حوصلہ افزائی Pluripotent
اسٹیم سیلز
پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن سیل اینڈ ٹشو بینک
انسانی حوصلہ افزائی Pluripotent سٹیم سیلز (iPSC)
- پروجیریا آئی پی ایس سی غیر سائنس دان کے لیے پس منظر کی معلومات
- کا مقصد پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن کے ذریعہ حوصلہ افزائی شدہ Pluripotent اسٹیم سیل کی تخلیق اور تقسیم
- ہچنسن-گلفورڈ پروجیریا سنڈروم انڈسڈ-پلوری پوٹینٹ اسٹیم سیلز (آئی پی ایس سی) کی تخلیق
- کوالٹی کنٹرول: توثیق اور خصوصیت
- اصل ابتدائی مواد جس سے آئی پی ایس سی اخذ کیے گئے تھے۔
- مستقبل کے iPSC اپڈیٹس اور نئی سیل لائنز کے لیے ہماری ای میل لسٹ میں شامل ہوں۔
- سوالات؟ ہم سے رابطہ کریں۔
- آئی پی ایس سی لائنز کا آرڈر دینا
- HGPS اور کنٹرول iPSC کلچر میڈیا کی تیاری
- میٹریجل پلیٹس کی تیاری
- ایچ ای ایس سی اور آئی پی ایس سی سیلز کو پگھلانا (فی کریو شیشی)
- hESC/iPSC کی کٹائی اور دیکھ بھال
- گزرنا hESC/iPSC
- hESC/iPSC کو منجمد کرنا
1. غیر سائنسدان کے لیے iPSC پس منظر کی معلومات
اسٹیم سیل "ناپختہ" خلیات ہیں جنہوں نے ابھی تک کسی ایک قسم کے سیل بننے کا عہد نہیں کیا ہے۔ وہ لچکدار ہیں کیونکہ ان میں جسم میں مختلف قسم کے پختہ خلیات بننے کی صلاحیت ہوتی ہے، جیسے کہ وہ خلیات جو دل یا خون کی نالیوں کو بناتے ہیں، اور دوسرے ٹشوز اور اعضاء۔ 2007 میں، محققین نے بالغ بالغ خلیوں کو دوبارہ پروگرام کرکے لیبارٹری میں اسٹیم سیلز بنانے کی حکمت عملی دریافت کی جسے ہم عام طور پر تحقیقی مقاصد کے لیے اگاتے ہیں۔1, 2 . یہ مصنوعی طور پر بنائے گئے اسٹیم سیلز کو Induced Pluripotent Stem Cells ("iPSCs") کہا جاتا ہے۔ پروجیریا کے میدان کے لیے، یہ ایک بہت بڑی پیش رفت ہے۔ پہلی بار، سائنسدان اب پروجیریا اسٹیم سیل بنا سکتے ہیں اور اس بارے میں سوالات پوچھ سکتے ہیں کہ پروجیریا میں اسٹیم سیل کیسے کام کرتے ہیں اور ترقی کرتے ہیں۔ اس سے قبل انسانی پروجیریا اسٹیم سیلز کا کوئی ذریعہ نہیں تھا، اور اس وجہ سے پروجیریا کے اسٹیم سیلز کے مقابلے میں پروجیریا کے بغیر لوگوں کے اسٹیم سیلز کے مقابلے کیسے کام کرتے ہیں اس کے بارے میں معلومات کی کمی تھی۔ اس کے علاوہ، سائنس دان پروجیریا سٹیم سیلز کو دوبارہ پروگرام کر سکتے ہیں، تاکہ پہلی بار، پروجیریا خون کی نالیوں، دل کے خلیات، اور خلیے کی دیگر اقسام کو پختہ کیا جا سکے۔ اب تک، انسانی پروجیریا دل یا خون کی نالیوں کے خلیات کا کوئی ذریعہ نہیں تھا۔ اب ہم کلید پوچھ سکتے ہیں۔ دل کی بیماری کے بارے میں سوالات جو پروجیریا میں دل کے دورے اور فالج سے جلد موت کا باعث بنتے ہیں۔ ہم ان دریافتوں کا عام آبادی میں دل کی بیماری اور بڑھاپے سے موازنہ کر سکتے ہیں اور اس بارے میں مزید دریافت کر سکتے ہیں کہ ہم سب میں عمر بڑھنے سے کیا اثر پڑتا ہے۔ پروجیریا سٹیم سیلز کا استعمال کرتے ہوئے پہلے ہی کئی بہترین مطالعات شائع ہو چکی ہیں۔3-5 پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن میں ہمارا مقصد اس انمول ٹول کو استعمال کرتے ہوئے بہت سی مزید دریافتوں کو آسان بنانا ہے۔ اسٹیم سیل پر پرائمر کے لیے، براہ کرم امریکی حکومت کی یہ ویب سائٹ دیکھیں: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm
-
- Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. بالغ انسانی فبرو بلاسٹس سے pluripotent سٹیم سیلز کی شمولیت متعین عوامل کے ذریعے۔ سیل 2007;131:861-872.
- Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. حوصلہ افزائی شدہ pluripotent اسٹیم سیل لائنیں جو انسانی سومیٹک خلیوں سے اخذ کی گئی ہیں۔ سائنس۔ 2007;318:1917-1920.
- Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3rd، Izpisua Belmonte JC. ہچنسن-گلفورڈ پروجیریا سنڈروم سے آئی پی ایس سی کے ساتھ قبل از وقت عمر رسیدگی کی تکرار۔ فطرت 2011;472:221-225.
- Misteli T. HGPS سے ماخوذ iPSCs عمروں کے لیے۔ سیل اسٹیم سیل۔ 2011;8:4-6.
2. پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن کے ذریعہ حوصلہ افزائی شدہ pluripotent اسٹیم سیل (iPSC) کی تیاری اور تقسیم کا مقصد
پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن کا مشن ہچنسن-گلفورڈ پروجیریا سنڈروم اور اس کے بڑھاپے سے متعلق عوارض کے علاج اور علاج دریافت کرنا ہے۔ 2009 میں، PRF نے یونیورسٹی آف ٹورنٹو، کینیڈا کے سائنسدانوں کی ایک ماہر ٹیم کے ساتھ، ولیم سٹینفورڈ، پی ایچ ڈی کی ہدایت پر، اعلیٰ معیار کے پروجیریا آئی پی ایس سی تیار کرنے کے لیے تعاون کیا۔ ڈاکٹر سٹینفورڈ انٹیگریٹیو سٹیم سیل بیالوجی میں کینیڈا ریسرچ چیئر ہیں۔ 2011 تک، PRF اوٹاوا یونیورسٹی، کینیڈا میں ڈاکٹر سٹینفورڈ کے ساتھ تعاون جاری رکھے ہوئے ہے جہاں وہ سیلولر اور مالیکیولر میڈیسن، فیکلٹی آف میڈیسن کے پروفیسر اور اوٹاوا ہسپتال ریسرچ انسٹی ٹیوٹ کے اسپروٹ سینٹر فار سٹیم سیل ریسرچ میں سینئر سائنسدان ہیں۔
ہمارا مقصد پوری دنیا کے محققین کو یہ انمول ٹول فراہم کرنا ہے۔ اس نئے تحقیقی ٹول کا استعمال پروجیریا میں نئی اور جدید تحقیق پیدا کرنے کے ساتھ ساتھ دل کی بیماری اور عمر بڑھنے سے اس کے تعلق کے لیے کیا جائے گا۔
3. ہچنسن-گلفورڈ پروجیریا سنڈروم انڈسڈ-پلوری پوٹینٹ اسٹیم سیلز (iPSCs) کی تخلیق
Induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) کو چار انسانی عوامل، Oct4، Sox2، Klf4، اور c-Myc کی VSVG-pseudotyped retroviral transduction کا استعمال کرتے ہوئے fibroblasts میں اخذ کیا گیا تھا۔ آئی پی ایس سی کالونیاں ماؤس ایمبریونک فائبرو بلاسٹس (MEFs) پر اخذ کی گئی تھیں۔ استعمال شدہ طریقہ کار بنیادی طور پر جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا لیکن EOS رپورٹر کے استعمال کے بغیر (نیچر پروٹوکول 4: 1828-1844، 2009)۔
4. کوالٹی کنٹرول: توثیق اور خصوصیت
جو لائنیں فی الحال دستیاب ہیں ان میں توثیق کے کئی مراحل گزرے ہیں (نیچے ڈاؤن لوڈ کے قابل PDFs دیکھیں):
-
