प्रेरित Pluripotent
स्टेम सेल
प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन सेल आणि टिश्यू बँक
मानवी प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (iPSC)
- प्रोजेरिया iPSCs गैर-शास्त्रज्ञांसाठी पार्श्वभूमी माहिती
- चा उद्देश प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशनद्वारे प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल निर्मिती आणि वितरण
- हचिन्सन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम प्रेरित-प्लुरिपोटेंट स्टेम सेलची निर्मिती (iPSCs)
- गुणवत्ता नियंत्रण: प्रमाणीकरण आणि वैशिष्ट्यीकरण
- मूळ प्रारंभिक सामग्री ज्यातून iPSCs प्राप्त केले गेले
- भविष्यातील iPSC अपडेट्स आणि नवीन सेल लाइन्ससाठी आमच्या ईमेल सूचीमध्ये सामील व्हा
- प्रश्न? आमच्याशी संपर्क साधा.
- iPSC लाईन्स ऑर्डर करत आहे
- HGPS आणि नियंत्रण iPSC कल्चर मीडिया तयारी
- मॅट्रिजेल प्लेट्स तयार करणे
- hESCs आणि iPSCs पेशी वितळणे (प्रति क्रायो-वायल)
- hESC/iPSC साठी कापणी आणि काळजी घेणे
- पासिंग hESC/iPSC
- फ्रीजिंग hESC/iPSC
1. गैर-शास्त्रज्ञांसाठी iPSC पार्श्वभूमी माहिती
स्टेम पेशी या "अपरिपक्व" पेशी आहेत ज्यांनी अद्याप कोणत्याही एका पेशी प्रकार बनण्यासाठी वचनबद्ध केलेले नाही. ते लवचिक असतात कारण त्यांच्याकडे शरीरातील अनेक प्रकारच्या परिपक्व पेशींमध्ये विकसित होण्याची क्षमता असते, जसे की हृदय किंवा रक्तवाहिन्या बनवणाऱ्या पेशी आणि इतर ऊती आणि अवयव. 2007 मध्ये, संशोधकांनी प्रयोगशाळेत स्टेम सेल्स तयार करण्याचे धोरण शोधून काढले ज्या प्रौढ पेशींचे पुनर्प्रोग्रामिंग करून आम्ही सामान्यतः संशोधनाच्या उद्देशाने वाढतो.1, 2 . या कृत्रिमरीत्या तयार केलेल्या स्टेम पेशींना इंड्युस्ड प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (“iPSCs”) म्हणतात. प्रोजेरियाच्या क्षेत्रासाठी, ही एक मोठी प्रगती आहे. प्रथमच, शास्त्रज्ञ आता प्रोजेरिया स्टेम पेशी बनवू शकतात आणि प्रोजेरियामध्ये स्टेम पेशी कशा कार्य करतात आणि विकसित होतात याबद्दल प्रश्न विचारू शकतात. पूर्वी मानवी प्रोजेरिया स्टेम पेशींचा कोणताही स्रोत नव्हता आणि म्हणून प्रोजेरिया नसलेल्या लोकांच्या स्टेम पेशींच्या तुलनेत प्रोजेरिया स्टेम पेशी कशा कार्य करतात याबद्दल माहितीची शून्यता होती. याशिवाय, शास्त्रज्ञ प्रोजेरिया स्टेम सेल्स तयार करण्यासाठी पुन्हा प्रोग्राम करू शकतात, प्रथमच, प्रौढ प्रोजेरिया रक्तवाहिन्या, हृदयाच्या पेशी आणि इतर पेशींचे प्रकार. आतापर्यंत, मानवी प्रोजेरिया हृदय किंवा रक्तवाहिन्यांच्या पेशींचा स्रोत नव्हता. आम्ही आता की विचारू शकतो प्रोजेरियामध्ये हृदयविकाराचा झटका आणि स्ट्रोकमुळे लवकर मृत्यू होतो अशा हृदयविकाराबद्दलचे प्रश्न. आम्ही या शोधांची सामान्य लोकसंख्येतील हृदयरोग आणि वृद्धत्वाशी तुलना करू शकतो आणि आपल्या सर्वांमध्ये वृद्धत्वाचा काय प्रभाव पडतो याबद्दल अधिक जाणून घेऊ शकतो. प्रोजेरिया स्टेम सेल्स वापरून अनेक उत्कृष्ट अभ्यास प्रकाशित झाले आहेत.3-5 प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन मधील आमचे ध्येय हे अमूल्य साधन वापरून आणखी अनेक शोध सुलभ करणे आहे. स्टेम पेशींवर प्राइमरसाठी, कृपया ही यूएस सरकारची वेबसाइट पहा: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm
-
- ताकाहाशी K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. परिभाषित घटकांद्वारे प्रौढ मानवी फायब्रोब्लास्ट्समधून प्लुरिपोटेंट स्टेम पेशींचा समावेश. सेल. 2007;131:861-872.
- Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. मानवी सोमॅटिक पेशींपासून प्राप्त प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाईन्स. विज्ञान. 2007;318:1917-1920.
- Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3रा, Izpisua Belmonte JC. हचिन्सन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम मधील iPSCs सह अकाली वृद्धत्वाची पुनरावृत्ती. निसर्ग. 2011;472:221-225.
- Misteli T. HGPS-व्युत्पन्न वयोगटासाठी iPSCs. सेल स्टेम सेल. 2011;8:4-6.
2. प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशनद्वारे प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (iPSC) निर्मिती आणि वितरणाचा उद्देश
प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशनचे ध्येय हचिन्सन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम आणि त्याच्या वृद्धत्वाशी संबंधित विकारांवर उपचार आणि उपचार शोधणे आहे. 2009 मध्ये, PRF ने उच्च दर्जाचे प्रोजेरिया iPSCs व्युत्पन्न करण्यासाठी विल्यम स्टॅनफोर्ड, पीएचडी यांच्या मार्गदर्शनाखाली कॅनडाच्या टोरंटो विद्यापीठातील शास्त्रज्ञांच्या तज्ञ टीमसोबत सहयोग केला. डॉ. स्टॅनफोर्ड हे इंटिग्रेटिव्ह स्टेम सेल बायोलॉजीमधील कॅनडा रिसर्च चेअर आहेत. 2011 पर्यंत, PRF ने कॅनडाच्या ओटावा विद्यापीठात डॉ. स्टॅनफोर्ड यांच्याशी सहयोग करणे सुरू ठेवले आहे जेथे ते सेल्युलर आणि आण्विक औषधांचे प्राध्यापक आहेत, मेडिसीन फॅकल्टी आणि ओटावा हॉस्पिटल रिसर्च इन्स्टिट्यूटच्या स्प्रॉट सेंटर फॉर स्टेम सेल रिसर्चचे वरिष्ठ शास्त्रज्ञ आहेत.
जगभरातील संशोधकांना हे अमूल्य साधन प्रदान करणे हे आमचे ध्येय आहे. या नवीन संशोधन साधनाचा उपयोग प्रोजेरियामध्ये नवीन आणि नाविन्यपूर्ण संशोधन तसेच हृदयरोग आणि वृद्धत्वाशी संबंध निर्माण करण्यासाठी केला जाईल.
3. हचिन्सन-गिलफोर्ड प्रोजेरिया सिंड्रोम प्रेरित-प्लुरिपोटेंट स्टेम सेलची निर्मिती (iPSCs)
Induced-Pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) चार मानवी घटक, Oct4, Sox2, Klf4, आणि c-Myc च्या फायब्रोब्लास्ट्समध्ये VSVG-स्यूडोटाइप्ड रेट्रोव्हायरल ट्रान्सडक्शन वापरून व्युत्पन्न केले गेले. iPSC वसाहती माऊस-भ्रूण फायब्रोब्लास्ट्स (MEFs) वर प्राप्त केल्या होत्या. वापरलेली प्रक्रिया मूलत: पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे होती परंतु EOS रिपोर्टरचा वापर न करता (नेचर प्रोटोकॉल 4: 1828-1844, 2009).
