حدد صفحة

المستحثة Pluripotent

الخلايا الجذعية

 

بنك الخلايا والأنسجة لمؤسسة أبحاث Progeria الخلايا الجذعية المحفزة بفعل الإنسان (iPSC)

  1. Progeria iPSCs معلومات أساسية لغير العلماء 
  2. الغرض من المستحثة توليد الخلايا الجذعية المحفزة والتوزيع من قبل مؤسسة أبحاث Progeria  
  3. جيل من الخلايا الجذعية التي يسببها متلازمة هوتشينسون جيلفورد بروجيريا (iPSCs) 
  4. مراقبة الجودة: التحقق من الصحة والتوصيف 
  5. مواد البدء الأصلية التي تم اشتقاق iPSCs منها
  6. انضم إلى قائمة البريد الإلكتروني للحصول على تحديثات iPSC المستقبلية وخطوط الخلايا الجديدة  
  7. أسئلة؟ اتصل بنا.
  8. طلب خطوط iPSC 
  9. HGPS والتحكم iPSC ثقافة إعداد وسائل الإعلام 
  10. تحضير أطباق ماتريجيل 
  11. ذوبان خلايا hESCs و iPSCs (لكل قارورة مبردة)
  12. حصاد ورعاية hESC / iPSC 
  13. المرور hESC / iPSC 
  14. تجميد hESC / iPSC

1. iPSC معلومات أساسية لغير العلماء

الخلايا الجذعية هي خلايا "غير ناضجة" لم تلتزم بعد بأن تصبح أي نوع من الخلايا. وهي مرنة لأن لديها القدرة على التطور إلى أنواع مختلفة من الخلايا الناضجة في الجسم ، مثل الخلايا التي تشكل القلب أو الأوعية الدموية ، والأنسجة والأعضاء الأخرى. في عام 2007 ، اكتشف الباحثون استراتيجية لإنشاء خلايا جذعية في المختبر عن طريق إعادة برمجة الخلايا البالغة التي ننموها عادة لأغراض البحث.يناير ٢٠٢٤ . تسمى هذه الخلايا الجذعية المُنشأة صناعياً بالخلايا الجذعية المستحثة ("iPSCs"). بالنسبة لمجال Progeria ، يعد هذا إنجازًا كبيرًا. لأول مرة ، يمكن للعلماء الآن صنع خلايا جذعية من Progeria وطرح أسئلة حول كيفية عمل الخلايا الجذعية وتطورها في Progeria. في السابق لم يكن هناك مصدر للخلايا الجذعية البشرية من Progeria ، وبالتالي كان هناك فراغ من المعلومات حول كيفية عمل الخلايا الجذعية Progeria مقارنة بالخلايا الجذعية من الأشخاص الذين ليس لديهم Progeria. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للعلماء إعادة برمجة الخلايا الجذعية Progeria لإنشاء ، لأول مرة ، أوعية Progeria الدموية الناضجة وخلايا القلب وأنواع الخلايا الأخرى. حتى الآن ، لم يكن هناك مصدر للبروجيريا للقلب البشري أو خلايا الأوعية الدموية.  يمكننا الآن أن نسأل المفتاح أسئلة حول أمراض القلب التي تؤدي إلى الموت المبكر في Progeria من النوبات القلبية والسكتات الدماغية. يمكننا مقارنة هذه الاكتشافات بأمراض القلب والشيخوخة لدى عامة السكان واكتشاف المزيد حول ما يؤثر على الشيخوخة فينا جميعًا. تم بالفعل نشر العديد من الدراسات الممتازة باستخدام الخلايا الجذعية Progeria.3-5  هدفنا في Progeria Research Foundation هو تسهيل المزيد من الاكتشافات باستخدام هذه الأداة التي لا تقدر بثمن. للحصول على كتاب تمهيدي عن الخلايا الجذعية ، يرجى الاطلاع على هذا الموقع الإلكتروني للحكومة الأمريكية: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. تاكاهاشي K ، Tanabe K ، Ohnuki M ، Narita M ، Ichisaka T ، Tomoda K ، Yamanaka S. تحريض الخلايا الجذعية المحفزة من الخلايا الليفية البشرية البالغة حسب عوامل محددة. الخلية 2007؛ 131: 861-872.
    2. Yu J، Vodyanik MA، Smuga-Otto K، Antosiewicz-Bourget J، Frane JL، Tian S، Nie J، Jonsdottir GA، Ruotti V، Stewart R، Slukvin، II، Thomson JA. المستحثة خطوط الخلايا الجذعية المحفزة المستمدة من الخلايا الجسدية البشرية. العلم. 2007؛ 318: 1917-1920.
    3. Liu GH، Barkho BZ، Ruiz S، Diep D، Qu J، Yang SL، Panopoulos AD، Suzuki K، Kurian L، Walsh C، Thompson J، Boue S، Fung HL، Sancho-Martinez I، Zhang K، Yates J، 3rd ، Izpisua Belmonte JC. خلاصة الشيخوخة المبكرة مع iPSCs من متلازمة هوتشينسون جيلفورد بروجيريا. طبيعة. 2011؛ 472: 221-225.
    4. ميستيلي T. HGPS المستمدة من iPSCs للأعمار. خلية الخلايا الجذعية. 2011؛ 8: 4-6.

