पृष्ठ निवडा

प्रेरित प्लुरिपोटेंट

स्टेम पेशी

 

प्रोजेरिया रिसर्च फाऊंडेशन सेल आणि टिश्यू बँक मानवी प्रेरित प्ल्युरोपोटेन्ट स्टेम सेल्स (आयपीएससी)

  1. प्रोजेरिया आयपीएससी गैर-वैज्ञानिकांसाठी पार्श्वभूमी माहिती 
  2. चा उद्देश प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशनद्वारे प्रेरित प्लुरीपोटेन्ट स्टेम सेल निर्मिती आणि वितरण  
  3. हचिन्सन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम प्रेरित-प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल्स (आयपीएससी) ची निर्मिती 
  4. गुणवत्ता नियंत्रण: प्रमाणीकरण आणि वैशिष्ट्यीकरण 
  5. मूळ प्रारंभिक साहित्य ज्यातून आयपीएससी व्युत्पन्न होते
  6. फ्यूचर आयपीएससी अपडेट्स आणि नवीन सेल लाईन्ससाठी आमच्या ईमेल यादीमध्ये सामील व्हा  
  7. प्रश्न? आमच्याशी संपर्क साधा.
  8. आयपीएससी लाईन्स ऑर्डर करीत आहे 
  9. एचजीपीएस आणि कंट्रोल आयपीएससी कल्चर मीडिया तयारी 
  10. मॅट्रिजेल प्लेट्स तयार करणे 
  11. hESCs आणि iPSCs पेशी वितळणे (प्रति क्रायो-वायल)
  12. एचईएससी / आयपीएससीची काढणी व काळजी 
  13. पासिंग hESC/iPSC 
  14. फ्रीजिंग hESC/iPSC

एक्सएनयूएमएक्स. आयपीएससी पार्श्वभूमी माहिती बिगर वैज्ञानिकांसाठी नाही

स्टेम सेल्स “अपरिपक्व” पेशी आहेत ज्या अद्याप कोणत्याही पेशीचा प्रकार बनण्यास वचनबद्ध नाहीत. ते लवचिक आहेत कारण त्यांच्यात शरीरात अनेक प्रकारच्या प्रौढ पेशी, जसे की हृदय किंवा रक्तवाहिन्या बनविणारे पेशी आणि इतर ऊतक आणि अवयव विकसित करण्याची क्षमता आहे. २०० In मध्ये, संशोधकांनी प्रयोगशाळेत आपण सामान्यतः संशोधनाच्या उद्देशाने वाढत असलेल्या प्रौढ पेशींचे पुनर्प्रोग्राम करून स्टेम सेल तयार करण्याचे धोरण शोधले.1, 2 . या कृत्रिमरित्या तयार केलेल्या स्टेम सेलला इंड्युस्ड प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (“आयपीएससी”) म्हणतात. प्रोजेरिया क्षेत्रासाठी ही एक मोठी प्रगती आहे. प्रथमच, वैज्ञानिक आता प्रोजेरिया स्टेम पेशी बनवू शकतात आणि प्रोजेरियामध्ये स्टेम पेशी कशा कार्य करतात आणि कसे विकसित होतात याबद्दल प्रश्न विचारू शकतात. पूर्वी मानवी प्रोजेरिया स्टेम पेशींचा कोणताही स्रोत नव्हता आणि म्हणूनच प्रोजेरिया नसलेल्या लोकांच्या स्टेम पेशींच्या तुलनेत प्रोजेरिया स्टेम सेल्स कसे कार्य करतात याबद्दल माहिती शून्य होती. याव्यतिरिक्त, शास्त्रज्ञ प्रथमच प्रोजेरिया रक्तवाहिन्या, हृदयाच्या पेशी आणि इतर पेशींचे प्रकार तयार करण्यासाठी प्रोजेरिया स्टेम पेशी पुन्हा प्रोग्राम करू शकतात. आतापर्यंत मानवी प्रोजेरिया हृदय किंवा रक्तवाहिन्या पेशींचा कोणताही स्रोत नव्हता.  आम्ही आता की विचारू शकतो हृदयरोगाबद्दलचे प्रश्न ज्यामुळे हृदयविकाराचा झटका आणि स्ट्रोकमुळे प्रोजेरियामध्ये लवकर मृत्यू होतो. आपण या शोधांची तुलना सर्वसाधारण लोकांमधील हृदयरोग आणि वृद्धत्वाशी करू शकतो आणि आपल्या सर्वांमध्ये वृद्धत्वावर काय परिणाम होतो याबद्दल अधिक शोधू शकतो. आधीपासूनच प्रोजेरिया स्टेम पेशींचा वापर करून बरेच उत्कृष्ट अभ्यास प्रकाशित केले गेले आहेत.3-5  प्रोजेरिया रिसर्च फाऊंडेशनचे आमचे उद्दीष्ट आहे की हे अमूल्य साधन वापरुन आणखी बरेच शोध लावणे. स्टेम सेल्सवरील प्राइमरसाठी, कृपया यूएस सरकारची वेबसाइट पहा: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. ताकाहाशी के, तानाबे के, ओहनुकी एम, नरिता एम, इचिसाका टी, टोमोडा के, यमानाका एस. परिभाषित घटकांद्वारे प्रौढ मानवी फायब्रोब्लास्ट्समधून प्ल्युरोपोटेन्ट स्टेम पेशींचा समावेश. सेल 2007; 131: 861-872.
    2. यू जे, वोदॅनिक एमए, स्मुगा-ऑट्टो के, अँटोसिव्हिक्झ-बोर्जेट जे, फ्रान् जेएल, टियान एस, नी जे, जोन्सडॉटीर जीए, रुओटी व्ही, स्टीवर्ट आर, स्लूकविन, द्वितीय, थॉमसन जेए. मानवी सोमाटिक पेशींपासून तयार केलेली प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाईन्स. विज्ञान 2007; 318: 1917-1920.
    3. लिऊ जीएच, बार्खो बीझेड, रुईज एस, डायप डी, क्यू जे, यांग एसएल, पानोपौलोस एडी, सुझुकी के, कुरियन एल, वॉल्श सी, थॉम्पसन जे, बोए एस, फंग एचएल, सांचो-मार्टिनेझ प्रथम, झांग के, येट्स जे, एक्सएनयूएमएक्सर्ड, इजपिसुआ बेलमोंटे जेसी. हचिन्सन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोमच्या आयपीएससीसह अकाली वृद्धत्वाचे पुनर्वसन. निसर्ग 2011; 472: 221-225.
    4. वयोगटातील मिस्टेली टी. एचजीपीएस-व्युत्पन्न आयपीएससी. सेल स्टेम सेल. 2011; 8: 4-6.