- ہر لائن کے لیے مائکوپلاسما ٹیسٹنگ: ڈاکٹر سٹینفورڈ کی لیب نے ہر سیل لائن کے لیے پی سی آر کے ذریعے مائکوپلاسما تجزیہ کیا ہے۔ اس کے علاوہ، توسیع کے بعد اور خلیات بھیجنے سے پہلے، لائنوں کو مائکوپلاسما کے لیے دوبارہ ٹیسٹ کیا جائے گا۔
- pluripotency مارکر Tra-1-60، Tra-1-81، اور SSEA4 کے لیے امیونوسٹیننگ۔
- pluripotency کے اشارے کے طور پر الکلائن فاسفیٹیس سٹیننگ
- جنین کے جسم کی تشکیل اور اس کے نتیجے میں تین جراثیم کی پرتوں کے مارکر کے لیے امیونوسٹیننگ۔ ٹیسٹ کیے گئے مارکر βIII-Tubulin (Ectoderm)، Smooth-Muscle Actin (Mesoderm)، اور Gata4 یا AFP (Endoderm) تھے۔
- کیریوٹائپ تجزیہ۔
- مختلف خلیوں میں لامین اے کا دوبارہ اظہار
- ٹیراٹوما اسسیس
عمل میں اضافی توثیق:
کچھ لائنوں نے ٹیراٹوما اسسیس کو مکمل کیا ہے جیسا کہ معاون ڈیٹا میں دکھایا گیا ہے۔ دیگر تمام لائنوں کے لیے، ٹیراٹوما اسیسز کا عمل جاری ہے اور ان کے مکمل ہوتے ہی اسٹیٹس کو اپ ڈیٹ کر دیا جائے گا۔
5. اصل ابتدائی مواد جس سے یہ آئی پی ایس سیل اخذ کیے گئے تھے۔
آئی پی ایس سی پی آر ایف سیل اور ٹشو بینک نان ٹرانسفارمڈ فبرو بلاسٹ سیل لائنوں سے اخذ کیے گئے تھے۔
تمام آئی پی ایس لائنوں کے لیے استعمال ہونے والا نقل و حمل کا طریقہ Retrovirus MKOS تھا۔
آئی پی ایس سی لائن آئی ڈی | میوٹیشن | جنس اور عطیہ کی عمر | شروع ہونے والے سیل کی قسم یہاں کلک کریں۔. | سپورٹنگ ڈیٹا |
---|---|---|---|---|
HGADFN003 iPS 1B | LMNAExon 11، 1824 C>T | مرد 2 سال 0 ماہ | ڈرمل فائبرو بلاسٹس HGADFN003 | 003 iPS1B |
HGADFN003 iPS 1C | LMNA Exon 11، 1824 C>T | مرد 2 سال 0 ماہ | ڈرمل فائبرو بلاسٹس HGADFN003 | 003 iPS1C |
HGDFN003 آئی پی ایس 1 ڈی | LMNA Exon 11، 1824 C>T | مرد 2 سال 0 ماہ | ڈرمل فائبرو بلاسٹس HGADFN003 | 003 iPS1D |
HGADFN167 iPS 1J | LMNA Exon 11, 1824 C>T | مرد 8 سال 5 ماہ | Dermal Fibroblasts HGADFN167 | 167 پی ایس 1 جے |
HGADFN167 iPS 1Q | LMNA Exon 11, 1824 C>T | مرد 8 سال 5 ماہ | Dermal Fibroblasts HGADFN167 | 167 iPS1Q |
HGMDFN090 iPS 1B | HGADFN167 کی ماں (غیر متاثر) | خاتون 37 سال 10 ماہ | ڈرمل فائبرو بلاسٹس HGMDFN090 | 090 iPS1B |
HGMDFN090 iPS 1C | HGADFN167 کی ماں (غیر متاثر) | خاتون 37 سال 10 ماہ | ڈرمل فائبرو بلاسٹس HGMDFN090 | 090 iPS1C |
HGFDFN168 iPS1 D2 | HGADFN167 کے والد (غیر متاثر) | مرد 40 سال 5 ماہ | Dermal Fibroblasts HGFDFN168 | 168 iPS1 D2 |
