1. iPSC Ғалым емес адамға арналған негізгі ақпарат

Бағаналы жасушалар - бұл әлі жетілмеген, жасушалардың бір түріне айналуға дайын емес жасушалар. Олар икемді, өйткені олар организмдегі жетілген жасушалардың көптеген түрлеріне айналуы мүмкін, мысалы, жүрек немесе қан тамырларын құрайтын жасушалар және басқа ұлпалар мен мүшелер. 2007 жылы зерттеушілер зертханада біз әдетте зерттеу мақсатында өсетін ересек ересек жасушаларды қайта бағдарламалау арқылы дің жасушаларын құру стратегиясын тапты.^{1, 2} . Жасанды түрде жасалған бұл бағаналы жасушалар индукцияланған плурипотентті бағаналы жасушалар («iPSCs») деп аталады. Прогерия өрісі үшін бұл үлкен жетістік. Алғаш рет ғалымдар енді Прогерияның дің жасушаларын жасай алады және Прогерияда дің жасушаларының қалай жұмыс істейтіні және дамитыны туралы сұрақтар қоя алады. Бұрын адамның Progeria дің жасушаларының қайнар көзі болмаған, сондықтан Progeria дің жасушаларының қалай жұмыс істейтіндігі туралы Progeria жоқ адамдардан шыққан дің жасушаларымен байланысты ақпараттың болмауы болған. Сонымен қатар, ғалымдар Прогерия дің жасушаларын қайта бағдарламалап, алғаш рет жетілген Прогерия қан тамырларын, жүрек жасушаларын және басқа жасуша түрлерін жасай алады. Осы уақытқа дейін адамның Progeria жүрек немесе қан тамырлары жасушаларының көзі болған емес.  Енді кілтті сұрай аламыз Прогерияда инфаркт пен инсульттан ерте өлімге әкелетін жүрек ауруы туралы сұрақтар. Біз бұл жаңалықтарды жүрек ауруы мен халықтың қартаюымен салыстыра аламыз және бәрімізде қартаюға не әсер ететіндігі туралы көбірек біле аламыз. Қазірдің өзінде Progeria дің жасушаларын қолдана отырып жарияланған бірнеше керемет зерттеулер болды.^3-5  Біздің Progeria Research Foundation-тегі мақсатымыз - бұл баға жетпес құралды қолдану арқылы көптеген жаңалықтарды ашуға көмектесу. Дің жасушаларындағы праймерді мына АҚШ үкіметінің веб-сайтынан қараңыз: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Индустриялық плурипотентті дің жасушасын (iPSC) қалыптастыру және тарату мақсаты Progeria Research Foundation

The Progeria зерттеу қорының миссиясы - Хатчинсон-Гилфорд Прогерия синдромын және оның қартаюмен байланысты бұзылыстарын емдеу және емдеу. 2009-де PRF жоғары сапалы Progeria iPSC-ін шығару үшін, PhD Уильям Стэнфордтың жетекшілігімен Торонто университетінің (Канада) университетінің ғалымдардан құралған сарапшылар тобымен ынтымақтастыққа келді. Доктор Стэнфорд Канададағы діңгекті жасушалар биологиясы бойынша ғылыми-зерттеу бөлімі. 2011-тен бастап, PRF Канададағы Оттава университетінде доктор Стэнфордпен, Канада медицина және медицина факультетінің профессоры және Оттава ауруханасы ғылыми-зерттеу институтының Спротт діңгек жасушаларын зерттеу орталығының аға ғылыми қызметкерімен серіктестікті жалғастыруда.

Біздің мақсатымыз - бұл баға жетпес құралды бүкіл әлемдегі зерттеушілерге ұсыну. Бұл жаңа зерттеу құралы Прогериядағы жаңа және инновациялық зерттеулерді, сондай-ақ оның жүрек аурулары мен қартаюымен байланысын қалыптастыру үшін қолданылады.  

