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유도 만능

줄기 세포

 

1. 비과학자를 위한 iPSC 배경 정보

줄기 세포는 아직 하나의 세포 유형이 되지 않은 "미성숙" 세포입니다. 심장이나 혈관, 기타 조직 및 기관을 구성하는 세포와 같이 체내에서 다양한 유형의 성숙한 세포로 발전할 가능성이 있기 때문에 유연성이 있습니다. 2007년에 연구원들은 우리가 일반적으로 연구 목적으로 배양하는 성숙한 성체 세포를 재프로그래밍하여 실험실에서 줄기 세포를 생성하는 전략을 발견했습니다.1, 2 . 이렇게 인공적으로 생성된 줄기 세포를 유도 만능 줄기 세포("iPSC")라고 합니다. Progeria 분야의 경우 이것은 엄청난 돌파구입니다. 처음으로 과학자들은 이제 조로증 줄기 세포를 만들고 조로증에서 줄기 세포가 어떻게 기능하고 발달하는지에 대해 질문할 수 있습니다. 이전에는 인간 조로증 줄기 세포의 공급원이 없었기 때문에 조로증이 없는 사람들의 줄기 세포와 비교하여 조로증 줄기 세포가 어떻게 기능하는지에 대한 정보가 없었습니다. 또한 과학자들은 처음으로 성숙한 조로증 혈관, 심장 세포 및 기타 세포 유형을 생성하도록 조로증 줄기 세포를 재프로그래밍할 수 있습니다. 지금까지 인간 조로증 심장 또는 혈관 세포의 출처가 없었습니다.  이제 키를 요청할 수 있습니다. 심장 발작과 뇌졸중으로 인한 조로증의 조기 사망으로 이어지는 심장병에 대한 질문. 우리는 이러한 발견을 일반 인구의 심장병 및 노화와 비교하고 우리 모두의 노화에 영향을 미치는 요인에 대해 더 많이 발견할 수 있습니다. 이미 Progeria 줄기 세포를 사용한 몇 가지 우수한 연구가 발표되었습니다.3-5  The Progeria Research Foundation의 목표는 이 귀중한 도구를 사용하여 더 많은 발견을 촉진하는 것입니다. 줄기 세포에 대한 입문서는 다음 미국 정부 웹사이트를 참조하십시오. https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. 정의된 요인에 의한 성인 인간 섬유아세포의 다능성 줄기 세포 유도. 세포. 2007, 131 : 861 - 872.
    2. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. 인간 체세포에서 유래한 유도만능줄기세포주. 과학. 2007, 318 : 1917 - 1920.
    3. Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3위, Izpisua Belmonte JC. Hutchinson-Gilford progeria 증후군의 iPSC를 사용한 조기 노화 요약. 자연. 2011, 472 : 221 - 225.
    4. Misteli T. HGPS에서 파생된 오랜 세월 동안의 iPSC. 세포 줄기 세포. 2011, 8 : 4 - 6.

2. 프로게리아연구재단의 유도만능줄기세포(iPSC) 생성 및 보급 목적

Progeria Research Foundation의 임무는 Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome 및 노화 관련 장애에 대한 치료법과 치료법을 발견하는 것입니다. 2009년에 PRF는 고품질 Progeria iPSC를 생성하기 위해 William Stanford 박사의 지시에 따라 캐나다 토론토 대학의 전문 과학자 팀과 협력했습니다. Stanford 박사는 통합 줄기 세포 생물학 분야의 캐나다 연구 위원장입니다. 2011년부터 PRF는 캐나다 오타와 대학의 Stanford 박사와 계속 협력하고 있으며, 여기서 그는 세포 및 분자 의학 교수, 의과 대학, Ottawa Hospital Research Institute의 Sprott Center for Stem Cell Research의 선임 과학자입니다.

우리의 목표는 전 세계 연구자들에게 이 귀중한 도구를 제공하는 것입니다. 이 새로운 연구 도구는 심장 질환 및 노화와의 관계뿐만 아니라 조로증에 대한 새롭고 혁신적인 연구를 생성하는 데 사용될 것입니다.  

3. 허친슨-길포드 조로증 증후군 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 생성

유도 만능 줄기 세포(iPSCs)는 4개의 인간 인자, Oct2, Sox4, Klf4 및 c-Myc의 섬유아세포로의 VSVG-pseudotyped 레트로바이러스 형질도입을 사용하여 유도되었습니다. iPSC 콜로니는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 파생되었습니다. 사용된 절차는 본질적으로 이전에 기술된 바와 같지만 EOS 리포터를 사용하지 않았습니다(Nature Protocols 1828: 1844-2009, XNUMX). 

