жасушасының түтігі және сұңқар тасымалдағыш түтігі және сорғышқа салыңыз.
- 1 мл пайдаланыңыз кең ауыз ұшын баяу жасушаларды 4 мл алдын ала қыздырылған ортаға қосыңыз (жасушалық суспензияны араластырмаңыз).
- 5 минут бойы 130 rcf айналдырыңыз.
- Супернатантты алып тастаңыз.
- 2 мл PSC медиасын және кең ауыз ұшымен қосыңыз түйіршіктерді ақырын бөлшектеңіз. Тасымалдаушыны 6 шұңқырлы пластинаның бір шұңқырына тасымалдаңыз, 2uL ROCK ингибиторын қосыңыз (Y27632, соңғы концентрациясы 10 мкм). Пластинаны бір матригельмен қапталған шұңқырға салыңыз (6 шұңқырлы пластинадан).
- Жасушаларды біркелкі тарату үшін жасушаларды жайлап тастаңыз және гипоксиялық инкубаторға салыңыз (5%O2, 10% CO2). Тұқым себуден кейін 24 сағат бойы пластинаның бұзылуын болдырмаңыз.
ЕСКЕРТУ: Кесектердің шамадан тыс бұзылуын немесе агрессивті тамшуырларды болдырмау өте маңызды. Бұл өмір сүру деңгейін айтарлықтай төмендетуі мүмкін. Жасушалар тұқым себу кезінде үлкен 100-300 жасушадан тұратын бөліктерде қалуы керек. Жұмсақ болған кезде, криопротектормен байланыста болу уақытын азайту үшін жасушалар ерігеннен кейін жылдам жұмыс істеп көріңіз.
- 24 сағаттан кейін баспа материалын алып тастаңыз және 2 мл PSC медиасын қосыңыз (6 ұңғыма үшін, 12 ұңғыма үшін 1 мл және 24 ұңғыма үшін 0,5 мл). hESC/iPSC протоколын жинау және күту бөлімін қараңыз.
PSC ақпарат құралдары
Stem Cell Technologies ұсынған mTeSR Plus (cat# 5825). Сақтау бойынша жеткізушінің ұсыныстарын орындаңыз.
ROCK ингибиторы Y27632 дегеніміз не?
ROCK ингибиторы Y27632 - ROCK Rho байланысты киназа p160 селективті тежегіші. ROCK Y27632 ингибиторымен емдеу адамның эмбриондық дің жасушаларының (hESC) және адам индукцияланған плюрипотентті дің жасушаларының (iPSC) диссоциациялануынан туындаған апоптозды болдырмайды, өмір сүру жылдамдығын арттырады және hESC және hiPSCs субкультивация және еріту кезінде плюрипотенцияны сақтайды. ROCK ингибиторы Y27632 криоконсервация кезінде дің жасушаларының өмір сүру деңгейін жоғарылататыны да көрсетілген. Тау жыныстарының ингибиторларының аликвоталарының жарыққа және қайталанатын мұздату еріту циклдарына сезімтал екенін ескеріңіз. Бұл аликвоттарды жеткізуші ұсынған жарамдылық мерзімі ішінде қолданғаныңызға көз жеткізіңіз.
Доктор Уильям Стэнфорд-2022
12. hESC/iPSC жинау және күтім жасау
- Жасушалар ерігеннен кейінгі күні тірі қалу жылдамдығын анықтау үшін оларды микроскоппен қараңыз. ЕСКЕРТПЕ: қосылмаған ұяшықтардың көп болуы қалыпты жағдай. Кейбір жасушалар бекітілген болса, олардан 3-7 күн ішінде колониялар пайда болуы мүмкін.
- Ұңғылардан медианы алып тастаңыз және әр ұңғымаға 2 мл (6 ұңғыма үшін, 12 ұңғыма үшін 1 мл және 24 ұңғыма үшін 0,5 мл) жаңа және жылы PSC ортасын тамызыңыз. Пластинаны инкубаторға қайтарыңыз.
- Ұяшықтар 60-70% қосылғанға дейін қоректенеді (жеткізуші ұсыныстарын орындаңыз).
- 2-ші күннен бастап жасушаларды бақылап, өсіп жатқан кез келген сараланған жасушаларды тазалау керек.
- Жасушаларды тазалау үшін сорғышты пайдаланыңыз және тамшуыр ұшымен сараланған жасушаларды қырыңыз.
- Ұяшықтар тазартылғаннан кейін, жоғарыдағы қадамдардағыдай баспа құралын өзгертіңіз.
(HESC/iPSC мұздату немесе hESC/iPSC өту бөлімін қараңыз)
ЕСКЕРТУ:
PSC медиасының гипоксиялық ортада тиімдірек екендігі анықталды. Сондай-ақ, гипоксиялық инкубаторларда жасушаларды нормоксикпен салыстырғанда өсіргенде дифференциация аз болатынын байқадық. Соңында, егілген жасушалар гипоксиялық инкубаторды пайдаланған кезде жақсы өмір сүру деңгейіне ие.
Нормоксикалық: 37°C, 21% O2, 5% CO2
Гипоксиялық: 37°C, 5%O2, 10% CO2
Доктор Уильям Стэнфорд-2022
13. hESC/iPSC өтуде
- 6 шұңқырлы матригельмен қапталған пластинаға 2 мл PSC медиасын қосып, бір жаққа қойыңыз.