3. Хатчинсон-Гилфорд-Прогерия синдромының индукцияланған-плурипотентті бағаналы жасушалары (iPSCs)

Индукцияланған-плурипотентті өзек жасушалары (iPSCs) төрт адам факторларының, Oct4, Sox2, Klf4 және c-Myc-тің VSVG-псевдотипті ретровирустық трансдукциясын қолдану арқылы алынған. iPSC колониялары тышқан-эмбриональды фибробласттарда (MEF) алынған. Қолданылған процедура негізінен бұрын сипатталғандай болды, бірақ EOS репортерын пайдаланбай (Natural Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Сапаны бақылау: тексеру және сипаттау

Қазіргі уақытта қол жетімді желілер бірнеше тексеру кезеңдерінен өтті (төменде жүктелетін PDF файлдарын қараңыз):

5. Осы iPS ұяшықтары алынған бастапқы бастапқы материал

iPSC-тер PRF Cell & Tissue Bank трансформацияланбаған фибробластты жасуша желілерінен алынған.

Барлық iPS желілері үшін қолданылатын конверсиялық әдіс ретровирус MKOS болды.

iPSC Line идентификаторы	мутация	Гендер және донорлықАге	Жасушаның пайда болу түрі Мында басыңыз.	Деректерді қолдау
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Еркек 2yr 0mo	Дермальды фибробласттар HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Еркек 2yr 0mo	Дермальды фибробласттар HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Еркек 2yr 0mo	Дермальды фибробласттар HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Еркек 8yr 5mo	Дерматикалық фибробласттар HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Еркек 8yr 5mo	Дерматикалық фибробласттар HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	HGADFN167 анасы (әсер етпейді)	37yr 10mo әйел	Дермальды фибробласттар HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	HGADFN167 анасы (әсер етпейді)	37yr 10mo әйел	Дермальды фибробласттар HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	HGADFN167-тің әкесі (әсер етпейді)	Еркек 40yr 5мо	Дерматикалық фибробласттар HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	HGADFN167-тің әкесі (әсер етпейді)	Еркек 40yr 5мо	Дермальды фибробласттар HGFDFN168	168 iPS1P

6. Болашақ iPSC жаңартулары мен жаңа ұяшық желілері үшін электрондық пошта тізіміне қосылыңыз

Біз iPSC желілерін жасауды жалғастырамыз. Егер сіз PRF Cell & Tissue Bank-тегі iPSC туралы мерзімді жаңартуларды алғыңыз келсе, біздің электрондық пошта тізіміне басу арқылы қосылыңыз Мұнда

7. Сұрақтар?

Лесли Гордонмен, MD, PhD, медициналық директормен кез-келген сұрақтарыңыз бен қажеттіліктеріңіз туралы хабарласыңыз lgordon@progeriaresearch.org немесе 978-535-2594

8. iPS ұяшық сызықтарына тапсырыс беру

2014-де PRF біздің MTA-ға ешқандай өзгеріс енгізбейді. Бұл 12 елдеріндегі мекемелерде жұмыс істейтін 70 зерттеу топтарымен жасалған 14 жылдық келісімшарттардың нәтижесі. PRF және оның кеңесшісі сол уақытта туындаған мәселелерді ескерді және келісімді түзеді, нәтижесінде біздің ойымызша әділ және орынды шарттар пайда болды.

АҚШ-тың Федералды үкіметтік мекемелері немесе сұрақтары бойынша Венди Норриске мына мекен-жай бойынша хабарласыңыз: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

1 қадам: өтінімді және материалды беру туралы келісімді толтырыңыз

Мемлекеттік емес мекемелер үшін өтініш және келісім

Мемлекеттік емес мекемелер үшін материалдарды беру туралы келісім

Қадам 2: Толтырылған өтінімді және материалды беру келісімін Венди Норриске қайтарыңыз wnorris@lifespan.org. Бекітілгеннен кейін, сіз тапсырысыңызды және күтілетін жеткізілім күнін растайтын электрондық пошта аласыз. 

