Pilih Halaman

Pluripotent terinduksi

stem Cells

 

1. Informasi Latar Belakang iPSC untuk non-ilmuwan

Sel induk adalah sel "belum matang" yang belum berkomitmen untuk menjadi satu jenis sel. Mereka lentur karena memiliki potensi untuk berkembang menjadi berbagai jenis sel matang di dalam tubuh, seperti sel yang membentuk jantung atau pembuluh darah, serta jaringan dan organ lainnya. Pada tahun 2007, peneliti menemukan strategi untuk membuat sel punca di laboratorium dengan memprogram ulang sel dewasa dewasa yang biasa kita tanam untuk tujuan penelitian.1, 2 . Sel induk yang dibuat secara artifisial ini disebut Induced Pluripotent Stem Cells (“iPSCs”). Untuk bidang Progeria, ini adalah terobosan besar. Untuk pertama kalinya, para ilmuwan sekarang dapat membuat sel induk Progeria dan mengajukan pertanyaan tentang bagaimana sel induk berfungsi dan berkembang di Progeria. Sebelumnya tidak ada sumber sel punca Progeria manusia, dan oleh karena itu terdapat kekosongan informasi tentang bagaimana sel punca Progeria berfungsi dibandingkan dengan sel punca dari orang-orang tanpa Progeria. Selain itu, para ilmuwan dapat memprogram ulang sel induk Progeria untuk membuat, untuk pertama kalinya, pembuluh darah Progeria matang, sel jantung, dan jenis sel lainnya. Hingga saat ini, Progeria tidak ada sumbernya dari sel jantung atau pembuluh darah manusia.  Kami sekarang dapat meminta kunci pertanyaan tentang penyakit jantung yang menyebabkan kematian dini di Progeria akibat serangan jantung dan stroke. Kita dapat membandingkan penemuan ini dengan penyakit jantung dan penuaan pada populasi umum dan menemukan lebih banyak tentang apa yang mempengaruhi penuaan pada kita semua. Sudah ada beberapa penelitian luar biasa yang diterbitkan menggunakan sel induk Progeria.3-5  Tujuan kami di The Progeria Research Foundation adalah memfasilitasi lebih banyak penemuan menggunakan alat yang tak ternilai ini. Untuk primer tentang sel induk, silakan lihat situs web pemerintah AS ini: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, T Ichisaka, Tomoda K, Yamanaka S. Induksi sel induk berpotensi majemuk dari fibroblast manusia dewasa dengan faktor-faktor tertentu. Sel. 2007, 131: 861-872.
    2. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, GA Jonsdottir, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. Garis sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi berasal dari sel somatik manusia. Science. 2007, 318: 1917-1920.
    3. Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, L Kurian, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3rd, Izpisua Belmonte JC. Rekapitulasi penuaan dini dengan iPSC dari sindrom progeria Hutchinson-Gilford. Alam. 2011, 472: 221-225.
    4. IPSC yang diturunkan Misteli T. HGPS selama berabad-abad. Cell Stem Cell. 2011, 8: 4-6.

2. Tujuan pembangkitan dan distribusi sel induk berpotensi majemuk (iPSC) yang diinduksi oleh The Progeria Research Foundation

Misi The Progeria Research Foundation adalah menemukan perawatan dan penyembuhan untuk Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome dan gangguan terkait penuaan. Di 2009, PRF mengadakan kolaborasi dengan tim ahli ilmuwan di Universitas Toronto, Kanada, di bawah arahan William Stanford, PhD, untuk menghasilkan Progeria iPSC berkualitas tinggi. Stanford adalah Ketua Riset Kanada dalam Integrative Stem Cell Biology. Pada 2011, PRF terus berkolaborasi dengan Dr. Stanford di University of Ottawa, Kanada di mana ia adalah Profesor Kedokteran Seluler dan Molekuler, Fakultas Kedokteran, dan Ilmuwan Senior di Pusat Penelitian Stempel Rumah Sakit Pusat Penelitian Rumah Sakit Ottawa untuk Penelitian Stem Cell.

Tujuan kami adalah menyediakan alat yang tak ternilai ini bagi para peneliti di seluruh dunia. Alat penelitian baru ini akan digunakan untuk menghasilkan penelitian baru dan inovatif di Progeria, serta hubungannya dengan penyakit jantung dan penuaan.  