4. गुणवत्ता नियंत्रण: प्रमाणीकरण आणि वैशिष्ट्यीकरण
सध्या उपलब्ध असलेल्या ओळी अनेक प्रमाणीकरण पायऱ्या पार केल्या आहेत (खाली डाउनलोड करण्यायोग्य PDF पहा):
-
- प्रत्येक ओळीसाठी मायकोप्लाझ्मा चाचणी: डॉ. स्टॅनफोर्डच्या प्रयोगशाळेने प्रत्येक पेशी ओळीसाठी पीसीआरद्वारे मायकोप्लाझ्मा विश्लेषण केले आहे. याव्यतिरिक्त, विस्तारानंतर आणि सेल पाठवण्याआधी, मायकोप्लाझ्मासाठी रेषा पुन्हा तपासल्या जातील.
- प्लुरिपोटेंसी मार्कर Tra-1-60, Tra-1-81 आणि SSEA4 साठी इम्युनोस्टेनिंग.
- प्लुरिपोटेंसीचे सूचक म्हणून अल्कलाइन फॉस्फेटचे डाग
- तीन जंतू-स्तरांच्या मार्करसाठी भ्रूण शरीराची निर्मिती आणि त्यानंतरचे इम्युनोस्टेनिंग. βIII-ट्यूब्युलिन (एक्टोडर्म), स्मूथ-मसल ऍक्टिन (मेसोडर्म), आणि गॅटा 4 किंवा एएफपी (एंडोडर्म) हे मार्कर तपासले गेले.
- कॅरिओटाइप विश्लेषण.
- विभेदित पेशींमध्ये लॅमिन ए ची पुन: अभिव्यक्ती
- टेराटोमा असेस
प्रक्रियेत अतिरिक्त प्रमाणीकरण:
समर्थन डेटामध्ये दर्शविल्याप्रमाणे काही ओळींनी टेराटोमा ॲसेस पूर्ण केले आहेत. इतर सर्व ओळींसाठी, टेराटोमा ॲसेज प्रक्रियेत आहेत आणि हे ॲसे पूर्ण झाल्यावर स्थिती अपडेट केली जाईल.
5. मूळ प्रारंभिक सामग्री जिथून या iPS पेशी प्राप्त केल्या गेल्या
iPSCs PRF सेल आणि टिश्यू बँक नॉन-ट्रान्सफॉर्म्ड फायब्रोब्लास्ट सेल लाइन्समधून प्राप्त केले गेले.
सर्व iPS लाईन्ससाठी वापरलेली ट्रान्सडक्शन पद्धत रेट्रोव्हायरस MKOS होती.
iPSC लाइन आयडी | उत्परिवर्तन | लिंग आणि देणगी वय | मूळ सेल प्रकार येथे क्लिक करा. | सपोर्टिंग डेटा |
---|---|---|---|---|
HGADFN003 iPS 1B | LMNAExon 11, 1824 C>T | पुरुष 2 वर्ष 0 महिना | डर्मल फायब्रोब्लास्ट्स HGADFN003 | 003 iPS1B |
HGADFN003 iPS 1C | LMNA Exon 11, 1824 C>T | पुरुष 2 वर्ष 0 महिना | डर्मल फायब्रोब्लास्ट्स HGADFN003 | 003 iPS1C |
HGDFN003 iPS 1D | LMNA Exon 11, 1824 C>T | पुरुष 2 वर्ष 0 महिना | डर्मल फायब्रोब्लास्ट्स HGADFN003 | 003 iPS1D |
HGADFN167 iPS 1J | LMNA एक्सॉन 11, 1824 C>T | पुरुष 8 वर्षे 5 महिने | डर्मल फायब्रोब्लास्ट HGADFN167 | 167 PS 1J |
HGADFN167 iPS 1Q | LMNA एक्सॉन 11, 1824 C>T | पुरुष 8 वर्षे 5 महिने | डर्मल फायब्रोब्लास्ट HGADFN167 | 167 iPS1Q |
HGMDFN090 iPS 1B | HGADFN167 ची आई (अप्रभावित) | महिला 37 वर्षे 10 महिने | डर्मल फायब्रोब्लास्ट्स HGMDFN090 | 090 iPS1B |
HGMDFN090 iPS 1C | HGADFN167 ची आई (अप्रभावित) | महिला 37 वर्षे 10 महिने | डर्मल फायब्रोब्लास्ट्स HGMDFN090 | 090 iPS1C |
HGFDFN168 iPS1 D2 | HGADFN167 चे वडील (अप्रभावित) | पुरुष 40 वर्षे ५ महिने | डर्मल फायब्रोब्लास्ट्स HGFDFN168 | 168 iPS1 D2 |
HGFDFN168 iPS1P | HGADFN167 चे वडील (अप्रभावित) | पुरुष 40 वर्षे ५ महिने | डर्मल फायब्रोब्लास्ट्स HGFDFN168 | 168 iPS1P |
6. भविष्यातील iPSC अपडेट्स आणि नवीन सेल लाइन्ससाठी आमच्या ईमेल सूचीमध्ये सामील व्हा
आम्ही iPSC लाईन्स तयार करणे सुरू ठेवत आहोत. जर तुम्हाला PRF सेल आणि टिश्यू बँकेत आयोजित iPSCs वर नियमित अपडेट्स हवे असतील, तर कृपया क्लिक करून आमच्या ईमेलिंग सूचीमध्ये सामील व्हा. येथे
7. प्रश्न?