4. 품질 관리: 검증 및 특성화

현재 사용 가능한 라인은 여러 검증 단계를 거쳤습니다(아래 다운로드 가능한 PDF 참조).

 

    1. 각 라인에 대한 마이코플라스마 검사: Stanford 박사 연구실에서는 각 세포주에 대해 PCR을 통해 마이코플라즈마 분석을 수행했습니다. 또한 확장 후 세포를 선적하기 전에 마이코플라스마에 대해 라인을 다시 테스트합니다.
    2. 다능성 마커 Tra-1-60, Tra-1-81 및 SSEA4에 대한 면역염색.
    3. 다능성의 지표로서의 알칼리성 포스파타제 염색
    4. 4개의 생식층의 마커에 대한 배아체 형성 및 후속 면역염색. 테스트된 마커는 βIII-Tubulin(외배엽), 평활근 액틴(중배엽) 및 GataXNUMX 또는 AFP(내배엽)였습니다.
    5. 핵형 분석.
    6. 분화된 세포에서 라민 A의 재발현
    7. 기형종 검사

진행 중인 추가 검증:
일부 라인은 지원 데이터에 표시된 대로 기형종 분석을 완료했습니다. 다른 모든 라인의 경우 기형종 분석이 진행 중이며 이러한 분석이 완료되면 상태가 업데이트됩니다.

5. 이러한 iPS 세포가 유래된 원래 출발 물질

iPSC는 PRF Cell & Tissue Bank 비형질전환 섬유아세포 세포주에서 파생되었습니다.

모든 iPS 계통에 사용된 형질도입 방법은 Retrovirus MKOS였다.

iPSC 라인 ID변화성별 및 기부연령원래 세포 유형 여기를 클릭하세요..지원 데이터
HGADFN003 iPS 1B LMNA엑손 11,
1824 C>T
남자 2년 0개월 피부 섬유아세포
HGADFN003
003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C LMNA 엑손 11,
1824 C>T
남자 2년 0개월 피부 섬유아세포
HGADFN003
003 iPS1C
HGDFN003
IPS 1D
LMNA 엑손 11,
1824 C>T
남자 2년 0개월 피부 섬유아세포
HGADFN003
003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J LMNA 엑손 11, 1824 C>T남자 8년 5개월피부 섬유아세포 HGADFN167167PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q LMNA 엑손 11, 1824 C>T남자 8년 5개월피부 섬유아세포 HGADFN167167화
HGMDFN090 iPS 1B HGADFN167의 어머니(영향 없음)여성 37세 10개월피부 섬유아세포
HGMDFN090
090 iPS1B
HGMDFN090 IPS 1C HGADFN167의 어머니(영향 없음)여성 37세 10개월피부 섬유아세포
HGMDFN090
090 iPS1C
HGDFFN168 iPS1 D2HGADFN167의 아버지(영향 없음)남성 40세
5mo
피부 섬유아세포 HGDFFN168168iPS1 D2
HGDFFN168 iPS1PHGADFN167의 아버지(영향 없음)남성 40세
5mo
피부 섬유아세포
HGDFFN168
168화

6. 향후 iPSC 업데이트 및 새로운 세포주에 대한 이메일 목록에 가입하십시오.

우리는 iPSC 라인을 계속 생성하고 있습니다. PRF Cell & Tissue Bank에 보관된 iPSC에 대한 정기적인 업데이트를 원하시면 다음을 클릭하여 이메일 목록에 가입하십시오. 여기를 눌러 더 많은 정보를 찾으세요.

7. 질문이 있으십니까?

질문이나 필요 사항이 있으면 의료 책임자인 Leslie Gordon, MD, PhD에게 문의하십시오. lgordon@progeriaresearch.org 또는 978-535-2594

8. iPS 세포주 주문

2014년에 PRF는 MTA를 변경하지 않는다는 정책을 제정했습니다. 이는 12개국 기관에서 일하는 70개 연구팀과 14년간 계약을 맺은 결과다. PRF와 그 변호인은 해당 기간 동안 발생한 문제를 고려하고 그에 따라 계약을 편집하여 공정하고 합리적인 조건이라고 생각합니다.