२. प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन द्वारा प्रेरित प्ल्युरीपोटेन्ट स्टेम सेल (आयपीएससी) निर्मिती आणि वितरणचा उद्देश

प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशनचे ध्येय हचिंसन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम आणि त्याच्या वृद्धत्वाशी संबंधित विकारांवर उपचार आणि त्यांचे उपचार शोधणे आहे. एक्सएनयूएमएक्समध्ये, पीआरएफने विल्यम स्टॅनफोर्ड, पीएचडीच्या निर्देशानुसार, कॅनडाच्या टोरोंटो विद्यापीठातील वैज्ञानिकांच्या तज्ञांच्या टीमसह सहकार्याने उच्च दर्जाचे प्रोजेरिया आयपीएससी तयार केले. डॉ. स्टॅनफोर्ड एकात्मिक स्टेम सेल जीवशास्त्रातील कॅनडा रिसर्च चेअर आहेत. एक्सएनयूएमएक्स नुसार, पीआरएफने कॅनडाच्या ओटावा विद्यापीठात डॉ. स्टॅनफोर्डबरोबर सहकार्य केले आहे जिथे ते सेल्युलर अणि आण्विक औषध, मेडिसिन फॅकल्टीचे प्रोफेसर आणि ओटावा हॉस्पिटल रिसर्च इन्स्टिट्यूटच्या स्प्रॉट सेंटर फॉर स्टेम सेल रिसर्चचे वरिष्ठ वैज्ञानिक आहेत.

हे अमूल्य साधन जगभरातील संशोधकांना प्रदान करण्याचे आपले लक्ष्य आहे. हे नवीन संशोधन साधन प्रोजेरियामध्ये नवीन आणि नाविन्यपूर्ण संशोधन निर्माण करण्यासाठी वापरले जाईल, तसेच हृदयरोग आणि वृद्धत्वाशी संबंधित असलेले.  

एक्सएनयूएमएक्स. हचिन्सन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम प्रेरित-प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल्स (आयपीएससी) ची निर्मिती

ऑक्टू 4, सोक्स 2, केएलएफ 4 आणि सी-मायक या फायब्रोब्लास्ट्समध्ये चार मानवी घटकांचे व्हीएसव्हीजी-स्यूडोटाइपड रेट्रोव्हायरल ट्रान्सड्रक्शनचा वापर करून प्रेरित-प्ल्युरीपोटेन्ट स्टेम सेल्स (आयपीएससी) काढले गेले. आयपीएससी वसाहती माऊस-भ्रुण फायब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) वर घेण्यात आल्या. वापरलेली प्रक्रिया मूलत: पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे होती परंतु ईओएस रिपोर्टरच्या वापराशिवाय (नेचर प्रोटोकॉल 4: 1828-1844, 2009). 