3. Generasi Sel Induk-Pluripotent Induced-Pluripotent Hutchinson-Gilford Progeria (iPSCs)

Induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) diturunkan menggunakan transduksi retroviral VSVG-pseudotipe dari empat faktor manusia, Oct4, Sox2, Klf4, dan c-Myc menjadi fibroblas. Koloni iPSC diturunkan pada fibroblas embrionik tikus (MEFs). Prosedur yang digunakan pada dasarnya seperti yang dijelaskan sebelumnya tetapi tanpa menggunakan reporter EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Kontrol Kualitas: Validasi dan Karakterisasi

Baris yang saat ini tersedia telah mengalami beberapa langkah validasi (lihat PDF yang dapat diunduh di bawah):

 

    1. Pengujian Mycoplasma untuk setiap baris: Laboratorium Dr. Stanford telah melakukan mycoplasmaanalysis dengan PCR untuk setiap baris sel. Selain itu, setelah ekspansi dan sebelum pengiriman sel, garis akan diuji ulang untuk mikoplasma.
    2. Imunostaining untuk penanda pluripotency Tra-1-60, Tra-1-81, dan SSEA4.
    3. Pewarnaan Alkaline Phosphatase sebagai indikator pluripotency
    4. Pembentukan tubuh embrioid dan imunostaining selanjutnya untuk penanda ketiga lapisan kuman. Penanda yang diuji adalah βIII-Tubulin (Ectoderm), Smooth-Muscle Actin (Mesoderm), dan Gata4 atau AFP (Endoderm)
    5. Analisis kariotipe.
    6. Ekspresi ulang lamin A dalam sel yang dibedakan
    7. Uji teratoma

Validasi tambahan dalam proses:
Beberapa baris telah menyelesaikan tes teratoma seperti yang ditunjukkan dalam data pendukung. Untuk semua lini lain, uji teratoma sedang dalam proses dan status akan diperbarui setelah tes ini selesai.

5. Bahan awal asli dari mana sel iPS ini diturunkan

iPSC berasal dari jalur sel fibroblast PRF Cell & Tissue Bank yang tidak berubah.

Metode transduksi yang digunakan untuk semua jalur iPS adalah Retrovirus MKOS.

ID Jalur iPSCMutasiGender dan DonationAgeJenis Sel Berasal Klik disini.Data pendukung
HGADFN003 iPS 1B LMNAExon 11,
1824 C> T
2yr 0mo Laki-laki Fibroblast kulit
HGADFN003
003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C LMNA Exon 11,
1824 C> T
2yr 0mo Laki-laki Fibroblast kulit
HGADFN003
003 iPS1C
HGDFN003
iPS 1D
LMNA Exon 11,
1824 C> T
2yr 0mo Laki-laki Fibroblast kulit
HGADFN003
003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J LMNA Exon 11, 1824 C> T8yr 5mo Laki-lakiFibroblast dermal HGADFN167167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q LMNA Exon 11, 1824 C> T8yr 5mo Laki-lakiFibroblast dermal HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B Ibu dari HGADFN167 (tidak terpengaruh)Wanita 37yr 10moFibroblast kulit
HGMDFN090
090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C Ibu dari HGADFN167 (tidak terpengaruh)Wanita 37yr 10moFibroblast kulit
HGMDFN090
090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2Ayah dari HGADFN167 (tidak terpengaruh)40yr Laki-laki
5mo
Fibroblast dermal HGFDFN168168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1PAyah dari HGADFN167 (tidak terpengaruh)40yr Laki-laki
5mo
Fibroblast kulit
HGFDFN168
168 iPS1P

6. Bergabunglah dengan daftar email kami untuk pembaruan iPSC di masa depan dan baris sel baru

Kami terus menghasilkan jalur iPSC. Jika Anda ingin pembaruan berkala tentang iPSC yang diadakan di PRF Cell & Tissue Bank, silakan bergabung dengan daftar email kami dengan mengklik di sini

7. Pertanyaan?

Silakan hubungi Leslie Gordon, MD, PhD, Direktur Medis, dengan pertanyaan atau kebutuhan, di lgordon@progeriaresearch.org atau 978-535-2594

8. Memesan jalur sel iPS

Di 2014, PRF melembagakan kebijakan tidak ada perubahan pada MTA kami. Ini adalah hasil dari pengaturan kontrak 12 tahun dengan tim peneliti 70 yang bekerja di institusi di negara-negara 14. PRF dan penasihatnya telah mempertimbangkan isu-isu yang muncul dalam periode waktu tersebut dan mengedit perjanjian yang sesuai, sehingga menghasilkan apa yang kami rasa merupakan ketentuan yang adil dan masuk akal.