Қадам 3: Доктор Стэнфордтың зертханасы қазіргі уақытта мұздатылған криовиальды сызықтарды таратуда. Оның зертханасы мәдениет жіберілген кезде сізге электронды пошта арқылы жеткізілім және қадағалау ақпаратын жібереді. Тәжірибесіз зерттеушілер адамның эмбриональды дің жасушасы / iPSC жұмысына қажет мамандандырылған курстарда білім алуға бағытталған.

Оттава госпиталінің ғылыми-зерттеу институтындағы адамның плюрипотентті дің жасушаларының қондырғысы (директоры доктор Стэнфорд) Progeria iPSC ұяшық желілеріне тән iPSC культурасының әдістерінің негіздері бойынша виртуалды жеке оқытуды ұсынады. Оқыту нұсқалары мен форматы ғалымдардың тәжірибе деңгейіне байланысты икемді.  Қосымша ақпарат алу үшін hpscf@ohri.ca электрондық поштасын жіберіңіз.

4-қадам: Оттава университеті сізге әр iPSC желісі үшін тікелей шот-фактура, егер бар болса, курьерлік шығындар.

9. HGPS және Control iPS жасуша мәдениетін тасымалдаушыларды дайындау

iPSC және ESC -ке Stem Cell Technologies (cat# 5825) mTeSR Plus беру керек. Сақтау бойынша жеткізушінің ұсыныстарын орындаңыз.

10. Матригель табақшаларын дайындау

Ескерту: Матрицельге қатысты барлық қадамдар мүмкіндігінше тезірек жасалуы керек және мүмкіндігінше суық күйде тұру керек.

1. Матригель бөтелкесін 4 градуста ерітіңіз°C. Ақуыз концентрациясын табу үшін сол лот бойынша талдау сертификатын тексеріңіз.
2. 12 мг/мл соңғы концентрацияға жету үшін еріген матригельге жеткілікті суық DMEM/F5 ортасын қосыңыз.
3. Алдын ала салқындатылған 1 мл сұңқар түтіктеріне 2-қадамдағы дайындалған матригелдің 15 мл аликвотын жасаңыз.
4. Барлық аликвоттарды -20 температурада мұздатыңыз және сақтаңыз°C.
5. Матригель пластиналарын жасау үшін -1-дан бір аликвоттық матригельді (20 мл) алыңыз°C және 10 мл суық DMEM/F12 қосыңыз. Түйіршіктер ерігенше жақсылап араластырыңыз (көпіршіктер жасамай, ерітіндіні әрқашан салқын ұстаңыз).
6. 50 мл түтікке құйыңыз, содан кейін 20 мл суық DMEM/F12 қосыңыз (1 мл матригель аликвоты 30 мл DMEM/F12 ішінде сұйылтылған), жақсылап араластырыңыз.
7. Пластина (1 шұңқырлы пластина үшін 6 мл/ұңғыма, 0.5 ұңғыма тақтасы үшін 12 мл/ұңғыма, 0.25 ұңғыма тақтасы үшін 24 мл/ұңғы). Пластинаны ақырын шайқау арқылы ерітіндінің бүкіл бет аймағын жауып тұрғанына көз жеткізіңіз. Қалған матригельді қайта қатырмаңыз.
8. Пластинаны дереу пайдалансаңыз, тақтайшаны бөлме температурасында 1 сағатқа (немесе 30 температурада 37 минут) қалдырыңыз.°C) микроскоппен матригельді бақылаңыз. Матригель жақсы дисперсті болуы керек және «тұтас» емес.
9. Пластиналарды басқа уақытта пайдалансаңыз, пластинаның шетін парафильммен орап, 4 градуста сақтаңыз°C 2 аптаға дейін.