एक्सएनयूएमएक्स. गुणवत्ता नियंत्रण: प्रमाणीकरण आणि वैशिष्ट्यीकरण

सध्या उपलब्ध असलेल्या ओळींमध्ये अनेक प्रमाणीकरण चरण पार पडले आहेत (खाली डाउनलोड करण्यायोग्य पीडीएफ पहा):

 

    1. प्रत्येक ओळीसाठी मायकोप्लाझ्मा चाचणीः डॉ. स्टॅनफोर्डच्या प्रयोगशाळेने प्रत्येक सेल लाईनसाठी पीसीआरद्वारे मायकोप्लाज्मॅनालिसिस केले आहे. याव्यतिरिक्त, विस्तारानंतर आणि शिपिंग सेल्सच्या अगोदर, मायकोप्लाझ्मासाठी ओळींचे परीक्षण केले जाईल.
    2. ट्रॅ-एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स, ट्रा-एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स आणि एसएसईएक्सएनयूएमएक्स मार्कर प्लुरीपॉन्सी मार्करसाठी इम्युनोस्टेनिंग.
    3. अल्कधर्मी फॉस्फेटसे प्लुरिपोटेंसीचे सूचक म्हणून डाग
    4. गर्भाशय शरीर तयार करणे आणि त्यानंतरच्या तीन जंतु-थरांच्या मार्करसाठी रोगप्रतिकारक शक्ती. Tested आयआय-ट्यूबुलिन (एक्टोडर्म), स्मूथ-स्नायू अ‍ॅक्टिन (मेसोडर्म) आणि गाटाएक्सएनयूएमएक्स किंवा एएफपी (एन्डोडर्म) चाचणी केलेले मार्कर होते
    5. कॅरिओटाइप विश्लेषण.
    6. विभेदित पेशींमध्ये लॅमिन ए ची पुन्हा अभिव्यक्ती
    7. टेराटोमा अ‍ॅसेस

प्रक्रियेत अतिरिक्त प्रमाणीकरण:
सहाय्यक डेटामध्ये दर्शविल्याप्रमाणे काही ओळींनी टेरॅटोमा अससेस पूर्ण केले आहेत. इतर सर्व ओळींसाठी, टेरॅटोमा अ‍ॅसेज प्रक्रियेत आहेत आणि ही गाळे पूर्ण झाल्यामुळे स्थिती अद्ययावत केली जाईल.

Orig. मूळ प्रारंभिक सामग्री जिथून या आयपीएस सेल घेण्यात आल्या

आयपीएससी पीआरएफ सेल आणि टिश्यू बँक न-ट्रान्सफॉर्म्ड फायब्रोब्लास्ट सेल लाइनमधून घेण्यात आल्या आहेत.

सर्व आयपीएस लाइनसाठी वापरली जाणारी ट्रान्सक्रिप्शन पद्धत रेट्रोवायरस एमकेओएस होती.