2. الغرض من توليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSC) وتوزيعها بواسطة مؤسسة Progeria Research Foundation

تتمثل مهمة مؤسسة Progeria Research Foundation في اكتشاف العلاجات والعلاج لمتلازمة هوتشينسون جيلفورد بروجيريا واضطراباتها المرتبطة بالشيخوخة. في 2009 ، دخلت PRF في تعاون مع فريق خبراء من العلماء في جامعة تورنتو ، كندا ، تحت إشراف William Stanford ، PhD ، لتوليد Progeria iPSCs عالي الجودة. الدكتور ستانفورد هو كرسي أبحاث كندا في بيولوجيا الخلايا الجذعية التكاملية. اعتبارا من 2011 ، يواصل PRF التعاون مع الدكتور ستانفورد في جامعة أوتاوا ، كندا حيث يعمل أستاذا للطب الخلوي والجزيئي ، كلية الطب ، وكبير العلماء في مركز Sprott التابع لمعهد أبحاث أبحاث مستشفى مستشفى أوتاوا.

هدفنا هو توفير هذه الأداة التي لا تقدر بثمن للباحثين في جميع أنحاء العالم. سيتم استخدام أداة البحث الجديدة هذه لإنشاء بحث جديد ومبتكر في Progeria ، بالإضافة إلى علاقتها بأمراض القلب والشيخوخة.  

3. جيل من الخلايا الجذعية التي يسببها متلازمة هوتشينسون جيلفورد بروجيريا (iPSCs)

تم اشتقاق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام نقل الفيروسات القهقرية VSVG-pseudotyped لأربعة عوامل بشرية ، Oct4 ، Sox2 ، Klf4 ، و c-Myc في الخلايا الليفية. تم اشتقاق مستعمرات iPSC على الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs). كان الإجراء المستخدم في الأساس كما هو موضح سابقًا ولكن بدون استخدام مراسل EOS (بروتوكولات الطبيعة 4: 1828-1844 ، 2009). 