HGFDFN168 iPS1P | HGADFN167 کے والد (غیر متاثر) | مرد 40 سال 5 ماہ | ڈرمل فائبرو بلاسٹس HGFDFN168 | 168 iPS1P |
6. مستقبل کے iPSC اپ ڈیٹس اور نئی سیل لائنز کے لیے ہماری ای میل لسٹ میں شامل ہوں۔
ہم آئی پی ایس سی لائنز بنانا جاری رکھے ہوئے ہیں۔ اگر آپ PRF سیل اور ٹشو بینک میں رکھے گئے iPSCs پر وقتاً فوقتاً اپ ڈیٹس چاہتے ہیں، تو براہ کرم کلک کر کے ہماری ای میل کی فہرست میں شامل ہوں۔ یہاں
7. سوالات؟
براہ کرم لیسلی گورڈن، ایم ڈی، پی ایچ ڈی، میڈیکل ڈائریکٹر سے کسی بھی سوال یا ضرورت کے ساتھ، پر رابطہ کریں۔ lgordon@progeriaresearch.org یا 978-535-2594
8. آئی پی ایس سیل لائنوں کو ترتیب دینا
2014 میں، PRF نے ہمارے MTA میں کوئی تبدیلی نہ کرنے کی پالیسی قائم کی۔ یہ 14 ممالک کے اداروں میں کام کرنے والی 70 تحقیقی ٹیموں کے ساتھ 12 سال کے معاہدے کے انتظامات کا نتیجہ ہے۔ PRF اور اس کے وکیل نے اس وقت کی مدت میں پیدا ہونے والے مسائل کو مدنظر رکھا ہے اور اس کے مطابق معاہدے میں ترمیم کی ہے، جس کے نتیجے میں ہم جو محسوس کرتے ہیں وہ منصفانہ اور معقول شرائط ہیں۔
امریکی وفاقی حکومت کے اداروں یا سوالات کے لیے، براہ کرم وینڈی نورس سے یہاں پر رابطہ کریں: wnorris@brownhealth.org یا 401
مرحلہ 1: درخواست اور مواد کی منتقلی کا معاہدہ مکمل کریں۔
غیر سرکاری اداروں کے لیے درخواست اور معاہدہ
غیر سرکاری اداروں کے لیے مواد کی منتقلی کا معاہدہ
مرحلہ 2: مکمل شدہ درخواست اور مواد کی منتقلی کا معاہدہ وینڈی نورس کو واپس کریں۔ wnorris@brownhealth.org. ایک بار منظور ہونے کے بعد، آپ کو ایک ای میل موصول ہوگا جس میں آپ کے آرڈر اور متوقع شپنگ تاریخ کی تصدیق ہوگی۔
مرحلہ 3: ڈاکٹر اسٹینفورڈ کی لیبارٹری اس وقت منجمد کریوویئلز میں لائنیں تقسیم کر رہی ہے۔ اس کی لیبارٹری آپ کو ای میل کرے گی جب کلچر بھیج دیا جائے گا، شپنگ اور ٹریکنگ کی معلومات کے ساتھ۔ ناتجربہ کار محققین کو انسانی برانن سٹیم سیل/iPSCs کے کام کے لیے ضروری خصوصی کورسز میں تربیت حاصل کرنے کی ہدایت کی جاتی ہے۔
اوٹاوا ہسپتال ریسرچ انسٹی ٹیوٹ میں ہیومن Pluripotent سٹیم سیل سہولت (ڈاکٹر اسٹینفورڈ کی طرف سے ہدایت) پروجیریا iPSC سیل لائنوں کے لئے مخصوص iPSC ثقافت کی تکنیکوں کی بنیادی باتوں پر ورچوئل ون آن ون تربیت فراہم کرتی ہے۔ سائنس دانوں کے تجربے کی سطح کے لحاظ سے تربیت کے اختیارات اور فارمیٹ لچکدار ہوتے ہیں۔ مزید معلومات کے لیے، براہ کرم hpscf@ohri.ca پر ای میل کریں۔.