आयपीएससी लाइन आयडीउत्परिवर्तनलिंग आणि देणगी एजमूळ प्रकारचा सेल येथे क्लिक करा.सहाय्यक डेटा
HGADFN003 आयपीएस 1B एलएमएनएएक्सन एक्सएनयूएमएक्स,
एक्सएनयूएमएक्स सी> टी
पुरुष 2yr 0mo त्वचेच्या फायब्रोब्लास्ट्स
HGADFN003
एक्सएनयूएमएक्स आयपीएसएक्सएनयूएमएक्सबी
HGADFN003 आयपीएस 1C एलएमएनए एक्सॉन एक्सएनयूएमएक्स,
एक्सएनयूएमएक्स सी> टी
पुरुष 2yr 0mo त्वचेच्या फायब्रोब्लास्ट्स
HGADFN003
एक्सएनयूएमएक्स आयपीएसएक्सएनयूएमएक्ससी
HGDFN003
आयपीएस एक्सएनयूएमएक्सडी
एलएमएनए एक्सॉन एक्सएनयूएमएक्स,
एक्सएनयूएमएक्स सी> टी
पुरुष 2yr 0mo त्वचेच्या फायब्रोब्लास्ट्स
HGADFN003
एक्सएनयूएमएक्स आयपीएसएक्सएनयूएमएक्सडी
HGADFN167 आयपीएस 1J एलएमएनए एक्सॉन एक्सएनयूएमएक्स, एक्सएनयूएमएक्स सी> टीपुरुष 8yr 5moडायर्मल फायब्रोब्लास्ट्स एचजीएडीएफएनएक्सएनयूएमएक्सएक्सएनयूएमएक्स पीएस एक्सएनयूएमएक्सजे
HGADFN167 आयपीएस 1Q एलएमएनए एक्सॉन एक्सएनयूएमएक्स, एक्सएनयूएमएक्स सी> टीपुरुष 8yr 5moडायर्मल फायब्रोब्लास्ट्स एचजीएडीएफएनएक्सएनयूएमएक्स167 iPS1Q
HGMDFN090 आयपीएस एक्सएनयूएमएक्सबी एचजीएडीएफएनएक्सएएनएमएक्सची आई (अप्रभावित)महिला 37yr 10moत्वचेच्या फायब्रोब्लास्ट्स
HGMDFN090
एक्सएनयूएमएक्स आयपीएसएक्सएनयूएमएक्सबी
HGMDFN090 आयपीएस 1C एचजीएडीएफएनएक्सएएनएमएक्सची आई (अप्रभावित)महिला 37yr 10moत्वचेच्या फायब्रोब्लास्ट्स
HGMDFN090
एक्सएनयूएमएक्स आयपीएसएक्सएनयूएमएक्ससी
HGFDFN168 iPS1 D2HGADFN167 चा पिता (अप्रभावित)पुरुष 40yr
5mo
डायर्मल फायब्रोब्लास्ट्स एचजीएफडीएफएनएक्सएनयूएमएक्सएक्सएनयूएमएक्स आयपीएसएक्सएनयूएमएक्स डीएक्सएनयूएमएक्स
HGFDFN168 iPS1PHGADFN167 चा पिता (अप्रभावित)पुरुष 40yr
5mo
त्वचेच्या फायब्रोब्लास्ट्स
HGFDFN168
एक्सएनयूएमएक्स आयपीएसएक्सएनयूएमएक्सपी

एक्सएनयूएमएक्स. भविष्यातील आयपीएससी अद्यतने आणि नवीन सेल लाइनसाठी आमच्या ईमेल सूचीमध्ये सामील व्हा

आम्ही आयपीएससी लाइन तयार करणे सुरू ठेवत आहोत. आपणास पीआरएफ सेल अँड टिश्यू बँकेत आयपीएससीसंबंधी नियमितपणे अद्ययावत माहिती हवी असेल तर कृपया क्लिक करून आमच्या ईमेल लिस्टमध्ये सामील व्हा येथे

7. प्रश्न?

कृपया येथे काही प्रश्न किंवा गरजा घेऊन एमडी, पीएचडी, वैद्यकीय संचालक लेस्ली गॉर्डनशी संपर्क साधा lgordon@progeriaresearch.org किंवा 978-535-2594

IP. आयपीएस सेल लाईन ऑर्डर करणे

एक्सएनयूएमएक्समध्ये, पीआरएफने आमच्या एमटीएमध्ये कोणतेही बदल न करण्याचे धोरण स्थापित केले. एक्सएनयूएमएक्स देशांमधील संस्थांमध्ये कार्यरत असलेल्या एक्सएनयूएमएक्स संशोधन कार्यसंघासह कंत्राटी व्यवस्थेच्या 2014 वर्षांचा हा परिणाम आहे. पीआरएफ आणि त्याच्या सल्ल्याने त्या कालावधीत उद्भवलेल्या मुद्द्यांचा विचार केला आहे आणि त्यानुसार कराराचे संपादन केले आहे, परिणामी आम्हाला उचित आणि वाजवी अटी वाटते.

यूएस फेडरल गव्हर्नमेंट संस्था किंवा प्रश्नांसाठी, कृपया येथे वेंडी नॉरिसशी संपर्क साधा: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

चरण एक्सएनयूएमएक्स: अनुप्रयोग आणि सामग्री हस्तांतरण करार पूर्ण करा

गैर-सरकारी संस्थांसाठी अर्ज आणि करार

गैर-सरकारी संस्थांसाठी साहित्य हस्तांतरण करार

चरण 2: पूर्ण केलेला अर्ज आणि साहित्य हस्तांतरण करार वेंडी नॉरिस येथे परत करा wnorris@lifespan.org. एकदा मंजूर झाल्यानंतर आपल्याला आपल्या ऑर्डरची पुष्टी करणारा ईमेल आणि अपेक्षित शिपिंग तारखेचा ईमेल प्राप्त होईल. 