- Өткізу үшін пластинаны алыңыз және баспа материалын құдықтан алып тастаңыз және 1 мл PBS(-/-) ерітіндісімен бір рет жуыңыз.
- Ұңғымаға 1 мл ЭДТА ерітіндісін қосып, бөлме температурасында 3-4 минутқа қалдырыңыз. Пластинаны жылжытпаңыз, өйткені ұяшықтар ажырай бастайды.
- EDTA ерітіндісін алыңыз және 1 мл PSC медиасын қосыңыз. EDTA-ны жасушаларда 4 минуттан артық қалдырмаңыз, себебі бұл жасушалардың көтерілуіне әкеледі.
- Ұяшықтарды қырғышты пайдаланып қырыңыз және PSC медиасы бар пластинаның 6 шұңқырының арасында ұяшықтарды бөліңіз. Колония бөліктерінің шамадан тыс бөлшектенуіне жол бермеңіз және қырғышпен жұмсақ болуға тырысыңыз. Жасушаларды үлкен бөліктерде ұстауға тырысыңыз. Қажет болса, түйіршіктерді бөлшектеу үшін кең ауызды тамшуыр ұшын пайдаланыңыз. Жасушалардың шамадан тыс ыдырауы жасуша өліміне немесе өтуден кейін шамадан тыс өздігінен дифференциацияға әкелуі мүмкін.
- 37-де инкубациялаңыз°C әрбір шұңқырдағы жасушаларды біркелкі таратқаннан кейін (8 фигура немесе L пішінді шайқау). Өткізуден кейін 24 сағат бойы пластинаның бұзылуын болдырмаңыз.
ЕСКЕРТУ: Ұяшықтар қырылғаннан кейін оларды мүмкіндігінше тезірек жаңа пластинаға ауыстырғыңыз келеді, себебі ұяшықтар тез (5 минут ішінде) қайта қосылады.
Егер EDTA жасушаларда 4 минуттан артық қалдырылса, жасушалар ажырай бастайды. Бұл орын алса, жасушаларды 4 мл PSC медиасымен 15 мл сұңқарға жинаңыз. Ұяшықтарды 5 минут бойы 130 rcf айналдырыңыз. Түйіршікті 1 мл баспа құралымен қайта суспензияға салып, 6 шұңқырлы матригельмен қапталған пластина арасында біркелкі бөліңіз (әр ұңғымаға 160 uL).
EDTA ерітіндісі: 500мл DPBS (-/-) ішіне 500мл 0,5М ЭДТА (рН 8,0) қосыңыз. 0,9 г NaCl қосыңыз. Стерильдеу үшін ерітіндіні сүзгіден өткізіп, 4°C температурада 6 айға дейін сақтаңыз.
Қағаздан:
Химиялық тұрғыдан анықталған культура жағдайында ферментсіз диссоциация арқылы адамның плюрипотентті дің жасушаларының өтуі және колониясының кеңеюі
Жанетт Бирс,1 Дэниел Р. Гулбрансон,2,3 Николь Джордж,4Лорен И. Синискалчи,1 Джеффри Джонс,4,5 Джеймс А. Томсон,2,3,6 және Гуокай Чен1,2
14. hESC/iPSC қату
- Bio-Cool (бақыланатын мұздатқыш) қосыңыз және температураны -7°C деңгейіне реттеңіз.
- Жасушаларды инкубатордан алып тастаңыз және микроскоптың астындағы қосылуы мен морфологиясын бақылаңыз.
- Ұңғымалар 70% қосылған болса, ескі баспа материалын алып тастаңыз және PBS(-/-) көмегімен бір рет жуыңыз, содан кейін әр ұңғымаға 1 мл ЭДТА ерітіндісін қосыңыз (EDTA ерітіндісімен өтуді қараңыз).
- Бөлме температурасында 3-4 минут инкубациялаңыз.
- EDTA ерітіндісін сорып алыңыз және 1 мл суық mFreSR тасымалдағышын қосыңыз (cat#05855, Stem Cell Technologies).
- Ұяшықтарды ақырын көтеру үшін ұяшық қырғышын пайдаланыңыз. Ұяшықтарды мүмкіндігінше үлкен бөліктерде ұстаңыз және тамшуырларды жоғары және төмен түсірмеңіз.
- Кең ауыз ұшын пайдаланып ұяшықтарды/mFreSR криотрубаға тасымалдаңыз. 8-қадамға дайын болғанша флакондарды мұзда ұстаңыз.
- Түтіктерді Bio-Cool ішіне салып, 10 минут инкубациялаңыз.
- Сұйық азот алыңыз.
- 10 минуттан кейін шпательді сұйық азотқа батырып, криоқұты жағына шамамен 10-30 секунд немесе криоқұты жағында кристалды пішінді көргенше тигізу арқылы жасушаларды себіңіз.
- «PROG» түймесін басу арқылы 1-бағдарламаны бастаңыз және түймені қайта басу арқылы бағдарламаны өтіңіз, сонда сіз 0,5°C/мин жылдамдықты көресіз. , содан кейін «RUN» түймесін басыңыз.
- Температура -65°C-қа жеткенде криотүтіктерді сұйық азотта тасымалдауға және сақтауға болады.
Баламалар
Тағы бір нұсқа - крио-түтіктерді мұздатқыш контейнерге (Biocision-CoolCell) салып, түні бойы -80°C температурада сақтау. Келесі күні крио түтіктерді сұйық азотқа (сұйық немесе бу фазасына) жылжытыңыз.
Доктор Уильям Стэнфорд-2022