कृपया लेस्ली गॉर्डन, एमडी, पीएचडी, वैद्यकीय संचालक, कोणतेही प्रश्न किंवा गरज असल्यास, येथे संपर्क साधा lgordon@progeriaresearch.org किंवा ९७८-५३५-२५९४
8. iPS सेल लाईन्स ऑर्डर करणे
2014 मध्ये, PRF ने आमच्या MTA मध्ये कोणतेही बदल न करण्याचे धोरण स्थापित केले. 14 देशांतील संस्थांमध्ये काम करणाऱ्या 70 संशोधन संघांसोबत 12 वर्षांच्या कराराच्या व्यवस्थेचा हा परिणाम आहे. PRF आणि त्याच्या वकिलांनी त्या कालावधीत उद्भवलेल्या समस्या विचारात घेतल्या आहेत आणि त्यानुसार करार संपादित केला आहे, परिणामी आम्हाला जे वाटते ते योग्य आणि वाजवी अटी आहेत.
यूएस फेडरल सरकारी संस्था किंवा प्रश्नांसाठी, कृपया येथे वेंडी नॉरिसशी संपर्क साधा: wnorris@brownhealth.org किंवा 401
पायरी 1: अर्ज आणि साहित्य हस्तांतरण करार पूर्ण करा
गैर-सरकारी संस्थांसाठी अर्ज आणि करार
गैर-सरकारी संस्थांसाठी साहित्य हस्तांतरण करार
पायरी २: पूर्ण केलेला अर्ज आणि साहित्य हस्तांतरण करार वेंडी नॉरिस येथे परत करा wnorris@brownhealth.org. एकदा मंजूर झाल्यानंतर, तुम्हाला तुमच्या ऑर्डरची आणि अपेक्षित शिपिंग तारखेची पुष्टी करणारा ईमेल प्राप्त होईल.
पायरी 3: डॉ. स्टॅनफोर्डची प्रयोगशाळा सध्या फ्रोझन क्रायोव्हियलमध्ये ओळींचे वितरण करत आहे. जेव्हा संस्कृती पाठवली जाईल तेव्हा त्याची प्रयोगशाळा तुम्हाला शिपिंग आणि ट्रॅकिंग माहितीसह ईमेल करेल. अननुभवी संशोधकांना मानवी भ्रूण स्टेम सेल/iPSCs कार्यासाठी आवश्यक असलेल्या विशेष अभ्यासक्रमांचे प्रशिक्षण घेण्याचे निर्देश दिले जातात.
ओटावा हॉस्पिटल रिसर्च इन्स्टिट्यूटमधील ह्यूमन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल सुविधा (डॉ. स्टॅनफोर्ड दिग्दर्शित) प्रोजेरिया iPSC सेल लाइन्ससाठी विशिष्ट iPSC कल्चर तंत्रांच्या मूलभूत गोष्टींवर व्हर्च्युअल वन-ऑन-वन प्रशिक्षण देते. शास्त्रज्ञांच्या अनुभवाच्या पातळीवर अवलंबून प्रशिक्षण पर्याय आणि स्वरूप लवचिक आहेत. अधिक माहितीसाठी, कृपया hpscf@ohri.ca वर ईमेल करा.
पायरी 4: ओटावा युनिव्हर्सिटी तुम्हाला प्रत्येक iPSC लाईन आणि कुरिअर खर्चासाठी, जर असेल तर थेट इनव्हॉइस करेल.
