Pilih Laman

Pluripoten yang Diinduksi

Sel Punca

 

1. Informasi latar belakang iPSC untuk non-ilmuwan

Sel punca adalah sel yang "belum matang" dan belum berkomitmen untuk menjadi satu jenis sel. Sel punca bersifat lentur karena memiliki potensi untuk berkembang menjadi berbagai jenis sel matang di dalam tubuh, seperti sel yang membentuk jantung atau pembuluh darah, serta jaringan dan organ lainnya. Pada tahun 2007, para peneliti menemukan strategi untuk menciptakan sel punca di laboratorium dengan memprogram ulang sel dewasa matang yang biasa kita kembangkan untuk tujuan penelitian.1, 2 Sel punca yang dibuat secara artifisial ini disebut Sel Punca Pluripoten Terinduksi (“iPSC”). Bagi bidang Progeria, ini merupakan terobosan besar. Untuk pertama kalinya, para ilmuwan kini dapat membuat sel punca Progeria dan mengajukan pertanyaan tentang bagaimana sel punca berfungsi dan berkembang dalam Progeria. Sebelumnya tidak ada sumber sel punca Progeria manusia, dan oleh karena itu terdapat kekosongan informasi tentang bagaimana sel punca Progeria berfungsi dibandingkan dengan sel punca dari orang tanpa Progeria. Selain itu, para ilmuwan dapat memprogram ulang sel punca Progeria untuk menciptakan, untuk pertama kalinya, pembuluh darah Progeria yang matang, sel jantung, dan jenis sel lainnya. Hingga saat ini, tidak ada sumber sel jantung atau pembuluh darah Progeria manusia.  Sekarang kita bisa bertanya kunci pertanyaan tentang penyakit jantung yang menyebabkan kematian dini pada Progeria akibat serangan jantung dan stroke. Kita dapat membandingkan penemuan ini dengan penyakit jantung dan penuaan pada populasi umum dan menemukan lebih banyak tentang apa yang memengaruhi penuaan pada kita semua. Sudah ada beberapa penelitian luar biasa yang diterbitkan menggunakan sel induk Progeria.3-5  Tujuan kami di The Progeria Research Foundation adalah memfasilitasi lebih banyak penemuan dengan menggunakan alat yang sangat berharga ini. Untuk informasi dasar tentang sel punca, silakan lihat situs web pemerintah AS ini: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Induksi sel punca pluripoten dari fibroblas manusia dewasa dengan faktor-faktor yang ditentukan. Sel. 2007;131:861-872.
    2. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. Garis sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi berasal dari sel somatik manusia. Sains. 2007;318:1917-1920.
    3. Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3rd, Izpisua Belmonte JC. Rekapitulasi penuaan dini dengan iPSC dari sindrom progeria Hutchinson-Gilford. Alam. 2011;472:221-225.
    4. Misteli T. iPSC turunan HGPS untuk segala usia. Sel Sel Induk. 2011;8:4-6.

2. Tujuan dari generasi dan distribusi sel induk pluripoten terinduksi (iPSC) oleh The Progeria Research Foundation

Misi dari The Progeria Research Foundation adalah menemukan pengobatan dan penyembuhan untuk Sindrom Progeria Hutchinson-Gilford dan gangguan terkait penuaan. Pada tahun 2009, PRF menjalin kerja sama dengan tim ilmuwan ahli di University of Toronto, Kanada, di bawah arahan William Stanford, PhD, untuk menghasilkan iPSC Progeria berkualitas tinggi. Dr. Stanford adalah Ketua Riset Kanada dalam Biologi Sel Punca Integratif. Hingga tahun 2011, PRF terus bekerja sama dengan Dr. Stanford di University of Ottawa, Kanada, tempat ia menjabat sebagai Profesor Kedokteran Seluler dan Molekuler, Fakultas Kedokteran, dan Ilmuwan Senior di Pusat Riset Sel Punca Sprott di Ottawa Hospital Research Institute.

Tujuan kami adalah menyediakan alat yang sangat berharga ini bagi para peneliti di seluruh dunia. Alat penelitian baru ini akan digunakan untuk menghasilkan penelitian baru dan inovatif dalam Progeria, serta hubungannya dengan penyakit jantung dan penuaan.  

3. Pembuatan Sel Punca Pluripoten yang Diinduksi Sindrom Progeria Hutchinson-Gilford (iPSC)

Sel Punca Pluripoten Terinduksi (iPSC) diperoleh dengan menggunakan transduksi retrovirus pseudotyped VSVG dari empat faktor manusia, Oct4, Sox2, Klf4, dan c-Myc ke dalam fibroblas. Koloni iPSC diperoleh dari fibroblas embrionik tikus (MEF). Prosedur yang digunakan pada dasarnya sama seperti yang dijelaskan sebelumnya tetapi tanpa menggunakan reporter EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Kontrol Kualitas: Validasi dan Karakterisasi

Baris yang tersedia saat ini telah menjalani beberapa langkah validasi (lihat PDF yang dapat diunduh di bawah):

 

    1. Pengujian Mikoplasma untuk setiap lini: Laboratorium Dr. Stanford telah melakukan analisis mikoplasma dengan PCR untuk setiap lini sel. Selain itu, setelah ekspansi dan sebelum pengiriman sel, lini sel akan diuji ulang untuk mikoplasma.
    2. Pewarnaan imun untuk penanda pluripotensi Tra-1-60, Tra-1-81, dan SSEA4.
    3. Pewarnaan Alkaline Phosphatase sebagai indikator pluripotensi
    4. Pembentukan badan embrioid dan imunopewarnaan selanjutnya untuk penanda tiga lapisan germinal. Penanda yang diuji adalah βIII-Tubulin (Ektoderm), Aktin Otot Halus (Mesoderm), dan Gata4 atau AFP (Endoderm)
    5. Analisis kariotipe.
    6. Pengekspresian kembali lamin A pada sel-sel yang berdiferensiasi
    7. Pengujian teratoma

Validasi tambahan sedang dalam proses:
Beberapa lini telah menyelesaikan uji teratoma seperti yang ditunjukkan dalam data pendukung. Untuk semua lini lainnya, uji teratoma sedang dalam proses dan statusnya akan diperbarui saat uji ini selesai.