مرحلہ 4: اوٹاوا یونیورسٹی آپ کو براہ راست ہر iPSC لائن کے علاوہ کورئیر کے اخراجات، اگر کوئی ہو تو رسید کرے گی۔
9. HGPS اور کنٹرول iPS سیل کلچر میڈیا کی تیاری
iPSC اور ESCs کو اسٹیم سیل ٹیکنالوجیز (cat# 5825) سے mTeSR Plus کے ساتھ کھلانے کی ضرورت ہے۔ براہ کرم ذخیرہ کرنے کے لیے سپلائر کی سفارشات پر عمل کریں۔
10. میٹریجل پلیٹس کی تیاری
نوٹ: میٹریجل پر مشتمل تمام اقدامات جلد از جلد مکمل کیے جائیں اور جتنا ممکن ہو ٹھنڈا رہنا چاہیے۔
- میٹریجل کی بوتل کو 4 پر پگھلا دیں۔°C. اس لاٹ پر پروٹین کا ارتکاز معلوم کرنے کے لیے اس پر تجزیہ کا سرٹیفکیٹ چیک کریں۔
- 5mg/mL کی حتمی حراستی تک پہنچنے کے لیے پگھلے ہوئے میٹریجل میں کافی ٹھنڈا DMEM/F12 میڈیا شامل کریں۔
- پہلے سے ٹھنڈا 15mL فالکن ٹیوبوں میں مرحلہ 2 سے تیار شدہ میٹریجل کے 1mL aliquots بنائیں۔
- تمام ایلی کوٹس کو -20 پر منجمد اور اسٹور کریں۔°سی۔
- میٹریجل پلیٹیں بنانے کے لیے، میٹریجل (1 ملی لیٹر) کا ایک ایلی کوٹ -20 سے نکال دیں۔°C اور 10mL کولڈ DMEM/F12 شامل کریں۔ گولی کے گلنے تک اچھی طرح مکس کریں (بلبلے بنائے بغیر، اور محلول کو ہمیشہ ٹھنڈا رکھیں)۔
- 50mL ٹیوب میں منتقل کریں، پھر 20mL کولڈ DMEM/F12 شامل کریں (1mL میٹریجل ایلی کوٹ DMEM/F12 کے 30mL میں پتلا ہے)، اچھی طرح مکس کریں۔
- پلیٹ (6 کنویں پلیٹ کے لیے 1mL/کنواں، 12 کنویں پلیٹ کے لیے 0.5mL/کنواں، 24 کنویں پلیٹ کے لیے 0.25mL/کنواں)۔ پلیٹ کو ہلکے سے ہلاتے ہوئے اس بات کو یقینی بنائیں کہ محلول سطح کے پورے حصے کو ڈھانپ رہا ہے۔ کوئی بچا ہوا میٹریجل دوبارہ منجمد نہ کریں۔
- اگر پلیٹ کو فوری طور پر استعمال کیا جائے تو پلیٹ کو کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ (یا 37 پر 30 منٹ) بیٹھنے دیں۔°سی)، خوردبین کے نیچے میٹریجل کا مشاہدہ کریں۔ میٹریجل کو اچھی طرح سے منتشر ہونا چاہئے اور "گڑبڑ" نہیں ہونا چاہئے۔
- اگر پلیٹیں کسی اور وقت استعمال کر رہے ہوں تو، پلیٹ کے کنارے کو پیرا فلم سے لپیٹ کر 4 پر اسٹور کریں۔°C 2 ہفتوں تک۔
میٹریجل - BD/Fisher، cat#CB-40230
DMEM/F12 - لائف ٹیکنالوجیز، cat#11330-057
ڈاکٹر ولیم سٹینفورڈ-2022
11. ES یا iPS خلیات کو پگھلانا (فی کریو شیشی)
- میٹریجل پلیٹ کو 4°C سے باہر نکال کر کمرے کے درجہ حرارت پر ایک گھنٹے کے لیے گرم رکھیں، یا ایک تازہ میٹریجل پلیٹ بنائیں (دیکھیں میٹریجل پلیٹ پروٹوکول کی تیاری)۔
- 15mL فالکن ٹیوب میں mTeSR Plus کا 4mL گرم کریں۔
- مائع نائٹروجن ٹینک سے خلیات کو ہٹائیں اور 37°C کے غسل میں اس وقت تک گھومیں جب تک کہ برف کا ایک چھوٹا سا ٹکڑا باقی نہ رہ جائے۔ شیشی کو 1-2 منٹ میں گلنا چاہئے۔ یہ قدم تیزی سے کیا جانا چاہیے۔
- ایتھنول سیل ٹیوب اور فالکن میڈیا ٹیوب اور ہڈ میں جگہ۔