9. HGPS आणि नियंत्रण iPS सेल कल्चर मीडिया तयारी
iPSC आणि ESC ला स्टेम सेल टेक्नॉलॉजीज (cat# 5825) कडून mTeSR प्लस दिले जाणे आवश्यक आहे. कृपया स्टोरेजसाठी पुरवठादाराच्या शिफारशींचे अनुसरण करा.
10. Matrigel प्लेट्स तयार करणे
नोंद: मॅट्रिजेलचा समावेश असलेले सर्व चरण शक्य तितक्या लवकर पूर्ण केले पाहिजेत आणि शक्य तितक्या थंड राहावे.
- 4 वाजता मॅट्रिजेल बाटली वितळवा°C. प्रथिने एकाग्रता शोधण्यासाठी त्या लॉटवरील विश्लेषणाचे प्रमाणपत्र तपासा.
- 5mg/mL च्या अंतिम एकाग्रतेपर्यंत पोहोचण्यासाठी वितळलेल्या मॅट्रिजेलमध्ये पुरेसा थंड DMEM/F12 मीडिया जोडा.
- प्री-चिल्ड 15mL फाल्कन ट्यूबमध्ये स्टेप 2 वरून तयार मॅट्रिजेलचे 1mL ॲलिकोट्स बनवा.
- सर्व अलिकोट्स -20 वर गोठवा आणि साठवा°सी.
- मॅट्रिजेल प्लेट्स बनवण्यासाठी, -20 मधून मॅट्रिजेल (1mL) एक अलिकट काढा°C आणि 10mL शीत DMEM/F12 घाला. गोळी वितळत नाही तोपर्यंत चांगले मिसळा (फुगे तयार न करता, आणि द्रावण नेहमी थंड ठेवा).
- 50mL ट्यूबमध्ये स्थानांतरित करा, नंतर 20mL शीत DMEM/F12 घाला (1mL matrigel aliquot 30mL DMEM/F12 मध्ये पातळ केले जाते), चांगले मिसळा.
- प्लेट (6 वेल प्लेटसाठी 1mL/वेल, 12 वेल प्लेटसाठी 0.5mL/वेल, 24 वेल प्लेटसाठी 0.25mL/वेल). प्लेट हलक्या हाताने हलवून द्रावणाने संपूर्ण पृष्ठभाग झाकले आहे याची खात्री करा. उरलेले कोणतेही मॅट्रिजेल पुन्हा गोठवू नका.
- ताबडतोब प्लेट वापरत असल्यास, प्लेटला खोलीच्या तपमानावर 1 तास (किंवा 37 वाजता 30 मिनिटे) बसू द्या°सी), सूक्ष्मदर्शकाखाली मॅट्रिजेलचे निरीक्षण करा. मॅट्रिजेल चांगले विखुरलेले असले पाहिजे आणि "गोंधळ" नसावे.
- प्लेट्स दुसऱ्या वेळी वापरत असल्यास, प्लेटच्या काठाला पॅराफिल्मने गुंडाळा आणि 4 वर ठेवा°सी 2 आठवड्यांपर्यंत.
Matrigel - BD/फिशर, cat#CB-40230
DMEM/F12 – लाइफ टेक्नॉलॉजीज, cat#11330-057
डॉ. विल्यम स्टॅनफोर्ड-2022
11. ES किंवा iPS पेशी वितळणे (प्रति क्रायो-वायल)
- 4°C मधून मॅट्रिजेल प्लेट घ्या आणि खोलीच्या तपमानावर एका तासासाठी गरम करा किंवा ताजी मॅट्रिजेल प्लेट बनवा (मॅट्रिजेल प्लेट प्रोटोकॉल तयार करणे पहा).
- 15mL फाल्कन ट्यूबमध्ये mTeSR Plus चे 4mL उबदार.
- द्रव नायट्रोजन टाकीमधून पेशी काढून टाका आणि बर्फाचा एक छोटा तुकडा शिल्लक होईपर्यंत 37 डिग्री सेल्सिअस बाथमध्ये फिरवा. कुपी 1-2 मिनिटांत वितळली पाहिजे. हे पाऊल त्वरीत केले पाहिजे.