Untuk Lembaga atau pertanyaan Pemerintah Federal AS, harap hubungi Wendy Norris di: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Langkah 1: Selesaikan perjanjian transfer aplikasi dan material

Aplikasi dan Perjanjian untuk Lembaga Non-pemerintah

Perjanjian Transfer Bahan untuk Lembaga Non-pemerintah

Langkah 2: Kembalikan aplikasi lengkap dan perjanjian transfer material ke Wendy Norris di wnorris@lifespan.org. Setelah disetujui, Anda akan menerima email yang mengonfirmasi pesanan Anda dan perkiraan tanggal pengiriman. 

Langkah 3: Laboratorium Dr. Stanford saat ini mendistribusikan garis dalam cryovial beku. Laboratoriumnya akan mengirimkan email kepada Anda ketika budaya telah dikirim, dengan informasi pengiriman dan pelacakan. Peneliti yang tidak berpengalaman diarahkan untuk mendapatkan pelatihan di kursus khusus yang penting untuk pekerjaan sel induk embrio manusia / iPSCs.

Fasilitas Sel Punca Pluripoten Manusia (disutradarai oleh Dr. Stanford) di Institut Penelitian Rumah Sakit Ottawa menawarkan pelatihan virtual satu-satu tentang dasar-dasar teknik kultur iPSC khusus untuk lini sel Progeria iPSC. Pilihan dan format pelatihan fleksibel tergantung pada tingkat pengalaman para ilmuwan.  Untuk informasi lebih lanjut, silakan kirim email ke hpscf@ohri.ca.

Langkah 4: University of Ottawa akan menagih Anda secara langsung untuk setiap baris iPSC ditambah biaya kurir, jika ada.

9. Persiapan Media HGPS dan Kontrol iPS Cell Culture

iPSC dan ESC perlu diberi makan dengan mTeSR Plus dari Stem Cell Technologies (cat# 5825). Harap ikuti rekomendasi pemasok untuk penyimpanan.

10. Mempersiapkan Pelat Matrigel

Note: Semua langkah yang melibatkan matrigel harus dilakukan secepat mungkin dan tetap sedingin mungkin.

  1. Cairkan botol matrigel pada suhu 4°C. Periksa sertifikat analisis pada lot tersebut untuk mengetahui konsentrasi proteinnya.
  2. Tambahkan cukup media DMEM/F12 dingin ke matrigel yang dicairkan untuk mencapai konsentrasi akhir 5mg/mL.
  3. Buat 1 mL alikuot dari matrigel yang disiapkan dari langkah 2 dalam tabung elang 15 mL yang telah didinginkan sebelumnya.
  4. Bekukan dan simpan semua alikuot di -20°C.
  5. Untuk membuat pelat matrigel, keluarkan satu alikuot matrigel (1mL) dari -20°C dan tambahkan 10 mL DMEM/F12 dingin. Aduk rata sampai pelet mencair (tanpa membuat gelembung, dan selalu jaga agar larutan tetap dingin).
  6. Pindahkan ke dalam tabung 50mL, lalu tambahkan 20mL DMEM/F12 dingin (1mL alikuot matrigel diencerkan dalam 30mL DMEM/F12), aduk rata.
  7. Plate (1mL/well untuk 6 well plate, 0.5mL/well untuk 12 well plate, 0.25mL/well untuk 24 well plate). Pastikan larutan menutupi seluruh permukaan dengan mengocok pelat secara perlahan. Jangan membekukan kembali matrigel yang tersisa.
  8. Jika piring langsung digunakan, diamkan piring pada suhu kamar selama 1 jam (atau 30 menit pada suhu 37 .).°C), amati matrigel di bawah mikroskop. Matrigel harus tersebar dengan baik dan tidak "menggumpal".
  9. Jika menggunakan piring di lain waktu, bungkus tepi piring dengan parafilm dan simpan di 4°C hingga 2 minggu.