미국 연방 정부 기관 또는 질문이 있는 경우 Wendy Norris에게 다음 주소로 문의하십시오. wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

1단계: 신청서 작성 및 자료 이전 동의서 작성

비정부 기관에 대한 신청 및 계약

비정부 기관을 위한 물질 이전 계약

2 단계 : 작성한 지원서 및 자료 이전 동의서를 다음 주소의 Wendy Norris에게 반송하십시오. wnorris@lifespan.org. 승인되면 주문 및 예상 배송 날짜를 확인하는 이메일을 받게 됩니다. 

3 단계 : Stanford 박사의 연구실은 현재 냉동 바이알에 라인을 배포하고 있습니다. 그의 연구실은 문화가 배송되면 배송 및 추적 정보와 함께 이메일을 보낼 것입니다. 경험이 부족한 연구원은 인간 배아 줄기 세포/iPSC 작업에 필수적인 전문 과정에서 교육을 받도록 지시받습니다.

Ottawa Hospital Research Institute의 Human Pluripotent Stem Cell Facility(Dr. Stanford 감독)는 Progeria iPSC 세포주에 특정한 iPSC 배양 기술의 기초에 대한 가상 일대일 교육을 제공합니다. 교육 옵션 및 형식은 과학자의 경험 수준에 따라 유연합니다.  자세한 내용은 hpscf@ohri.ca로 이메일을 보내주십시오..

4단계: University of Ottawa는 각 iPSC 회선과 택배 비용(있는 경우)에 대해 직접 송장을 발행합니다.

9. HGPS 및 제어 iPS 세포 배양 배지 준비

iPSC 및 ESC에는 Stem Cell Technologies의 mTeSR Plus(cat# 5825)를 공급해야 합니다. 저장에 대한 공급자의 권장 사항을 따르십시오.

10. Matrigel 플레이트 준비

주의 사항: 마트리겔과 관련된 모든 단계는 가능한 한 빨리 이루어져야 하며 가능한 한 차갑게 유지해야 합니다.

  1. 4에서 해동 matrigel 병°C. 해당 로트의 분석 증명서를 확인하여 단백질 농도를 찾습니다.
  2. 해동된 matrigel에 충분한 차가운 DMEM/F12 미디어를 추가하여 5mg/mL의 최종 농도에 도달합니다.
  3. 미리 냉각된 1mL 팔콘 튜브에서 2단계에서 준비된 matrigel의 15mL 분취량을 만듭니다.
  4. 모든 분취량을 -20에서 동결 및 저장°C.
  5. Matrigel 플레이트를 만들려면 -1°C에 차가운 DMEM/F10 12mL를 추가합니다. 펠릿이 녹을 때까지 잘 섞습니다(거품이 생기지 않고 항상 용액을 차갑게 유지하십시오).
  6. 50mL 튜브로 옮긴 다음 차가운 DMEM/F20 12mL(matrigel 분취량 1mL를 DMEM/F30 12mL에 희석)를 넣고 잘 섞습니다.
  7. 플레이트(1웰 플레이트의 경우 6mL/웰, 0.5웰 플레이트의 경우 12mL/웰, 0.25웰 플레이트의 경우 24mL/웰). 플레이트를 부드럽게 흔들어 용액이 전체 표면적을 덮고 있는지 확인합니다. 남은 matrigel을 다시 얼리지 마십시오.
  8. 플레이트를 즉시 사용하는 경우 플레이트를 실온에 1시간 동안 두십시오(또는 30도에서 37분).°C) 현미경으로 마트리겔을 관찰한다. Matrigel은 "덩어리"가 아니라 잘 분산되어야 합니다.
  9. 다른 시간에 플레이트를 사용하는 경우 파라필름으로 플레이트 가장자리를 감싸고 4에 보관하십시오.°C에서 최대 2주 동안.