- इथेनॉल सेल ट्यूब आणि फाल्कन मीडिया ट्यूब आणि हुडमध्ये ठेवा.
- 1 मिली वापरा हळूहळू रुंद तोंडाची टीप प्री-वॉर्म्ड मीडियाच्या 4mL मध्ये सेल जोडा (सेल सस्पेंशन मिक्स करणे टाळा).
- 130 rcf वर 5 मिनिटे फिरवा.
- सुपरनॅटंट काढा.
- 2mL PSC मीडिया आणि रुंद तोंडाच्या टोकासह जोडा हळुवारपणे गुठळ्या फोडा. 6 वेल प्लेटच्या एका विहिरीमध्ये मीडिया हस्तांतरित करा 2uL ROCK इनहिबिटर (Y27632, अंतिम एकाग्रता 10uM) घाला. एका मॅट्रिजेल लेपित विहिरीत (6 विहीर प्लेटचे).
- पेशींना समान रीतीने वितरीत करण्यासाठी पेशी हलक्या हाताने रॉक करा आणि हायपोक्सिक इनक्यूबेटरमध्ये ठेवा (5%O2, 10% CO2). पेरणीनंतर २४ तास प्लेट डिस्टर्बन्स टाळा.
टीप: गठ्ठा जास्त तुटणे किंवा आक्रमक पाइपटिंग टाळणे फार महत्वाचे आहे. हे जगण्याचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या कमी करू शकते. पेरणीच्या वेळी पेशी 100-300 पेशींच्या मोठ्या तुकड्यांमध्ये राहाव्यात. कोमल असताना, पेशी वितळल्या की क्रायोप्रोटेक्टंटच्या संपर्कात येण्याचा वेळ कमी करण्यासाठी त्वरीत काम करण्याचा प्रयत्न करा.
- 24 तासांनंतर मीडिया काढून टाका आणि 2mL PSC मीडिया घाला (6 विहिरीसाठी, 1mL 12 विहिरीसाठी आणि 24 वेल प्लेटसाठी 0.5mL). hESC/iPSC प्रोटोकॉलची कापणी आणि काळजी पहा.
PSC मीडिया
स्टेम सेल तंत्रज्ञान (cat# 5825) कडून mTeSR प्लस. कृपया स्टोरेजसाठी पुरवठादाराच्या शिफारशींचे अनुसरण करा.
रॉक इनहिबिटर Y27632 म्हणजे काय?
ROCK इनहिबिटर Y27632 हा Rho संबंधित किनेज p160 ROCK चा निवडक इनहिबिटर आहे. ROCK इनहिबिटर Y27632 सह उपचार मानवी भ्रूण स्टेम सेल (hESC) आणि मानवी प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (iPSC) च्या पृथक्करण प्रेरित ऍपोप्टोसिसला प्रतिबंधित करते, जगण्याची दर वाढवते आणि hESCs आणि hiPSCs च्या उपशेती आणि वितळताना प्लुरिपोटेंसी राखते. ROCK इनहिबिटर Y27632 देखील क्रायोप्रिझर्वेशन दरम्यान स्टेम पेशींच्या जगण्याची दर वाढवते असे दिसून आले आहे. लक्षात घ्या की रॉक इनहिबिटर ॲलिकोट्स प्रकाश आणि पुनरावृत्ती फ्रीझ थॉ सायकल्ससाठी संवेदनशील असतात. पुरवठादाराच्या शिफारस केलेल्या शेल्फ लाइफमध्ये हे अलिकोट्स वापरण्याची खात्री करा.
डॉ. विल्यम स्टॅनफोर्ड-2022
12. hESC/ iPSC साठी कापणी आणि काळजी घेणे
- पेशी वितळल्यानंतर दुसऱ्या दिवशी जगण्याचा दर निश्चित करण्यासाठी सूक्ष्मदर्शकाखाली त्या पहा. टीप: मोठ्या संख्येने अटॅच नसलेल्या पेशींचे निरीक्षण करणे सामान्य आहे. जोपर्यंत काही पेशी संलग्न आहेत, तोपर्यंत 3-7 दिवसांत त्यांच्यापासून वसाहती निर्माण होऊ शकतात.