चरण 3: डॉ. स्टॅनफोर्डची प्रयोगशाळा सध्या गोठविलेल्या क्रायोव्हील्समध्ये ओळींचे वितरण करीत आहे. शिपिंग आणि ट्रॅकिंग माहितीसह जेव्हा संस्कृती पाठविली जाईल तेव्हा त्याची प्रयोगशाळा आपल्याला ईमेल करेल. अनुभवी संशोधकांना मानवी भ्रूण स्टेम सेल / आयपीएससी कार्य करण्यासाठी आवश्यक असलेल्या विशेष अभ्यासक्रमांचे प्रशिक्षण घेण्यासाठी मार्गदर्शन केले जाते.

ओटावा हॉस्पिटल रिसर्च इन्स्टिट्यूटमधील ह्यूमन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल सुविधा (डॉ. स्टॅनफोर्ड दिग्दर्शित) प्रोजेरिया iPSC सेल लाइन्ससाठी विशिष्ट iPSC कल्चर तंत्रांच्या मूलभूत गोष्टींवर व्हर्च्युअल वन-ऑन-वन ​​प्रशिक्षण देते. शास्त्रज्ञांच्या अनुभवाच्या पातळीवर अवलंबून प्रशिक्षण पर्याय आणि स्वरूप लवचिक आहेत.  अधिक माहितीसाठी, कृपया hpscf@ohri.ca वर ईमेल करा.

चरण 4: ओटावा विद्यापीठ आपल्यास प्रत्येक आयपीएससी लाइन अधिक कुरिअर खर्चासाठी थेट आपल्यास कॉल करेल.

9. एचजीपीएस आणि कंट्रोल आयपीएस सेल कल्चर मीडिया तयारी

आयपीएससी आणि ईएससीला स्टेम सेल टेक्नॉलॉजीज (मांजर# 5825) कडून एमटीईएसआर प्लस दिले जाणे आवश्यक आहे. कृपया स्टोरेजसाठी पुरवठादाराच्या शिफारशींचे अनुसरण करा.

10. मॅट्रिजेल प्लेट्स तयार करणे

टीप: मॅट्रिजिलसह सर्व चरण शक्य तितक्या लवकर केले पाहिजे आणि शक्य तितक्या थंड रहावे.

  1. 4 वाजता मॅट्रिजेल बाटली वितळवा°C. प्रथिने एकाग्रता शोधण्यासाठी त्या लॉटवरील विश्लेषणाचे प्रमाणपत्र तपासा.
  2. 12mg/mL ची अंतिम एकाग्रता गाठण्यासाठी वितळलेल्या मॅट्रिजेलमध्ये पुरेसा थंड DMEM/F5 मीडिया जोडा.
  3. प्री-चिल्ड 1mL फाल्कन ट्यूबमध्ये स्टेप 2 वरून तयार मॅट्रिजेलचे 15mL अ‍ॅलिकोट्स बनवा.
  4. सर्व अलिकोट्स -20 वर गोठवा आणि साठवा°C.
  5. मॅट्रिजेल प्लेट्स बनवण्यासाठी, -1 मधून मॅट्रिजेल (20mL) एक अलिकट काढा°C आणि 10mL शीत DMEM/F12 घाला. गोळी वितळत नाही तोपर्यंत चांगले मिसळा (फुगे तयार न करता, आणि द्रावण नेहमी थंड ठेवा).
  6. 50mL ट्यूबमध्ये हस्तांतरित करा, नंतर 20mL थंड DMEM/F12 घाला (1mL matrigel aliquot 30mL DMEM/F12 मध्ये पातळ केले जाते), चांगले मिसळा.
  7. प्लेट (1 वेल प्लेटसाठी 6mL/वेल, 0.5 वेल प्लेटसाठी 12mL/वेल, 0.25 वेल प्लेटसाठी 24mL/वेल). प्लेट हलक्या हाताने हलवून द्रावणाने संपूर्ण पृष्ठभाग झाकले आहे याची खात्री करा. उरलेले कोणतेही मॅट्रिजेल पुन्हा गोठवू नका.
  8. ताबडतोब प्लेट वापरत असल्यास, प्लेटला खोलीच्या तपमानावर 1 तास (किंवा 30 वाजता 37 मिनिटे) बसू द्या°सी), सूक्ष्मदर्शकाखाली मॅट्रिजेलचे निरीक्षण करा. मॅट्रिजेल चांगले विखुरलेले असावे आणि "गुळगुळीत" नसावे.
  9. प्लेट्स दुसर्‍या वेळी वापरत असल्यास, प्लेटच्या काठाला पॅराफिल्मने गुंडाळा आणि 4 वाजता ठेवा°सी 2 आठवड्यांपर्यंत.