Матригель - BD / Fisher, мысық # CB-40230

DMEM / F12 - өмір технологиялары, мысық # 11330-057

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

11. ES немесе iPS ұяшықтарын еріту (крио-шишеге)

1. Матригель пластинасын 4°C температурадан алыңыз және бөлме температурасында бір сағат бойы жылытыңыз немесе жаңа матригель пластинасын жасаңыз (матригель пластинасының протоколын дайындау бөлімін қараңыз).
2. 4 мл сұңқар түтігінде 15 мл mTeSR Plus жылытыңыз.
3. Сұйық азот резервуарынан ұяшықтарды алып тастаңыз және 37°C ваннада кішкене мұз бөлігі ғана қалғанша айналдырыңыз. Құты 1-2 минут ішінде еруі керек. Бұл қадамды тез орындау керек.
4. Этанолдық жасуша мен сұңқар медиа түтігі және сорғышқа салыңыз.
5. 1 мл пайдаланыңыз аузының кең ұшы баяу жасушаларды 4 мл алдын ала қыздырылған ортаға қосыңыз (жасушалық суспензияны араластырмаңыз).
6. 130 минут бойы 5 rcf айналдырыңыз.
7. Супернатанды алып тастаңыз.
8. 2 мл PSC медиасын және кең ауыз ұшымен қосыңыз түйіршіктерді ақырын бөлшектеңіз. Тасымалдаушыны 6 шұңқырлы пластинаның бір шұңқырына тасымалдаңыз, 2uL ROCK ингибиторын қосыңыз (Y27632, соңғы концентрациясы 10 мкм). Пластинаны бір матригельмен қапталған шұңқырға салыңыз (6 шұңқырлы пластинадан).
9. Жасушаларды біркелкі бөлу үшін жасушаларды жайлап тастаңыз және гипоксиялық инкубаторға салыңыз (5% O₂, 10% CO₂). Тұқым себуден кейін 24 сағат бойы пластинаның бұзылуын болдырмаңыз.

   ЕСКЕРТУ: Кесектердің шамадан тыс бұзылуын немесе агрессивті тамшуырларды болдырмау өте маңызды. Бұл өмір сүру деңгейін айтарлықтай төмендетуі мүмкін. Жасушалар тұқым себу кезінде үлкен 100-300 жасушадан тұратын бөліктерде қалуы керек. Жұмсақ болған кезде, криопротектормен байланыста болу уақытын азайту үшін жасушалар ерігеннен кейін жылдам жұмыс істеп көріңіз.

10. 24 сағаттан кейін тасушыны алып тастап, 2 мл PSC медиасын қосыңыз (6 ұңғыма үшін, 1 ұңғыма үшін 12 мл және 0.5 ұңғыма үшін 24 мл). hESC/iPSC протоколын жинау және күту бөлімін қараңыз.

ХҚКО-дағы ақпарат құралдары

mTeSR Plus Stem Cell Technologies (мысық №5825). Сақтау бойынша жеткізушінің ұсыныстарын орындаңыз.

Y27632 ROCK ингибиторы деген не?

ROCK ингибиторы Y27632 - ROCK Rho байланысты киназа p160 селективті тежегіші. ROCK Y27632 ингибиторымен емдеу адамның эмбриондық дің жасушаларының (hESC) және адам индукцияланған плюрипотентті дің жасушаларының (iPSC) диссоциациясынан туындаған апоптозды болдырмайды, өмір сүру жылдамдығын арттырады және hESC және hiPSCs субкультивация және еріту кезінде плюрипотенцияны сақтайды. ROCK ингибиторы Y27632 криоконсервация кезінде дің жасушаларының өмір сүру деңгейін жоғарылататыны да көрсетілген. Тау жыныстарының ингибиторларының аликвоталарының жарыққа және қайталанатын мұздату еріту циклдарына сезімтал екенін ескеріңіз. Бұл аликвоттарды жеткізуші ұсынған жарамдылық мерзімі ішінде қолданғаныңызға көз жеткізіңіз.