4. مراقبة الجودة: التحقق من الصحة والتوصيف

شهدت الخطوط المتوفرة حاليًا عدة خطوات للتحقق من الصحة (انظر ملفات PDF القابلة للتنزيل أدناه):

 

    1. اختبار المايكوبلازما لكل سطر: أجرى مختبر الدكتور ستانفورد تحليل الميكوبلازما بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل خط خلوي. بالإضافة إلى ذلك ، بعد التمدد وقبل خلايا الشحن ، سيتم إعادة اختبار الخطوط للميكوبلازما.
    2. المناعية لعلامات القدرة على التحمل Tra-1-60 و Tra-1-81 و SSEA4.
    3. الفوسفاتيز القلوية تلطيخ كمؤشر على تعدد القدرات
    4. تشكيل الجسم الجنيني والتثبيط المناعي اللاحق لعلامات الطبقات الجرثومية الثلاث. كانت العلامات التي تم اختبارها هي TubIII-Tubulin (Ectoderm) و Smooth-Muscle Actin (Mesoderm) و Gata4 أو AFP (Endoderm)
    5. تحليل النمط النووي.
    6. إعادة التعبير عن الأمين A في خلايا متباينة
    7. اختبارات مسخي

التحقق من صحة إضافية في العملية:
أكملت بعض الخطوط فحوصات مسخي كما هو موضح في البيانات الداعمة. بالنسبة لجميع الخطوط الأخرى ، تجري فحوصات مسخيّ الحالة وسيتم تحديث الحالة مع استكمال هذه المقايسات.

5. مادة البداية الأصلية التي اشتُقت منها خلايا iPS

تم اشتقاق iPSCs من خطوط الخلايا الليفية غير المحولة لخلايا PRF وبنك الأنسجة.

طريقة التحويل المستخدمة لجميع خطوط iPS كانت Retrovirus MKOS.

معرف خط iPSCتحولالجنس و التبرعمنشأ نوع الخلية اضغط هنا.البيانات الداعمة
HGADFN003 iPS 1B LMNAExon 11 ،
1824 C> T		ذكر 2yr 0mo الخلايا الليفية الجلدية
HGADFN003		003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C LMNA Exon 11 ،
1824 C> T		ذكر 2yr 0mo الخلايا الليفية الجلدية
HGADFN003		003 iPS1C
HGDFN003
iPS 1D		LMNA Exon 11 ،
1824 C> T		ذكر 2yr 0mo الخلايا الليفية الجلدية
HGADFN003		003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J LMNA Exon 11، 1824 C> Tذكر 8yr 5moالخلايا الليفية الجلدية HGADFN167167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q LMNA Exon 11، 1824 C> Tذكر 8yr 5moالخلايا الليفية الجلدية HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B والدة HGADFN167 (لم تتأثر)أنثى 37yr 10moالخلايا الليفية الجلدية
HGMDFN090		090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C والدة HGADFN167 (لم تتأثر)أنثى 37yr 10moالخلايا الليفية الجلدية
HGMDFN090		090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2والد HGADFN167 (غير متأثر)ذكر 40yr
5mo		الخلايا الليفية الجلدية HGFDFN168168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1Pوالد HGADFN167 (غير متأثر)ذكر 40yr
5mo		الخلايا الليفية الجلدية
HGFDFN168		168 iPS1P

PRF خطوط الخلايا المتاحة

6. انضم إلى قائمة البريد الإلكتروني للحصول على تحديثات iPSC المستقبلية وخطوط الخلايا الجديدة

نحن مستمرون في إنشاء خطوط iPSC. إذا كنت ترغب في الحصول على تحديثات دورية على iPSCs الموجودة في PRF Cell & Tissue Bank ، فيرجى الانضمام إلى قائمة البريد الإلكتروني الخاصة بنا بالنقر فوق هنا

7. أسئلة؟

يرجى الاتصال ليزلي جوردون ، MD ، دكتوراه ، المدير الطبي ، مع أي أسئلة أو احتياجات ، في lgordon@progeriaresearch.org أو 978-535-2594

8. طلب ​​خطوط خلية iPS

في 2014 ، وضعت PRF سياسة عدم وجود تغييرات على MTA لدينا. هذا هو نتيجة سنوات 12 من الترتيبات التعاقدية مع فرق بحث 70 التي تعمل في مؤسسات في بلدان 14. أخذت PRF ومحاميها في الاعتبار القضايا التي نشأت في تلك الفترة الزمنية وتحرير الاتفاق وفقا لذلك ، مما أدى إلى ما نشعر به شروط عادلة ومعقولة.