मॅट्रिजेल - बीडी / फिशर, मांजर # सीबी-एक्सएनयूएमएक्स

डीएमईएम / एफएक्सएनयूएमएक्स - लाइफ टेक्नोलॉजीज, मांजर # एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स

विल्यम स्टॅनफोर्ड-एक्सएनयूएमएक्स डॉ

11. पिघलना ईएस किंवा आयपीएस सेल (प्रति क्रायो-वायल)

  1. 4°C मधून मॅट्रिजेल प्लेट घ्या आणि खोलीच्या तपमानावर एका तासासाठी गरम करा किंवा ताजी मॅट्रिजेल प्लेट बनवा (मॅट्रिजेल प्लेट प्रोटोकॉल तयार करणे पहा).
  2. 4mL फाल्कन ट्यूबमध्ये mTeSR Plus चे 15mL उबदार.
  3. द्रव नायट्रोजन टाकीमधून पेशी काढून टाका आणि बर्फाचा एक छोटा तुकडा शिल्लक होईपर्यंत 37 डिग्री सेल्सिअस बाथमध्ये फिरवा. कुपी 1-2 मिनिटांत वितळली पाहिजे. हे पाऊल त्वरीत केले पाहिजे.
  4. इथॅनॉल सेल ट्यूब आणि फाल्कन मीडिया ट्यूब आणि हूडमध्ये स्थान.
  5. 1 मिली वापरा रुंद तोंडाची टीप हळूहळू प्री-वॉर्म्ड मीडियाच्या 4mL मध्ये सेल जोडा (सेल सस्पेंशन मिक्स करणे टाळा).
  6. 130 rcf वर 5 मिनिटे फिरवा.
  7. सुपरनॅटंट काढा.
  8. 2mL PSC मीडिया आणि रुंद तोंडाच्या टोकासह जोडा हळुवारपणे गुठळ्या फोडा. 6 वेल प्लेटच्या एका विहिरीमध्ये मीडिया हस्तांतरित करा 2uL ROCK इनहिबिटर (Y27632, अंतिम एकाग्रता 10uM) घाला. एका मॅट्रिजेल लेपित विहिरीत (6 विहीर प्लेटचे).
  9. पेशींना समान रीतीने वितरीत करण्यासाठी पेशी हलक्या हाताने रॉक करा आणि हायपोक्सिक इनक्यूबेटरमध्ये ठेवा (5%O2, 10% सीओ2). पेरणीनंतर २४ तास प्लेट डिस्टर्बन्स टाळा.

    सुचना: गठ्ठा जास्त तुटणे किंवा आक्रमक पाइपटिंग टाळणे फार महत्वाचे आहे. हे जगण्याचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या कमी करू शकते. पेरणीच्या वेळी पेशी 100-300 पेशींच्या मोठ्या तुकड्यांमध्ये राहाव्यात. कोमल असताना, पेशी वितळल्या की क्रायोप्रोटेक्टंटच्या संपर्कात येण्याचा वेळ कमी करण्यासाठी त्वरीत काम करण्याचा प्रयत्न करा.

  10. 24 तासांनंतर मीडिया काढून टाका आणि 2mL PSC मीडिया घाला (6 विहिरीसाठी, 1mL 12 विहिरीसाठी आणि 0.5 वेल प्लेटसाठी 24mL). hESC/iPSC प्रोटोकॉलची कापणी आणि काळजी पहा.

    पीएससी मीडिया

    स्टेम सेल टेक्नॉलॉजीजकडून mTeSR प्लस (मांजर# 5825). कृपया स्टोरेजसाठी पुरवठादाराच्या शिफारशींचे अनुसरण करा.

    रॉक इनहिबिटर Y27632 म्हणजे काय?

    ROCK इनहिबिटर Y27632 हा Rho संबंधित किनेज p160 ROCK चा निवडक इनहिबिटर आहे. ROCK इनहिबिटर Y27632 सह उपचार मानवी भ्रूण स्टेम सेल (hESC) आणि मानवी प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल्स (iPSC) च्या पृथक्करण प्रेरित ऍपोप्टोसिसला प्रतिबंधित करते, जगण्याची दर वाढवते आणि hESCs आणि hiPSCs च्या उपशेती आणि वितळताना प्लुरिपोटेंसी राखते. ROCK इनहिबिटर Y27632 देखील क्रायोप्रिझर्वेशन दरम्यान स्टेम पेशींच्या जगण्याची दर वाढवते असे दिसून आले आहे. लक्षात घ्या की रॉक इनहिबिटर अॅलिकोट्स प्रकाश आणि पुनरावृत्ती फ्रीझ थॉ सायकल्ससाठी संवेदनशील असतात. पुरवठादाराच्या शिफारस केलेल्या शेल्फ लाइफमध्ये हे अलिकोट्स वापरण्याची खात्री करा.