- 1 ملی لیٹر استعمال کریں۔ چوڑے منہ کی نوک آہستہ آہستہ پہلے سے گرم میڈیا کے 4mL میں خلیات شامل کریں (سیل معطلی کو ملانے سے گریز کریں)۔
- 5 منٹ کے لیے 130 rcf پر گھمائیں۔
- سپرنٹنٹ کو ہٹا دیں۔
- PSC میڈیا کا 2mL شامل کریں، اور ایک چوڑے منہ کی نوک کے ساتھ گچھوں کو آہستہ سے توڑ دیں۔. میڈیا کو 6 کنویں پلیٹ کے ایک کنویں میں منتقل کریں 2uL ROCK inhibitor (Y27632، 10uM کی حتمی حراستی) شامل کریں۔ ایک میٹریجل میں اچھی طرح سے لیپت (ایک 6 کنویں پلیٹ کی)۔
- خلیات کو یکساں طور پر تقسیم کرنے کے لیے خلیوں کو آہستہ سے روکیں، اور ایک ہائپوکسک انکیوبیٹر میں رکھیں (5%O2, 10% CO2)۔ بیج بونے کے بعد 24 گھنٹے تک پلیٹ میں خلل ڈالنے سے گریز کریں۔
نوٹ: یہ بہت ضروری ہے کہ گچھوں کے بہت زیادہ ٹوٹنے یا جارحانہ پائپٹنگ سے بچیں۔ یہ بقا کی شرح کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے۔ بیج بونے کے وقت خلیوں کو 100-300 خلیوں کے بڑے ٹکڑوں میں رہنا چاہئے۔ نرمی کے ساتھ، خلیات کے پگھل جانے کے بعد تیزی سے کام کرنے کی کوشش کریں تاکہ وہ کریو پروٹیکٹنٹ کے رابطے میں وقت کو کم سے کم کر سکیں۔
- 24 گھنٹے کے بعد میڈیا کو ہٹا دیں اور PSC میڈیا کا 2mL شامل کریں (6 کنویں کے لیے، 1mL 12 کنویں کے لیے اور 0.5mL 24 کنویں کے لیے)۔ hESC/iPSC پروٹوکول کی کٹائی اور دیکھ بھال دیکھیں۔
پی ایس سی میڈیا
سٹیم سیل ٹیکنالوجیز (cat# 5825) سے mTeSR Plus۔ براہ کرم ذخیرہ کرنے کے لیے سپلائر کی سفارشات پر عمل کریں۔
ROCK Inhibitor Y27632 کیا ہے؟
ROCK Inhibitor Y27632 Rho سے وابستہ kinase p160 ROCK کا ایک منتخب روکنا ہے۔ ROCK Inhibitor Y27632 کے ساتھ علاج انسانی ایمبریونک اسٹیم سیلز (hESC) اور ہیومن انڈسڈ pluripotent اسٹیم سیلز (iPSC) کی علیحدگی سے متاثرہ اپوپٹوس کو روکتا ہے، بقا کی شرح کو بڑھاتا ہے اور hESCs اور hiPSCs کی ذیلی کاشت اور پگھلنے کے دوران pluripotency کو برقرار رکھتا ہے۔ ROCK Inhibitor Y27632 کو بھی cryopreservation کے دوران سٹیم سیلز کی بقا کی شرح کو بڑھانے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ نوٹ کریں کہ Rock inhibitor aliquots روشنی اور بار بار منجمد پگھلنے کے چکروں کے لیے حساس ہوتے ہیں۔ سپلائر کی تجویز کردہ شیلف لائف کے اندر ان ایلی کوٹس کا استعمال یقینی بنائیں۔
ڈاکٹر ولیم سٹینفورڈ-2022
12. hESC/iPSC کی کٹائی اور دیکھ بھال
- خلیات کے پگھلنے کے اگلے دن زندہ رہنے کی شرح کا تعین کرنے کے لیے خوردبین کے نیچے ان پر ایک نظر ڈالیں۔ نوٹ: غیر منسلک خلیوں کی زیادہ تعداد کا مشاہدہ کرنا معمول ہے۔ جب تک کچھ خلیات منسلک ہوتے ہیں، کالونیاں ان سے 3-7 دنوں کے اندر پیدا ہو سکتی ہیں۔