Matrigel – BD/피셔, cat#CB-40230

DMEM/F12 – 라이프 테크놀로지스, cat#11330-057

윌리엄 스탠포드 박사-2022

11. ES 또는 iPS 세포 해동(저온 바이알당)

  1. matrigel plate를 4°C에서 꺼내 실온에서 XNUMX시간 동안 데우거나 신선한 matrigel plate를 만듭니다(matrigel plate protocol 준비 참조).
  2. 4mL 팔콘 튜브에 15mL의 mTeSR Plus를 데웁니다.
  3. 액체 질소 탱크에서 세포를 제거하고 작은 얼음 덩어리만 남을 때까지 37°C 수조에서 소용돌이치게 합니다. 바이알은 1-2분 안에 해동됩니다. 이 단계는 신속하게 수행해야 합니다.
  4. 에탄올 셀 튜브와 팔콘 미디어 튜브를 후드에 넣습니다.
  5. 1mL 사용 넓은 입 끝에서 천천히 미리 예열된 매체의 4mL에 세포를 추가합니다(혼합 세포 현탁액을 피하십시오).
  6. 130rcf에서 5분 동안 회전합니다.
  7. 상층액을 제거합니다.
  8. 2mL의 PSC 배지를 추가하고 넓은 입 끝으로 부드럽게 덩어리를 깨다. 6웰 플레이트의 한 웰로 배지를 옮기고 ROCK 억제제(Y2, 최종 농도 27632uM) 10uL를 추가합니다. 잘 코팅된 하나의 매트리겔로 플레이트(6개의 웰 플레이트).
  9. 세포를 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분포시키고 저산소 인큐베이터(5%O2, 10 % CO2). 파종 후 24시간 동안 플레이트 교란을 피하십시오.

    알림: 덩어리가 과도하게 분해되거나 공격적인 파이펫팅을 피하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 생존율을 상당히 감소시킬 수 있습니다. 세포는 씨를 뿌릴 때 큰 100-300개의 세포 덩어리로 남아 있어야 합니다. 부드럽지만 세포가 해동되면 동결 방지제와 접촉하는 시간을 최소화하기 위해 빠르게 작업하십시오.

  10. 24시간 후 미디어를 제거하고 PSC 미디어 2mL를 추가합니다(6웰의 경우 1mL, 12웰의 경우 0.5mL, 24웰 플레이트의 경우 XNUMXmL). hESC/iPSC 프로토콜에 대한 수확 및 관리를 참조하십시오.

    피에스씨미디어

    Stem Cell Technologies의 mTeSR Plus(cat# 5825). 저장에 대한 공급자의 권장 사항을 따르십시오.

    ROCK 억제제 Y27632는 무엇입니까?

    ROCK 억제제 Y27632는 Rho 관련 키나아제 p160 ROCK의 선택적 억제제입니다. ROCK 억제제 Y27632로 치료하면 인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 해리 유도 세포사멸을 방지하여 hESC 및 hiPSC의 계대배양 및 해동 동안 생존율을 높이고 다능성을 유지합니다. ROCK 억제제 Y27632는 또한 동결 보존 동안 줄기 세포의 생존율을 향상시키는 것으로 나타났습니다. Rock inhibitor 분취량은 빛과 반복적인 동결 해동 주기에 민감합니다. 공급업체의 권장 유통 기한 내에 이러한 분취액을 사용해야 합니다.

    윌리엄 스탠포드 박사-2022

    12. hESC/iPSC 수확 및 관리

    1. 세포가 해동된 다음 날 생존율을 결정하기 위해 현미경으로 세포를 살펴보십시오. 참고: 부착되지 않은 셀이 많이 관찰되는 것은 정상입니다. 일부 세포가 부착되어 있는 한 3-7일 이내에 식민지가 발생할 수 있습니다.
    2. 웰당 신선하고 따뜻한 PSC 매체의 웰과 피펫 2mL(6웰의 경우, 1웰의 경우 12mL, 0.5웰 플레이트의 경우 24mL)에서 매체를 제거합니다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
    3. 세포는 60-70% 융합될 때까지 공급됩니다(공급업체 권장 사항을 따르십시오).
    4. 2일째부터 세포를 관찰하고 성장할 수 있는 분화된 세포를 청소해야 합니다.
    5. 세포를 청소하려면 따기 후드를 사용하고 피펫 팁으로 분화된 세포를 긁어냅니다.
    6. 셀이 청소되면 위의 단계에서 수행한 대로 미디어를 변경합니다.

    (hESC/iPSC 동결 또는 hESC/iPSC 전달 참조)

    알림:

    PSC 배지는 저산소 환경에서 더 효율적인 것으로 결정되었습니다. 우리는 또한 세포가 정상 산소에 비해 저산소 인큐베이터에서 성장할 때 분화가 덜 발생한다는 것을 관찰했습니다. 마지막으로, 시드된 세포는 저산소 인큐베이터를 사용할 때 더 나은 생존율을 보입니다.