- विहिरीतून माध्यम काढून टाका आणि प्रति विहिरीत 2 मिली (6 विहिरीसाठी, 12 विहिरीसाठी 1 मिली आणि 24 विहिरींच्या प्लेटसाठी 0.5 मिली) ताजे आणि उबदार पीएससी मीडिया पिपेट करा. इनक्यूबेटरवर प्लेट परत करा.
- सेल 60-70% संगम होईपर्यंत दिले जातात (पुरवठादारांच्या शिफारसींचे अनुसरण करा).
- दिवस 2 पर्यंत, पेशींचे निरीक्षण केले पाहिजे आणि वाढणार्या कोणत्याही भिन्न पेशींचे साफ केले पाहिजे.
- पेशी साफ करण्यासाठी, पिकिंग हूड वापरा आणि विंदुकाच्या टोकाने भिन्न पेशी काढून टाका.
- एकदा सेल साफ झाल्यानंतर, वरील चरणांप्रमाणे माध्यम बदला.
(HESC/iPSC फ्रीझ करणे किंवा hESC/iPSC उत्तीर्ण करणे पहा)
टीप:
पीएससी मीडिया हायपोक्सिक वातावरणात अधिक कार्यक्षम असल्याचे ठरवले होते. आम्ही हे देखील पाहिले आहे की जेव्हा पेशी हायपोक्सिक इनक्यूबेटर विरुद्ध नॉर्मोक्सिकमध्ये वाढतात तेव्हा कमी फरक होतो. शेवटी, हायपोक्सिक इनक्यूबेटर वापरताना बीजित पेशींचा जगण्याचा दर चांगला असतो.
नॉर्मोक्सिक: 37°C, 21% O2, 5% CO2
हायपोक्सिक: 37°C, 5%O2, 10% CO2
डॉ. विल्यम स्टॅनफोर्ड-2022
13. hESC/iPSC उत्तीर्ण
- 6 वेल मॅट्रिजेल लेपित प्लेटमध्ये 2mL PSC मीडिया घाला आणि बाजूला ठेवा.
- जाण्यासाठी प्लेट घ्या आणि माध्यम विहिरीतून काढून टाका आणि एकदा 1mL PBS(-/-) ने धुवा.
- विहिरीत 1mL EDTA द्रावण घाला आणि खोलीच्या तपमानावर 3-4 मिनिटे सोडा. प्लेट इकडे तिकडे हलवू नका कारण पेशी विलग होऊ शकतात.
- EDTA सोल्यूशन काढा आणि 1mL PSC मीडिया जोडा. EDTA पेशींवर 4 मिनिटांपेक्षा जास्त ठेवू नका कारण यामुळे पेशी बंद होतील.
- सेल स्क्रॅपर वापरून सेल स्क्रॅप करा आणि PSC मीडिया असलेल्या तुमच्या प्लेटच्या 6 विहिरींमध्ये सेल विभाजित करा. कॉलनीचे तुकडे जास्त प्रमाणात तोडणे टाळा आणि स्क्रॅपिंगसह सौम्य होण्याचा प्रयत्न करा. पेशी मोठ्या भागांमध्ये ठेवण्याचा प्रयत्न करा. गरज असल्यास गुठळ्या फोडण्यासाठी रुंद तोंडाच्या पिपेट टीपचा वापर करा. पेशींचे अत्याधिक तुकडे झाल्यामुळे पेशींचा मृत्यू होऊ शकतो किंवा उत्तीर्ण झाल्यानंतर जास्त उत्स्फूर्त फरक होऊ शकतो.
- 37 वाजता उष्मायन करा°C प्रत्येक विहिरीमध्ये समान रीतीने पेशी वितरीत केल्यानंतर (8 आकृती किंवा एल आकार हलणे). पासिंगनंतर २४ तास प्लेट डिस्टर्बन्स टाळा.
टीप: एकदा सेल्स स्क्रॅप केल्यावर तुम्हाला ते शक्य तितक्या लवकर नवीन प्लेटमध्ये हस्तांतरित करायचे आहेत कारण पेशी त्वरीत पुन्हा जोडल्या जातील (5 मिनिटांच्या आत).