    विल्यम स्टॅनफोर्ड-एक्सएनयूएमएक्स डॉ

    12. hESC/ iPSC साठी कापणी आणि काळजी घेणे

    1. पेशी वितळल्यानंतर दुसर्‍या दिवशी जगण्याचा दर निश्चित करण्यासाठी सूक्ष्मदर्शकाखाली त्या पहा. टीप: मोठ्या संख्येने अटॅच नसलेल्या पेशींचे निरीक्षण करणे सामान्य आहे. जोपर्यंत काही पेशी संलग्न आहेत, तोपर्यंत 3-7 दिवसांत त्यांच्यापासून वसाहती निर्माण होऊ शकतात.
    2. विहिरीतून माध्यम काढून टाका आणि प्रति विहिरीत 2 मिली (6 विहिरीसाठी, 1 विहिरीसाठी 12 मिली आणि 0.5 विहिरींच्या प्लेटसाठी 24 मिली) ताजे आणि उबदार PSC मीडिया पिपेट करा. इनक्यूबेटरवर प्लेट परत करा.
    3. पेशींना 60-70% संगम होईपर्यंत पुरवले जाते (पुरवठादाराच्या शिफारशींचे पालन करा).
    4. दिवस 2 पर्यंत, पेशी वाढल्या जाऊ शकणाऱ्या कोणत्याही भिन्न पेशींचे निरीक्षण आणि स्वच्छ केले पाहिजे.
    5. पेशी साफ करण्यासाठी, पिकिंग हूड वापरा आणि विंदुकाच्या टोकाने भिन्न पेशी काढून टाका.
    6. एकदा सेल साफ झाल्यानंतर, वरील चरणांप्रमाणे माध्यम बदला.

    (HESC/iPSC फ्रीझ करणे किंवा hESC/iPSC उत्तीर्ण करणे पहा)

    सुचना:

    पीएससी मीडिया हायपोक्सिक वातावरणात अधिक कार्यक्षम असल्याचे ठरवले होते. आम्ही हे देखील पाहिले आहे की जेव्हा पेशी हायपोक्सिक इनक्यूबेटर विरुद्ध नॉर्मोक्सिकमध्ये वाढतात तेव्हा कमी फरक होतो. शेवटी, हायपोक्सिक इनक्यूबेटर वापरताना बीजित पेशींचा जगण्याचा दर चांगला असतो.

    नॉर्मोक्सिक: 37°सी, 21% ओ2, 5% सीओ2

    हायपोक्सिक: 37°C, 5%O2, 10% सीओ2

    विल्यम स्टॅनफोर्ड-एक्सएनयूएमएक्स डॉ

    13. hESC/iPSC उत्तीर्ण

    1. 2 वेल मॅट्रिजेल लेपित प्लेटमध्ये 6mL PSC मीडिया घाला आणि बाजूला ठेवा.
    2. जाण्यासाठी प्लेट घ्या आणि विहिरीतून मीडिया काढा आणि एकदा 1mL PBS(-/-) ने धुवा.
    3. विहिरीत 1mL EDTA द्रावण घाला आणि खोलीच्या तपमानावर 3-4 मिनिटे सोडा. प्लेट इकडे तिकडे हलवू नका कारण पेशी विलग होऊ शकतात.
    4. EDTA सोल्यूशन काढा आणि 1mL PSC मीडिया जोडा. EDTA पेशींवर 4 मिनिटांपेक्षा जास्त ठेवू नका कारण यामुळे पेशी बंद होतील.
    5. सेल स्क्रॅपर वापरून सेल स्क्रॅप करा आणि PSC मीडिया असलेल्या तुमच्या प्लेटच्या 6 विहिरींमध्ये सेल विभाजित करा. कॉलनीचे तुकडे जास्त प्रमाणात तोडणे टाळा आणि स्क्रॅपिंगसह सौम्य होण्याचा प्रयत्न करा. पेशी मोठ्या भागांमध्ये ठेवण्याचा प्रयत्न करा. गरज असल्यास गुठळ्या फोडण्यासाठी रुंद तोंडाच्या पिपेट टीपचा वापर करा. पेशींचे अत्याधिक तुकडे झाल्यामुळे पेशींचा मृत्यू होऊ शकतो किंवा उत्तीर्ण झाल्यानंतर जास्त उत्स्फूर्त फरक होऊ शकतो.
    6. 37 वाजता उष्मायन करा°C प्रत्येक विहिरीमध्ये समान रीतीने पेशी वितरीत केल्यानंतर (8 आकृती किंवा एल आकार हलणे). पासिंगनंतर २४ तास प्लेट डिस्टर्बन्स टाळा.