بالنسبة للمؤسسات الحكومية الفيدرالية الأمريكية أو الأسئلة ، يرجى الاتصال بـ Wendy Norris على: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

الخطوة 1: إكمال تطبيق واتفاقية نقل المواد

تطبيق واتفاق المؤسسات غير الحكومية

اتفاقية نقل المواد للمؤسسات غير الحكومية

خطوة 2 أعد الطلب المكتمل واتفاقية نقل المواد إلى Wendy Norris في wnorris@lifespan.org. بمجرد الموافقة ، ستتلقى بريدًا إلكترونيًا يؤكد طلبك وتاريخ الشحن المتوقع. 

خطوة 3 يوزع مختبر الدكتور ستانفورد حاليًا خطوطًا في قوارير مجمدة. سيرسل لك مختبره بريدًا إلكترونيًا عندما يتم شحن الثقافة ، مع معلومات الشحن والتتبع. يتم توجيه الباحثين عديمي الخبرة للحصول على تدريب في دورات متخصصة ضرورية لعمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية / iPSCs.

يقدم مرفق الخلايا الجذعية البشرية (يديره الدكتور ستانفورد) في معهد أبحاث مستشفى أوتاوا تدريبًا افتراضيًا فرديًا على أساسيات تقنيات ثقافة iPSC الخاصة بخطوط خلايا Progeria iPSC. تتسم خيارات التدريب وشكله بالمرونة اعتمادًا على مستوى خبرة العلماء.  لمزيد من المعلومات ، يرجى إرسال بريد إلكتروني إلى hpscf@ohri.ca.

الخطوة 4: ستصدر لك جامعة أوتاوا فاتورة مباشرة لكل خط iPSC بالإضافة إلى تكاليف البريد السريع ، إن وجدت.

9. HGPS والتحكم في iPS Cell Culture Preparation

يجب تغذية iPSC و ESCs بـ mTeSR Plus من تقنيات الخلايا الجذعية (cat # 5825). يرجى اتباع توصيات المورد للتخزين.

10. تحضير أطباق ماتريجيل

ملاحظات: جميع الخطوات التي تنطوي على matrigel ينبغي القيام به في أسرع وقت ممكن والبقاء باردة قدر الإمكان.

  1. زجاجة matrigel ذوبان الجليد في 4°ج. تحقق من شهادة التحليل الخاصة بتلك الكمية لمعرفة تركيز البروتين فيها.
  2. أضف وسائط DMEM / F12 باردة كافية إلى matrigel المذابة للوصول إلى تركيز نهائي قدره 5mg / mL.
  3. اصنع قسامات بسعة 1 مل من مادة matrigel المحضرة من الخطوة 2 في أنابيب صقر سعة 15 مل مبردة مسبقًا.
  4. قم بتجميد وتخزين جميع القسامات عند -20°C.
  5. لعمل ألواح matrigel ، قم بإزالة جزء واحد من matrigel (1mL) من -20°C وأضف 10 مل من DMEM / F12 البارد. اخلط جيدًا حتى تذوب الحبيبات (بدون تكوين فقاعات ، واحتفظ دائمًا بالمحلول باردًا).
  6. انقل إلى أنبوب 50 مل ، ثم أضف 20 مل من DMEM / F12 البارد (1 مل من قسامة matrigel مخفف في 30 مل من DMEM / F12) ، اخلط جيدًا.
  7. صفيحة (1 مل / بئر لـ 6 صفيحة جيدة ، 0.5 مل / بئر لـ 12 صفيحة جيدة ، 0.25 مل / بئر لـ 24 صفيحة جيدة). تأكد من أن المحلول يغطي مساحة السطح بالكامل عن طريق هز اللوحة برفق. لا تعيد تجميد أي بقايا ماتريجيل.
  8. في حالة استخدام الطبق على الفور ، اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة (أو 1 دقيقة عند 30 دقيقة°ج) مراقبة matrigel تحت المجهر. يجب أن تكون مادة Matrigel متفرقة بشكل جيد وليست "متكتلة".
  9. إذا كنت تستخدم الأطباق في وقت آخر ، فلف حافة اللوحة مع البارافيلم وقم بتخزينها في 4°C لمدة تصل إلى أسبوعين.