Matrigel - BD / Fisher, kucing # CB-40230

DMEM / F12 - Teknologi Kehidupan, cat # 11330-057

William Stanford-2022

11. Mencairkan sel ES atau iPS (per cryo-vial)

  1. Keluarkan pelat matrigel dari suhu 4°C dan hangatkan pada suhu kamar selama satu jam, atau buat pelat matrigel yang baru (lihat menyiapkan protokol pelat matrigel).
  2. Hangatkan 4mL mTeSR Plus dalam tabung falcon 15mL.
  3. Keluarkan sel dari tangki nitrogen cair dan putar dalam penangas 37°C sampai hanya tersisa bongkahan es kecil. Botol harus mencair dalam 1-2 menit. Langkah ini harus dilakukan dengan cepat.
  4. Tabung sel etanol dan tabung media elang dan tempatkan di kap.
  5. Gunakan 1mL ujung mulut lebar ke perlahan tambahkan sel ke 4mL media yang telah dihangatkan sebelumnya (hindari pencampuran suspensi sel).
  6. Putar pada 130 rcf selama 5 menit.
  7. Buang supernatan.
  8. Tambahkan 2mL media PSC, dan dengan ujung mulut lebar memecah gumpalan dengan lembut. Transfer media ke satu sumur dari 6 pelat sumur tambahkan 2uL inhibitor ROCK (Y27632, konsentrasi akhir 10uM). Plate menjadi satu matrigel yang dilapisi well (dari 6 well plate).
  9. Batu sel dengan lembut untuk mendistribusikan sel secara merata, dan tempatkan dalam inkubator hipoksia (5% O2, 10% CO2). Hindari gangguan piring selama 24 jam pasca penyemaian.

    CATATAN: Sangat penting untuk menghindari penguraian gumpalan yang berlebihan atau pemipetan yang agresif. Ini secara signifikan dapat mengurangi tingkat kelangsungan hidup. Sel harus tetap dalam potongan 100-300 sel besar pada saat penyemaian. Sambil bersikap lembut, cobalah bekerja dengan cepat setelah sel dicairkan untuk meminimalkan waktu kontak dengan krioprotektan.​

  10. Keluarkan media setelah 24 jam dan tambahkan 2 mL media PSC (untuk sumur 6, 1 mL untuk 12 sumur dan 0.5 mL untuk 24 pelat sumur). Lihat Memanen dan Merawat protokol hESC/iPSC.

    Media PSC

    mTeSR Plus dari Stem Cell Technologies (cat# 5825). Harap ikuti rekomendasi pemasok untuk penyimpanan.

    Apa itu Penghambat ROCK Y27632?

    ROCK Inhibitor Y27632 adalah inhibitor selektif dari Rho terkait kinase p160 ROCK. Pengobatan dengan ROCK Inhibitor Y27632 mencegah disosiasi yang diinduksi apoptosis sel punca embrionik manusia (hESC) dan sel punca pluripoten yang diinduksi manusia (iPSC), meningkatkan tingkat kelangsungan hidup dan mempertahankan pluripotensi selama subkultivasi dan pencairan hESC dan hiPSC. ROCK Inhibitor Y27632 juga telah terbukti meningkatkan tingkat kelangsungan hidup sel induk selama kriopreservasi. Perhatikan bahwa alikuot penghambat batu sensitif terhadap siklus pencairan beku yang ringan dan berulang. Pastikan untuk menggunakan alikuot ini dalam umur simpan yang direkomendasikan pemasok.

    William Stanford-2022

    12. Memanen dan Merawat hESC/ iPSC

    1. Sehari setelah sel dicairkan, lihatlah di bawah mikroskop untuk menentukan tingkat kelangsungan hidup. CATATAN: adalah normal untuk mengamati sejumlah besar sel yang tidak terikat. Selama beberapa sel menempel, koloni dapat muncul dari mereka dalam waktu 3 – 7 hari.
    2. Keluarkan media dari sumur dan pipet 2 mL (untuk 6 sumur, 1 mL untuk 12 sumur dan 0.5 mL untuk 24 pelat sumur) media PSC segar dan hangat per sumur. Kembalikan piring ke inkubator.
    3. Sel diberi makan sampai 60-70% konfluen (ikuti rekomendasi pemasok).
    4. Pada hari ke-2, sel-sel harus diamati dan dibersihkan dari sel-sel berdiferensiasi yang mungkin tumbuh.
    5. Untuk membersihkan sel, gunakan tudung pemetik dan kikis sel yang berbeda dengan ujung pipet.
    6. Setelah sel dibersihkan, ganti media seperti yang dilakukan pada langkah di atas.

    (Lihat Membekukan hESC/iPSC atau Melewati hESC/iPSC)

    CATATAN:

    Media PSC bertekad untuk menjadi lebih efisien dalam lingkungan hipoksia. Kami juga telah mengamati bahwa lebih sedikit diferensiasi terjadi ketika sel-sel ditumbuhkan dalam inkubator hipoksia versus normoksik. Terakhir, sel benih memiliki tingkat kelangsungan hidup yang lebih baik saat menggunakan inkubator hipoksia.