- کنویں سے میڈیا کو ہٹائیں اور 2 ملی لیٹر (6 کنویں کے لیے، 12 کنویں کے لیے 1 ملی لیٹر اور 24 کنوؤں کی پلیٹ کے لیے 0.5 ملی لیٹر) تازہ اور گرم PSC میڈیا فی کنویں سے نکالیں۔ انکیوبیٹر پر پلیٹ واپس کریں۔
- خلیات کو 60-70% سنگم تک کھلایا جاتا ہے (سپلائر کی سفارشات پر عمل کریں)۔
- دن 2 تک، خلیوں کا مشاہدہ کیا جانا چاہئے اور کسی بھی مختلف خلیوں سے صاف کیا جانا چاہئے جو بڑھ رہے ہیں۔
- خلیات کو صاف کرنے کے لیے، پکنگ ہڈ کا استعمال کریں اور پپیٹ کی نوک سے مختلف خلیوں کو کھرچ دیں۔
- ایک بار سیلز صاف ہوجانے کے بعد، میڈیا کو تبدیل کریں جیسا کہ اوپر کے مراحل میں کیا گیا ہے۔
(HESC/iPSC کو منجمد کرنا یا hESC/iPSC پاس کرنا دیکھیں)
نوٹ:
PSC میڈیا ہائپوکسک ماحول میں زیادہ موثر ہونے کا عزم کیا گیا تھا۔ ہم نے یہ بھی مشاہدہ کیا ہے کہ کم تفریق اس وقت ہوتی ہے جب خلیات ہائپوکسک انکیوبیٹرز بمقابلہ نارموکسک میں اگتے ہیں۔ آخر میں، ہائپوکسک انکیوبیٹر کا استعمال کرتے وقت بیج والے خلیوں کی بقا کی شرح بہتر ہوتی ہے۔
نارموکسک: 37°C، 21% O2, 5% CO2
ہائپوکسک: 37°C، 5%O2, 10% CO2
ڈاکٹر ولیم سٹینفورڈ-2022
13. HESC/iPSC پاس کرنا
- ایک 6 اچھی طرح سے میٹریجل کوٹیڈ پلیٹ میں 2 ملی لیٹر پی ایس سی میڈیا شامل کریں اور ایک طرف رکھ دیں۔
- گزرنے کے لیے پلیٹ لیں اور کنویں سے میڈیا کو ہٹا دیں اور ایک بار 1mL PBS(-/-) سے دھو لیں۔
- کنویں میں 1mL EDTA محلول ڈالیں اور کمرے کے درجہ حرارت پر 3-4 منٹ کے لیے چھوڑ دیں۔ پلیٹ کو ادھر ادھر مت ہلائیں کیونکہ خلیے الگ ہونا شروع کر سکتے ہیں۔
- EDTA حل کو ہٹا دیں اور PSC میڈیا کا 1mL شامل کریں۔ EDTA کو سیلوں پر 4 منٹ سے زیادہ نہ چھوڑیں کیونکہ اس سے خلیے اٹھ جائیں گے۔
- سیل سکریپر کا استعمال کرتے ہوئے خلیوں کو کھرچیں اور PSC میڈیا پر مشتمل اپنی پلیٹ کے 6 کنوؤں کے درمیان خلیات کو تقسیم کریں۔ کالونی کے ٹکڑوں کو ضرورت سے زیادہ توڑنے سے گریز کریں، اور سکریپنگ کے ساتھ نرم رہنے کی کوشش کریں۔ خلیوں کو بڑے ٹکڑوں میں رکھنے کی کوشش کریں۔ اگر ضرورت ہو تو کلپس کو توڑنے کے لئے چوڑے منہ کے پائپیٹ کا استعمال کریں۔ خلیوں کا ضرورت سے زیادہ ٹوٹ جانا سیل کی موت یا گزرنے کے بعد ضرورت سے زیادہ اچانک تفریق کا سبب بن سکتا ہے۔
- 37 پر انکیوبیٹ کریں۔°C ہر کنویں میں خلیوں کو یکساں طور پر تقسیم کرنے کے بعد (8 اعداد و شمار یا L شکل ہلاتے ہوئے)۔ گزرنے کے بعد 24 گھنٹے پلیٹ میں خلل ڈالنے سے گریز کریں۔
نوٹ: ایک بار جب خلیات کو کھرچ دیا جائے تو آپ انہیں جلد از جلد نئی پلیٹ میں منتقل کرنا چاہتے ہیں کیونکہ خلیے تیزی سے دوبارہ جڑ جائیں گے (5 منٹ کے اندر)۔