Matrigel - BD / Fisher ، القط # CB-40230

DMEM / F12 - تقنيات الحياة ، القط # 11330-057

الدكتور ويليام ستانفورد - 2022

11 ذوبان خلايا ES أو iPS (لكل قارورة)

  1. خذ لوحة matrigel من 4 درجات مئوية ودفئها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، أو اصنع لوحة matrigel جديدة (انظر إعداد بروتوكول لوحة matrigel).
  2. دافئ 4 مل من mTeSR Plus في أنبوب صقر 15 مل.
  3. قم بإزالة الخلايا من خزان النيتروجين السائل وقم بتدويرها في حمام 37 درجة مئوية حتى يتبقى جزء صغير من الجليد. يجب أن تذوب القارورة خلال 1-2 دقيقة. يجب القيام بهذه الخطوة بسرعة.
  4. أنبوب خلية الإيثانول وأنبوب وسائط الصقر ووضعه في الغطاء.
  5. استخدم 1 مل واسع الفم ببطء إضافة خلايا إلى 4 مل من الوسائط المُدفأة مسبقًا (تجنب خلط تعليق الخلية).
  6. تدور على 130 متر مكعب لمدة 5 دقائق.
  7. إزالة طاف.
  8. أضف 2 مل من وسائط PSC ، وبفم واسع تفتيت الكتل بلطف. نقل الوسائط إلى بئر واحد من 6 صفيحة جيدة إضافة 2uL من مثبط ROCK (Y27632 ، التركيز النهائي 10uM). صفيحة في بئر مطلية بماتريجيل (من صفيحة 6 آبار).
  9. الخلايا الصخرية برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي ، وتوضع في حاضنة ناقصة التأكسج (5٪ O2، 10٪ CO2). تجنب اضطراب الصفائح لمدة 24 ساعة بعد البذر.

    NOTE: من المهم جدًا تجنب الانهيار المفرط للكتل أو المصاصات العدوانية. هذا يمكن أن يقلل بشكل كبير من معدل البقاء على قيد الحياة. يجب أن تبقى الخلايا في كتل من 100-300 خلية كبيرة في وقت البذر. أثناء كونك لطيفًا ، حاول العمل بسرعة بمجرد إذابة الخلايا لتقليل وقت ملامستها للواقي من التجمد.

  10. قم بإزالة الوسائط بعد 24 ساعة وأضف 2 مل من وسائط PSC (لمدة 6 بئر ، 1 مل لمدة 12 بئر و 0.5 مل لمدة 24 لوحة بئر). انظر الحصاد والعناية ببروتوكول hESC / iPSC.

    PSC وسائل الإعلام

    mTeSR Plus من تقنيات الخلايا الجذعية (القط # 5825). يرجى اتباع توصيات المورد للتخزين.

    ما هو ROCK المانع Y27632؟

    مثبط ROCK Y27632 هو مثبط انتقائي لـ Rho المرتبط كيناز p160 ROCK. يمنع العلاج بمانع ROCK Y27632 موت الخلايا المبرمج الناجم عن تفكك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، مما يزيد من معدل البقاء على قيد الحياة ويحافظ على تعدد القدرات أثناء الزراعة الفرعية وذوبان hESCs و hiPSCs. ثبت أيضًا أن ROCK Inhibitor Y27632 يعزز معدل بقاء الخلايا الجذعية أثناء الحفظ بالتبريد. لاحظ أن قسامات مثبطات الصخور حساسة للضوء ودورات ذوبان الجليد المتكرر. تأكد من استخدام هذه القسامات خلال فترة الصلاحية الموصى بها من المورد.