EDTA पेशींवर 4 मिनिटांपेक्षा जास्त राहिल्यास, पेशी विलग होऊ शकतात. असे झाल्यास, 4mL PSC मीडियासह 15mL फाल्कनमधील पेशी गोळा करा. 5 मिनिटांसाठी 130 rcf वर पेशी फिरवा. गोळ्याला 1mL माध्यमाने पुन्हा लावा आणि 6 वेल मॅट्रिजेल लेपित प्लेट (160uL प्रति विहीर) मध्ये समान रीतीने विभाजित करा.
EDTA सोल्यूशन: DPBS (-/-) च्या 500mL मध्ये 0.5M EDTA (pH 8.0) चे 500uL जोडा. ०.९ ग्रॅम NaCl घाला. निर्जंतुकीकरणासाठी द्रावण फिल्टर करा आणि 6 महिन्यांपर्यंत 4°C वर साठवा.
पेपरमधून:
रासायनिक परिभाषित संस्कृतीच्या परिस्थितीत एंजाइम-मुक्त पृथक्करण करून मानवी प्लुरिपोटेंट स्टेम पेशींचे पासिंग आणि कॉलनी विस्तार
जीनेट बिअर,1 डॅनियल आर गुलब्रन्सन,2,3 निकोल जॉर्ज,4लॉरेन आय. सिनिस्कॅल्ची,1 जेफ्री जोन्स,4,5 जेम्स ए. थॉमसन,2,3,6 आणि गुओकाई चेन1,2
14. फ्रीजिंग hESC/iPSC
- बायो-कूल (नियंत्रित रेट फ्रीझर) चालू करा आणि तापमान -7°C पर्यंत समायोजित करा.
- इनक्यूबेटरमधून पेशी काढा आणि सूक्ष्मदर्शकाखाली संगम आणि आकारविज्ञान पहा.
- विहिरी 70% संगम असल्यास, जुने माध्यम काढून टाका आणि PBS(-/-) सह एकदा धुवा नंतर प्रत्येक विहिरीमध्ये 1 mL EDTA द्रावण (EDTA सोल्यूशनसह पासिंग पहा) घाला.
- खोलीच्या तपमानावर 3-4 मिनिटे उष्मायन करा.
- EDTA सोल्यूशनला एस्पिरेट करा आणि 1 mL कोल्ड mFreSR मीडिया (cat#05855, स्टेम सेल टेक्नॉलॉजीज) घाला.
- पेशी हळूवारपणे उचलण्यासाठी सेल स्क्रॅपर वापरा. पेशी शक्य तितक्या मोठ्या भागांमध्ये ठेवा आणि वर आणि खाली पाइपिंग टाळा.
- रुंद तोंडाच्या टोकाचा वापर करून पेशी/mFreSR क्रायट्यूबमध्ये स्थानांतरित करा. चरण 8 साठी तयार होईपर्यंत कुपी बर्फावर ठेवा.
- नळ्या बायो-कूलमध्ये ठेवा आणि 10 मिनिटे उबवा.
- द्रव नायट्रोजन मिळवा.
- 10 मिनिटांनंतर, द्रव नायट्रोजनमध्ये स्पॅटुला बुडवून आणि सुमारे 10-30 सेकंदांपर्यंत किंवा क्रायो-व्हियलच्या बाजूला क्रिस्टल फॉर्म दिसेपर्यंत क्रायो-वायलच्या बाजूला स्पर्श करून पेशींना बीज द्या.
- “PROG” बटण दाबून प्रोग्राम 1 सुरू करा आणि पुन्हा बटण दाबून प्रोग्राममधून जा आणि तुम्हाला 0.5°C/min चा दर दिसला पाहिजे. , नंतर "RUN" दाबा.
- एकदा तापमान -65°C पर्यंत पोहोचल्यानंतर क्रायो-ट्यूब द्रव नायट्रोजनमध्ये हस्तांतरित आणि संग्रहित केल्या जाऊ शकतात.
पर्याय
दुसरा पर्याय म्हणजे क्रायो-ट्यूब फ्रीझिंग कंटेनरमध्ये (बायोसिजन-कूलसेल) ठेवणे आणि रात्रभर -80°C वर साठवणे. पुढील दिवशी क्रायो-ट्यूब द्रव नायट्रोजन (द्रव किंवा बाष्प अवस्था) मध्ये हलवा.
डॉ. विल्यम स्टॅनफोर्ड-2022