    Normoksi: 37°C, 21%O2, 5% CO2

    Hipoksia: 37°C, 5%O2, 10% CO2

    William Stanford-2022

    13. Melewati hESC/iPSC

    1. Tambahkan 2mL media PSC ke piring berlapis matrigel 6 sumur dan sisihkan.
    2. Ambil piring yang akan dilewati dan keluarkan media dari sumur dan cuci sekali dengan 1mL PBS(-/-).
    3. Tambahkan 1 mL larutan EDTA ke dalam sumur dan biarkan selama 3-4 menit pada suhu kamar. Jangan pindahkan pelat karena sel dapat mulai terlepas.
    4. Keluarkan larutan EDTA dan tambahkan 1mL media PSC. Jangan biarkan EDTA pada sel selama lebih dari 4 menit karena ini akan menyebabkan sel lepas.
    5. Gosok sel menggunakan pengikis sel dan bagi sel di antara 6 lubang di piring Anda yang berisi media PSC. Hindari pemecahan potongan koloni yang berlebihan, dan cobalah untuk berhati-hati dengan pengikisan. Cobalah untuk menyimpan sel dalam potongan besar. Gunakan ujung pipet mulut lebar untuk memecah gumpalan jika diperlukan. Pemecahan sel yang berlebihan dapat menyebabkan kematian sel atau diferensiasi spontan yang berlebihan setelah lewat.
    6. Inkubasi pada suhu 37°C setelah mendistribusikan sel secara merata di setiap sumur (8 gambar atau bentuk L gemetar). Hindari gangguan piring selama 24 jam setelah lewat.

    CATATAN: Setelah sel dikikis, Anda ingin memindahkannya ke pelat baru sesegera mungkin karena sel akan menempel kembali dengan cepat (dalam 5 menit).

    Jika EDTA dibiarkan pada sel selama lebih dari 4 menit, sel dapat mulai terlepas. Jika ini terjadi, cukup kumpulkan sel dalam 15mL falcon dengan 4mL media PSC. Putar sel pada 130 rcf selama 5 menit. Suspensikan kembali pelet dengan 1mL media dan bagi secara merata di antara pelat berlapis matrigel 6 sumur (160uL per sumur).

    Solusi EDTA: Tambahkan 500uL 0.5M EDTA (pH 8.0) ke dalam 500mL DPBS (-/-). Tambahkan 0.9 gram NaCl. Saring larutan untuk mensterilkan dan simpan pada suhu 4°C hingga 6 bulan.

    Dari koran:

    Melewati dan memperluas koloni sel induk berpotensi majemuk manusia oleh disosiasi bebas enzim dalam kondisi kultur yang ditentukan secara kimia

    Jeanette Beers,1 Daniel R. Gulbranson,2,3 Nicole George,4Lauren I. Siniscalchi,1 Jeffrey Jones,4,5 James A. Thomson,2,3,6 dan Guokai Chen1,2

    14. Membekukan hESC/iPSC

    1. Nyalakan Bio-Cool (Freezer Tingkat Terkendali) dan atur suhu ke -7°C.
    2. Keluarkan sel dari inkubator dan amati konfluensi dan morfologi di bawah mikroskop.
    3. Jika sumuran konfluen 70%, pindahkan media lama dan cuci satu kali dengan PBS(-/-) lalu tambahkan 1 mL larutan EDTA (lihat lewat dengan larutan EDTA) per sumur.
    4. Inkubasi pada suhu kamar selama 3-4 menit.
    5. Aspirasi larutan EDTA dan tambahkan 1 mL media mFreSR dingin (cat#05855, Teknologi Sel Induk).
    6. Gunakan pengikis sel untuk mengangkat sel dengan lembut. Simpan sel dalam potongan besar sebanyak mungkin dan hindari pemipetan ke atas dan ke bawah.
    7. Transfer sel/mFreSR ke cryotube menggunakan ujung mulut lebar. Simpan botol di atas es sampai siap untuk langkah 8.
    8. Tempatkan tabung dalam Bio-Cool dan inkubasi selama 10 menit.
    9. Dapatkan nitrogen cair.
    10. Setelah 10 menit, benih sel dengan mencelupkan spatula ke dalam nitrogen cair dan menyentuh sisi cryo-vial selama kurang lebih 10-30 detik atau sampai Anda melihat bentuk kristal di sisi cryo-vial.
    11. Mulai program 1 dengan menekan tombol “PROG” dan jalankan program dengan menekan tombol lagi dan Anda akan melihat kecepatan 0.5°C/menit. , lalu tekan “JALANKAN”.
    12. Setelah suhu mencapai -65 ° C, tabung cryo dapat dipindahkan dan disimpan dalam nitrogen cair.

    Alternatif

    Pilihan lain adalah menempatkan tabung krio dalam wadah beku (Biocision-CoolCell) dan simpan pada suhu -80 °C semalaman. Pindahkan tabung cryo ke nitrogen cair (fase cair atau uap) pada hari berikutnya.

    William Stanford-2022