    الدكتور ويليام ستانفورد - 2022

    12 حصاد ورعاية hESC / iPSC

    1. في اليوم التالي لإذابة الخلايا ، ألق نظرة عليها تحت المجهر لتحديد معدل البقاء على قيد الحياة. ملاحظة: من الطبيعي ملاحظة عدد كبير من الخلايا غير المرتبطة. طالما أن بعض الخلايا متصلة ، يمكن أن تنشأ مستعمرات منها في غضون 3-7 أيام.
    2. إزالة الوسائط من الآبار والماصة 2 مل (6 بئر ، 1 مل لمدة 12 بئر و 0.5 مل للوحة بئر 24) من وسائط PSC الطازجة والدافئة لكل بئر. إعادة اللوحة إلى الحاضنة.
    3. يتم تغذية الخلايا حتى تتكدس بنسبة 60-70٪ (اتبع توصيات المورد).
    4. اعتبارًا من اليوم الثاني ، يجب ملاحظة الخلايا وتنظيفها من أي خلايا متمايزة قد تنمو.
    5. لتنظيف الخلايا ، استخدم غطاء الالتقاط واكشط الخلايا المتمايزة بطرف ماصة.
    6. بمجرد تنظيف الخلايا ، قم بتغيير الوسائط كما هو الحال في الخطوات المذكورة أعلاه.

    (انظر تجميد hESC / iPSC أو تمرير hESC / iPSC)

    NOTE:

    تم تحديد وسائط PSC لتكون أكثر كفاءة في بيئة نقص الأكسجين. لقد لاحظنا أيضًا أن أقل تمايزًا يحدث عندما تزرع الخلايا في حاضنات ناقصة التأكسج مقابل السمية. أخيرًا ، تتمتع الخلايا المصنفة بمعدل بقاء أفضل عند استخدام حاضنة ناقصة التأكسج.

    نورموكسي: 37°ج ، 21٪ O2، 5٪ CO2

    نقص الأكسجين: 37°ج ، 5٪ أ2، 10٪ CO2

    الدكتور ويليام ستانفورد - 2022

    13 تمرير hESC / iPSC

    1. أضف 2 مل من وسائط PSC إلى صفيحة مطلية جيدًا 6 matrigel وضعها جانبًا.
    2. خذ اللوحة المراد تمريرها وإزالة الوسائط من البئر وغسلها مرة واحدة باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني (- / -).
    3. أضف 1 مل من محلول EDTA إلى البئر واتركه لمدة 3-4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لا تحرك اللوحة حيث يمكن أن تبدأ الخلايا في الانفصال.
    4. أزل محلول EDTA وأضف 1 مل من وسائط PSC. لا تترك EDTA على الخلايا لأكثر من 4 دقائق لأن هذا سيؤدي إلى انطلاق الخلايا.
    5. كشط الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا وقسم الخلايا بين الآبار الستة في اللوحة التي تحتوي على وسائط PSC. تجنب التكسير المفرط لقطع المستعمرة ، وحاول أن تكون لطيفًا مع الكشط. حاول الاحتفاظ بالخلايا في أجزاء كبيرة. استخدم طرف ماصة واسع الفم لتفتيت التكتلات إذا لزم الأمر. قد يؤدي التفكك المفرط للخلايا إلى موت الخلايا أو التمايز التلقائي المفرط بعد المرور.
    6. احتضان في 37°C بعد توزيع الخلايا بالتساوي في كل بئر (8 شكل أو L تهتز). تجنب اضطراب الصفيحة لمدة 24 ساعة بعد المرور.

    ملحوظة: بمجرد أن يتم كشط الخلايا ، فأنت تريد نقلها إلى اللوحة الجديدة في أسرع وقت ممكن لأن الخلايا ستتم إعادة توصيلها بسرعة (في غضون 5 دقائق).