    정상식: 37°C, 21% O2, 5 % CO2

    저산소증: 37°C, 5%O2, 10 % CO2

    윌리엄 스탠포드 박사-2022

    13. hESC/iPSC 통과

    1. 2웰 마트리겔 코팅 플레이트에 6mL의 PSC 미디어를 추가하고 따로 보관합니다.
    2. 통과할 플레이트를 가지고 웰에서 미디어를 제거하고 PBS(-/-) 1mL로 한 번 씻습니다.
    3. EDTA 용액 1mL를 웰에 넣고 실온에서 3-4분 동안 둡니다. 세포가 분리되기 시작할 수 있으므로 플레이트를 움직이지 마십시오.
    4. EDTA 용액을 제거하고 PSC 배지 1mL를 추가합니다. 4분 이상 세포에 EDTA를 두지 마십시오. 세포가 벗겨질 수 있습니다.
    5. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어내고 PSC 배지가 들어 있는 플레이트의 6개 웰 사이에서 세포를 나눕니다. 콜로니 조각이 과도하게 부서지는 것을 피하고 부드럽게 긁어내십시오. 세포를 큰 덩어리로 유지하십시오. 필요한 경우 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 덩어리를 부수십시오. 세포가 과도하게 분해되면 계대 배양 후 세포 사멸 또는 과도한 자발적 분화가 발생할 수 있습니다.
    6. 37에서 배양°C 각 웰에 세포를 고르게 분산시킨 후(8자 또는 L자 모양으로 진탕). 통과 후 24시간 동안 플레이트 교란을 피하십시오.

    주의사항: 세포가 긁힌 후에는 세포가 빨리(5분 이내) 다시 붙기 때문에 가능한 한 빨리 새 플레이트로 옮기는 것이 좋습니다.

    EDTA가 4분 이상 세포에 남아 있으면 세포가 분리되기 시작할 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 15mL의 PSC 배지와 함께 4mL 매에 세포를 수집하기만 하면 됩니다. 130분 동안 5rcf에서 세포를 회전시킵니다. 1mL의 미디어로 펠릿을 재현탁하고 6웰 마트리겔 코팅 플레이트(웰당 160uL)에 고르게 나눕니다.

    EDTA 용액: 500uL의 0.5M EDTA(pH 8.0)를 500mL의 DPBS(-/-)에 첨가합니다. NaCl 0.9g을 넣는다. 용액을 여과하여 멸균하고 최대 4개월 동안 6°C에서 보관합니다.

    논문에서 :

    화학적으로 정의된 배양 조건에서 무효소 해리에 의한 인간 다능성 줄기 세포의 통과 및 콜로니 확장

    지넷 비어스,1 다니엘 R. 걸브랜슨,2,3 니콜 조지,4로렌 I. 시니스칼치,1 제프리 존스,4,5 제임스 A. 톰슨,2,3,6첸 구오카이1,2

    14. hESC/iPSC 동결

    1. Bio-Cool(제어 속도 냉동기)을 켜고 온도를 -7°C로 조절합니다.
    2. 인큐베이터에서 세포를 제거하고 현미경으로 합류 및 형태를 관찰합니다.
    3. 웰이 70% 합류하는 경우 오래된 미디어를 제거하고 PBS(-/-)로 한 번 세척한 다음 웰당 EDTA 용액 1mL(EDTA 용액 통과 참조)를 추가합니다.
    4. 3-4분 동안 실온에서 배양하십시오.
    5. EDTA 용액을 흡인하고 차가운 mFreSR 미디어(cat#1, Stem Cell Technologies) 05855mL를 추가합니다.
    6. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 들어 올립니다. 가능한 한 큰 덩어리로 세포를 유지하고 피펫팅을 위아래로 피하십시오.
    7. 넓은 입 끝을 사용하여 세포/mFreSR을 저온 튜브로 옮깁니다. 8단계 준비가 될 때까지 바이알을 얼음 위에 보관하십시오.
    8. 튜브를 Bio-Cool에 넣고 10분간 배양합니다.
    9. 액체 질소를 얻습니다.
    10. 10분 후 주걱을 액체 질소에 담그고 약 10-30초 동안 또는 냉동 바이알 측면에 결정 형태가 보일 때까지 냉동 바이알의 측면을 만져 세포를 시드합니다.
    11. "PROG" 버튼을 눌러 프로그램 1을 시작하고 버튼을 다시 눌러 프로그램을 진행하면 0.5°C/min의 속도가 표시되어야 합니다. 를 누른 다음 "실행"을 누릅니다.
    12. 온도가 -65°C에 도달하면 극저온 튜브를 액체 질소로 옮겨 저장할 수 있습니다.

    대체

    또 다른 옵션은 극저온 튜브를 냉동 용기(Biocision-CoolCell)에 넣고 밤새 -80°C에서 보관하는 것입니다. 다음날 극저온 튜브를 액체 질소(액체 또는 증기상)로 옮깁니다.

    윌리엄 스탠포드 박사-2022