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

12. hESC/iPSC жинау және күтім жасау

1. Жасушалар ерігеннен кейінгі күні тірі қалу жылдамдығын анықтау үшін оларды микроскоппен қараңыз. ЕСКЕРТПЕ: қосылмаған ұяшықтардың көп болуы қалыпты жағдай. Кейбір жасушалар бекітілген болса, олардан 3-7 күн ішінде колониялар пайда болуы мүмкін.
2. Ұңғылардан медианы алып тастаңыз және әр ұңғымаға 2 мл (6 ұңғыма үшін, 1 ұңғыма үшін 12 мл және 0.5 ұңғыма пластинасы үшін 24 мл) жаңа және жылы PSC ортасын тамызыңыз. Пластинаны инкубаторға қайтарыңыз.
3. Жасушалар 60-70% қосылатын жерге дейін жеткізіледі (жеткізушінің ұсыныстарын орындаңыз).
4. 2 -ші күннен бастап жасушалар өсіп келе жатқан дифференциацияланған жасушалардан бақылануы және тазалануы керек.
5. Жасушаларды тазалау үшін сорғышты пайдаланыңыз және тамшуыр ұшымен сараланған жасушаларды қырыңыз.
6. Ұяшықтар тазартылғаннан кейін, жоғарыдағы қадамдардағыдай баспа құралын өзгертіңіз.

(HESC/iPSC мұздату немесе hESC/iPSC өту бөлімін қараңыз)

ЕСКЕРТУ:

PSC медиасының гипоксиялық ортада тиімдірек екендігі анықталды. Сондай-ақ, гипоксиялық инкубаторларда жасушаларды нормоксикпен салыстырғанда өсіргенде дифференциация аз болатынын байқадық. Соңында, егілген жасушалар гипоксиялық инкубаторды пайдаланған кезде жақсы өмір сүру деңгейіне ие.

Нормоксикалық: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

Гипоксиялық: 37°C, 5% O₂, 10% CO₂

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

13. hESC/iPSC өтуде

1. 2 шұңқырлы матригельмен қапталған пластинаға 6 мл PSC медиасын қосып, бір жаққа қойыңыз.
2. Өткізу үшін пластинаны алыңыз және баспа материалын құдықтан алып тастаңыз және 1 мл PBS(-/-) ерітіндісімен бір рет жуыңыз.
3. Ұңғымаға 1 мл ЭДТА ерітіндісін қосып, бөлме температурасында 3-4 минутқа қалдырыңыз. Пластинаны жылжытпаңыз, өйткені ұяшықтар ажырай бастайды.
4. EDTA ерітіндісін алыңыз және 1 мл PSC медиасын қосыңыз. EDTA-ны жасушаларда 4 минуттан артық қалдырмаңыз, себебі бұл жасушалардың көтерілуіне әкеледі.
5. Ұяшықтарды қырғышты пайдаланып қырыңыз және PSC медиасы бар пластинаның 6 шұңқырының арасында ұяшықтарды бөліңіз. Колония бөліктерінің шамадан тыс бөлшектенуіне жол бермеңіз және қырғышпен жұмсақ болуға тырысыңыз. Жасушаларды үлкен бөліктерде ұстауға тырысыңыз. Қажет болса, түйіршіктерді бөлшектеу үшін кең ауызды тамшуыр ұшын пайдаланыңыз. Жасушалардың шамадан тыс ыдырауы жасуша өліміне немесе өтуден кейін шамадан тыс өздігінен дифференциацияға әкелуі мүмкін.
6. 37-де инкубациялаңыз°C әрбір шұңқырдағы жасушаларды біркелкі таратқаннан кейін (8 фигура немесе L пішінді шайқау). Өткізуден кейін 24 сағат бойы пластинаның бұзылуын болдырмаңыз.