    إذا تُرك EDTA على الخلايا لأكثر من 4 دقائق ، يمكن أن تبدأ الخلايا في الانفصال. إذا حدث هذا ، ما عليك سوى جمع الخلايا في صقر سعة 15 مل مع 4 مل من وسائط PSC. تدور الخلايا على 130 وحدة تحكم في الدقيقة لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات باستخدام 1 مل من الوسائط وقسمها بالتساوي بين 6 صفيحة مطلية جيدًا (160 ميكرولتر لكل بئر).

    محلول EDTA: أضف 500uL من 0.5M EDTA (درجة الحموضة 8.0) إلى 500 مل من DPBS (- / -). أضف 0.9 جم من كلوريد الصوديوم. قم بتصفية المحلول لتعقيمه وتخزينه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

    من الورقة:

    توسع مستعمرة وخلايا جذعية بشرية متعددة القدرات عن طريق التفكك الخالي من الإنزيم في ظروف استنبات محددة كيميائيا

    جانيت بيرز,1 دانييل ر. جولبرانسون,2,3 نيكول جورج,4لورين آي سينيسكيتشي,1 جيفري جونز,4,5 جيمس أ. طومسون,2,3,6 و قوكاي تشن1,2

    14 تجميد hESC / iPSC

    1. قم بتشغيل Bio-Cool (المجمد ذي المعدل المتحكم فيه) واضبط درجة الحرارة على -7 درجة مئوية.
    2. إزالة الخلايا من الحاضنة ومراقبة التقاء والتشكل تحت المجهر.
    3. إذا كانت الآبار متكدسة بنسبة 70٪ ، فقم بإزالة الوسائط القديمة واغسلها مرة واحدة باستخدام PBS (- / -) ثم أضف 1 مل من محلول EDTA (انظر المرور بمحلول EDTA) لكل بئر.
    4. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 دقيقة.
    5. نضح محلول EDTA وأضف 1 مل من وسائط mFreSR الباردة (القط # 05855 ، تقنيات الخلايا الجذعية).
    6. استخدم مكشطة الخلية لرفع الخلايا برفق. احتفظ بالخلايا في قطع كبيرة قدر الإمكان وتجنب الماصات لأعلى ولأسفل.
    7. نقل الخلايا / mFreSR إلى أنبوب تجميد باستخدام طرف فم واسع. حافظ على القوارير على الجليد حتى تصبح جاهزة للخطوة 8.
    8. ضع الأنابيب في Bio-Cool واحتضانها لمدة 10 دقائق.
    9. الحصول على النيتروجين السائل.
    10. بعد 10 دقائق ، قم بزرع الخلايا عن طريق غمس ملعقة في النيتروجين السائل ولمس جانب قارورة التبريد لمدة 10-30 ثانية تقريبًا أو حتى ترى شكلًا بلوريًا على جانب قارورة التبريد.
    11. ابدأ البرنامج 1 بالضغط على زر "PROG" وتصفح البرنامج بالضغط على الزر مرة أخرى وسترى معدل 0.5 درجة مئوية / دقيقة. ، ثم اضغط على "RUN".
    12. بمجرد أن تصل درجة الحرارة إلى -65 درجة مئوية ، يمكن نقل أنابيب التبريد وتخزينها في النيتروجين السائل.

    بدائل

    خيار آخر هو وضع أنابيب التبريد في حاوية تجميد (Biocision-CoolCell) وتخزينها في -80 درجة مئوية طوال الليل. انقل أنابيب التبريد إلى نيتروجين سائل (طور سائل أو بخار) في اليوم التالي.

    الدكتور ويليام ستانفورد - 2022

    تسجيل

    لنا

    النشرة الإخبارية!

    سجّل الآن

    سويا نحن

    ويل

    العثور على علاج!

    تبرع الآن