اگر EDTA کو 4 منٹ سے زیادہ سیلز پر چھوڑ دیا جائے تو خلیے الگ ہونا شروع کر سکتے ہیں۔ اگر ایسا ہوتا ہے تو، صرف 15mL فالکن میں 4mL PSC میڈیا کے ساتھ خلیات جمع کریں۔ سیلز کو 5 منٹ کے لیے 130 rcf پر گھمائیں۔ گولی کو 1mL میڈیا کے ساتھ دوبارہ لگائیں اور 6 اچھی طرح سے میٹریجل لیپت پلیٹ (160uL فی کنواں) میں یکساں طور پر تقسیم کریں۔
EDTA حل: 0.5M EDTA (pH 8.0) کا 500uL DPBS (-/-) کے 500mL میں شامل کریں۔ 0.9 گرام NaCl شامل کریں۔ جراثیم سے پاک کرنے کے لیے محلول کو فلٹر کریں اور اسے 4°C پر 6 ماہ تک محفوظ کریں۔
کاغذ سے:
کیمیاوی طور پر متعین ثقافتی حالات میں انزائم فری انضمام کے ذریعے انسانی pluripotent اسٹیم سیلز کی گزرنا اور کالونی کی توسیع
جینیٹ بیئر,1 ڈینیئل آر گلبرنسن,2,3 نکول جارج,4لارین I. Siniscalchi,1 جیفری جونز,4,5 جیمز اے تھامسن,2,3,6 اور گوکائی چن1,2
14. hESC/iPSC کو منجمد کرنا
- بائیو کول (کنٹرولڈ ریٹ فریزر) کو آن کریں اور درجہ حرارت کو -7°C پر ایڈجسٹ کریں۔
- انکیوبیٹر سے خلیات کو ہٹائیں اور مائکروسکوپ کے نیچے سنگم اور مورفولوجی کا مشاہدہ کریں۔
- اگر کنویں 70% سنگم ہیں تو پرانے میڈیا کو ہٹا دیں اور ایک بار PBS(-/-) سے دھو لیں پھر 1 ملی لیٹر EDTA محلول (EDTA محلول کے ساتھ گزرتے ہوئے دیکھیں) فی کنواں شامل کریں۔
- کمرے کے درجہ حرارت پر 3-4 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔
- EDTA سلوشن کو ایسپریٹ کریں اور 1 ملی لیٹر کولڈ mFreSR میڈیا (cat#05855، سٹیم سیل ٹیکنالوجیز) شامل کریں۔
- خلیوں کو آہستہ سے اٹھانے کے لیے سیل سکریپر کا استعمال کریں۔ خلیوں کو زیادہ سے زیادہ بڑے ٹکڑوں میں رکھیں اور اوپر اور نیچے پائپ کرنے سے گریز کریں۔
- چوڑے منہ کی نوک کا استعمال کرتے ہوئے سیلز/mFreSR کو کرائیوٹوب میں منتقل کریں۔ مرحلہ 8 کے لیے تیار ہونے تک شیشیوں کو برف پر رکھیں۔
- ٹیوبوں کو بائیو کول میں رکھیں اور 10 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔
- مائع نائٹروجن حاصل کریں۔
- 10 منٹ کے بعد، خلیات کو مائع نائٹروجن میں ایک اسپاتولا ڈبو کر اور تقریباً 10-30 سیکنڈ تک یا جب تک آپ کو کرائیو وائل کی طرف ایک کرسٹل شکل نظر نہ آئے، کو چھونے کے ذریعے سیڈ کریں۔
- "PROG" بٹن دبا کر پروگرام 1 شروع کریں اور بٹن کو دوبارہ دبا کر پروگرام کے ذریعے جائیں اور آپ کو 0.5°C/منٹ کی شرح نظر آنی چاہیے۔ ، پھر "RUN" کو دبائیں۔
- ایک بار جب درجہ حرارت -65 ° C تک پہنچ جاتا ہے تو کرائیو ٹیوبوں کو مائع نائٹروجن میں منتقل اور ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔
متبادل
دوسرا آپشن یہ ہے کہ کرائیو ٹیوبز کو منجمد کرنے والے کنٹینر (Biocision-CoolCell) میں رکھیں اور رات کو -80°C پر اسٹور کریں۔ اگلے دن کرائیو ٹیوبوں کو مائع نائٹروجن (مائع یا بخارات کے مرحلے) میں منتقل کریں۔
ڈاکٹر ولیم سٹینفورڈ-2022