ЕСКЕРТУ: Ұяшықтар қырылғаннан кейін оларды мүмкіндігінше тезірек жаңа пластинаға ауыстырғыңыз келеді, себебі ұяшықтар тез (5 минут ішінде) қайта қосылады.

Егер EDTA жасушаларда 4 минуттан артық қалдырылса, жасушалар ажырай бастайды. Бұл орын алса, жасушаларды 15 мл PSC медиасымен 4 мл сұңқарға жинаңыз. Ұяшықтарды 130 минут бойы 5 rcf айналдырыңыз. Түйіршікті 1 мл баспа құралымен қайта суспензияға салып, 6 шұңқырлы матригельмен қапталған пластина арасында біркелкі бөліңіз (әр ұңғымаға 160 uL).

EDTA ерітіндісі: 500мл DPBS (-/-) ішіне 0.5мл 8.0М ЭДТА (рН 500) қосыңыз. 0.9 г NaCl қосыңыз. Стерильдеу үшін ерітіндіні сүзгіден өткізіп, 4°C температурада 6 айға дейін сақтаңыз.

Баяндамадан:

Химиялық анықталған культура жағдайында ферменттерсіз диссоциация жолымен адамның плурипотентті бағаналы жасушаларының өтуі және колониясының кеңеюі

Жанетт Бирс,¹ Даниэль Р. Гулбрансон,^2,3 Николь Джордж,⁴Лорен I. Синискалчи,¹ Джеффри Джонс,^4,5 Джеймс А. Томсон,^2,3,6 және Гуокай Чен^1,2

14. hESC/iPSC қату

1. Bio-Cool (бақыланатын мұздатқыш) қосыңыз және температураны -7°C деңгейіне реттеңіз.
2. Жасушаларды инкубатордан алып тастаңыз және микроскоптың астында қосылу мен морфологияны бақылаңыз.
3. Ұңғымалар 70% қосылған болса, ескі материалды алып тастаңыз және PBS(-/-) көмегімен бір рет жуыңыз, содан кейін әр ұңғымаға 1 мл ЭДТА ерітіндісін қосыңыз (EDTA ерітіндісімен өтуді қараңыз).
4. 3-4 минут ішінде бөлме температурасында инкубациялаңыз.
5. EDTA ерітіндісін сорып алыңыз және 1 мл суық mFreSR тасымалдағышын қосыңыз (кот №05855, Stem Cell Technologies).
6. Ұяшықтарды ақырын көтеру үшін ұяшық қырғышын пайдаланыңыз. Ұяшықтарды мүмкіндігінше үлкен бөліктерде ұстаңыз және тамшуырларды жоғары және төмен түсірмеңіз.
7. Кең ауыз ұшын пайдаланып ұяшықтарды/mFreSR криотрубаға тасымалдаңыз. 8-қадамға дайын болғанша флакондарды мұзда ұстаңыз.
8. Түтіктерді Bio-Cool ішіне салып, 10 минут инкубациялаңыз.
9. Сұйық азот алыңыз.
10. 10 минуттан кейін шпательді сұйық азотқа батырып, криоқұты жағына шамамен 10-30 секунд немесе криоқұты жағында кристалды пішінді көргенше тигізу арқылы жасушаларды себіңіз.
11. «PROG» түймесін басу арқылы 1-бағдарламаны бастаңыз және түймені қайтадан басу арқылы бағдарламаны өтіңіз, сонда сіз 0.5°C/мин жылдамдықты көресіз. , содан кейін «RUN» түймесін басыңыз.
12. Температура -65°C-қа жеткенде криотүтіктерді сұйық азотта тасымалдауға және сақтауға болады.

баламалары

Тағы бір нұсқа - крио-түтіктерді мұздатқыш контейнерге (Biocision-CoolCell) салып, түні бойы -80°C температурада сақтау. Келесі күні крио түтіктерді сұйық азотқа (сұйық немесе бу фазасына) жылжытыңыз.

Доктор Уильям Стэнфорд-2022