    सुचना: एकदा सेल्स स्क्रॅप केल्यावर तुम्हाला ते शक्य तितक्या लवकर नवीन प्लेटमध्ये हस्तांतरित करायचे आहेत कारण पेशी त्वरीत पुन्हा जोडल्या जातील (5 मिनिटांच्या आत).

    EDTA पेशींवर 4 मिनिटांपेक्षा जास्त ठेवल्यास, पेशी विलग होऊ शकतात. असे झाल्यास, 15mL PSC मीडियासह 4mL फाल्कनमधील पेशी गोळा करा. 130 मिनिटांसाठी 5 rcf वर पेशी फिरवा. गोळ्याला 1mL मीडियासह पुन्हा जोडा आणि 6 वेल मॅट्रिजेल लेपित प्लेट (160uL प्रति विहीर) मध्ये समान रीतीने विभाजित करा.

    EDTA सोल्यूशन: DPBS (-/-) च्या 500mL मध्ये 0.5M EDTA (pH 8.0) चे 500uL जोडा. ०.९ ग्रॅम NaCl घाला. निर्जंतुकीकरणासाठी द्रावण फिल्टर करा आणि 0.9 महिन्यांपर्यंत 4°C वर साठवा.

    पेपर कडून:

    रासायनिकरित्या परिभाषित संस्कृतीच्या परिस्थितीत एंजाइम-मुक्त पृथक्करण करून मानवी प्लुरिपोटेंट स्टेम पेशींचे पासिंग आणि कॉलनी विस्तार

    जिनेट बीयर्स,1 डॅनियल आर. गुलब्रसन,2,3 निकोल जॉर्ज,4लॉरेन आय,1 जेफ्री जोन्स,4,5 जेम्स ए थॉमसन,2,3,6 आणि गुओकाय चेन1,2

    14. फ्रीजिंग hESC/iPSC

    1. बायो-कूल (नियंत्रित रेट फ्रीझर) चालू करा आणि तापमान -7°C पर्यंत समायोजित करा.
    2. इनक्यूबेटरमधून पेशी काढा आणि सूक्ष्मदर्शकाखाली संगम आणि आकारविज्ञान पहा.
    3. विहिरी ७०% संगम असल्यास, जुने माध्यम काढून टाका आणि एकदा PBS(-/-) ने धुवा, त्यानंतर प्रति विहिरीमध्ये 70 mL EDTA द्रावण (EDTA सोल्यूशनसह पासिंग पहा) घाला.
    4. 3-4 मिनिटांसाठी तपमानावर खोली घाला.
    5. EDTA सोल्यूशनला एस्पिरेट करा आणि 1 mL कोल्ड mFreSR मीडिया (cat#05855, Stem Cell Technologies) घाला.
    6. पेशी हळूवारपणे उचलण्यासाठी सेल स्क्रॅपर वापरा. पेशी शक्य तितक्या मोठ्या भागांमध्ये ठेवा आणि वर आणि खाली पाइपिंग टाळा.
    7. रुंद तोंडाच्या टोकाचा वापर करून पेशी/mFreSR क्रायट्यूबमध्ये स्थानांतरित करा. चरण 8 साठी तयार होईपर्यंत कुपी बर्फावर ठेवा.
    8. नळ्या बायो-कूलमध्ये ठेवा आणि 10 मिनिटे उबवा.
    9. द्रव नायट्रोजन मिळवा.
    10. 10 मिनिटांनंतर, द्रव नायट्रोजनमध्ये स्पॅटुला बुडवून आणि सुमारे 10-30 सेकंदांपर्यंत किंवा क्रायो-व्हियलच्या बाजूला क्रिस्टल फॉर्म दिसेपर्यंत क्रायो-व्हियलच्या बाजूला स्पर्श करून पेशींना बीज द्या.
    11. “PROG” बटण दाबून प्रोग्राम 1 सुरू करा आणि पुन्हा बटण दाबून प्रोग्राममधून जा आणि तुम्हाला 0.5°C/min चा दर दिसला पाहिजे. , नंतर "RUN" दाबा.
    12. एकदा तापमान -65°C पर्यंत पोहोचल्यानंतर क्रायो-ट्यूब द्रव नायट्रोजनमध्ये हस्तांतरित आणि संग्रहित केल्या जाऊ शकतात.

    विकल्पे

    दुसरा पर्याय म्हणजे क्रायो-ट्यूब फ्रीझिंग कंटेनरमध्ये (बायोसिजन-कूलसेल) ठेवणे आणि रात्रभर -80°C वर साठवणे. पुढील दिवशी क्रायो-ट्यूब द्रव नायट्रोजन (द्रव किंवा बाष्प अवस्था) मध्ये हलवा.

    विल्यम स्टॅनफोर्ड-एक्सएनयूएमएक्स डॉ