5. Bahan awal asli dari mana sel iPS ini diturunkan

iPSC berasal dari garis sel fibroblas nontransformasi PRF Cell & Tissue Bank.

Metode transduksi yang digunakan untuk semua lini iPS adalah Retrovirus MKOS.

ID Baris iPSCMutasiJenis Kelamin dan Usia DonasiJenis Sel Asal klik disini.Data pendukung
HGADFN003 iPS 1B LMNAEkson 11,
tahun 1824 C>T
Laki-laki 2 thn 0 bln Fibroblas Dermal
HGADFN003
003 iPS1B
HGADFN003iPS 1C LMNA Ekson 11,
tahun 1824 C>T
Laki-laki 2 thn 0 bln Fibroblas Dermal
HGADFN003
003 iPS1C
HGDFN003
iPS 1D
LMNA Ekson 11,
tahun 1824 C>T
Laki-laki 2 thn 0 bln Fibroblas Dermal
HGADFN003
003 PS1D
HGADFN167iPS 1J LMNA Ekson 11, 1824 C>TPria 8 thn 5 blnFibroblas Dermal HGADFN167167 PS 1J
HGADFN167iPS 1Q LMNA Ekson 11, 1824 C>TPria 8 thn 5 blnFibroblas Dermal HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090iPS 1B Induk HGADFN167 (tidak terpengaruh)Perempuan 37 thn 10 blnFibroblas Dermal
HGMDFN090
090 iPS1B
HGMDFN090iPS 1C Induk HGADFN167 (tidak terpengaruh)Perempuan 37 thn 10 blnFibroblas Dermal
HGMDFN090
090 iPS1C
HGFDFN168iPS1D2Ayah HGADFN167 (tidak terpengaruh)Pria 40 tahun
5 bulan
Fibroblas Dermal HGFDFN168168 PS1 D2
HGFDFN168iPS1PAyah HGADFN167 (tidak terpengaruh)Pria 40 tahun
5 bulan
Fibroblas Dermal
HGFDFN168
168 iPS1P

6. Bergabunglah dengan milis kami untuk mendapatkan pembaruan iPSC dan lini sel baru di masa mendatang

Kami terus menghasilkan galur iPSC. Jika Anda menginginkan informasi terkini secara berkala tentang iPSC yang disimpan di PRF Cell & Tissue Bank, silakan bergabung dengan milis kami dengan mengklik Di Sini

7. Ada pertanyaan?

Silakan hubungi Leslie Gordon, MD, PhD, Direktur Medis, jika Anda memiliki pertanyaan atau membutuhkan sesuatu, di lgordon@progeriaresearch.org atau 978-535-2594

8. Memesan lini sel iPS

Pada tahun 2014, PRF memberlakukan kebijakan tidak ada perubahan pada MTA kami. Ini merupakan hasil dari pengaturan kontrak selama 12 tahun dengan 70 tim peneliti yang bekerja di berbagai lembaga di 14 negara. PRF dan penasihat hukumnya telah mempertimbangkan berbagai masalah yang muncul dalam kurun waktu tersebut dan mengedit perjanjian tersebut sesuai dengan itu, sehingga menghasilkan apa yang kami rasa sebagai ketentuan yang adil dan wajar.

Untuk Lembaga Pemerintah Federal AS atau pertanyaan, silakan hubungi Wendy Norris di: alamat email: wnorris@brownhealth.org atau 401-274-1122x48063 cm.

Langkah 1: Lengkapi aplikasi dan perjanjian transfer material

Aplikasi dan Perjanjian untuk Lembaga Non-Pemerintah

Perjanjian Pengalihan Material untuk Lembaga Non-Pemerintah

Langkah 2: Kembalikan aplikasi yang sudah lengkap dan perjanjian transfer material ke Wendy Norris di alamat email: wnorris@brownhealth.orgSetelah disetujui, Anda akan menerima email yang mengonfirmasi pesanan Anda dan perkiraan tanggal pengiriman. 

Langkah 3: Laboratorium Dr. Stanford saat ini sedang mendistribusikan lini dalam kriovial beku. Laboratoriumnya akan mengirimkan email kepada Anda saat kultur telah dikirim, dengan informasi pengiriman dan pelacakan. Peneliti yang belum berpengalaman diarahkan untuk mendapatkan pelatihan di kursus khusus yang penting untuk pekerjaan sel induk embrionik manusia/iPSC.

Fasilitas Sel Punca Pluripoten Manusia (dipimpin oleh Dr. Stanford) di Institut Penelitian Rumah Sakit Ottawa menawarkan pelatihan tatap muka virtual tentang dasar-dasar teknik kultur iPSC yang khusus untuk lini sel Progeria iPSC. Pilihan dan format pelatihan fleksibel tergantung pada tingkat pengalaman para ilmuwan.  Untuk informasi lebih lanjut, silakan email hpscf@ohri.ca.

Langkah 4: Universitas Ottawa akan menagih Anda secara langsung untuk setiap jalur iPSC ditambah biaya kurir, jika ada.

9. Persiapan Media Kultur Sel HGPS dan Kontrol iPS

iPSC dan ESC perlu diberi makan dengan mTeSR Plus dari Stem Cell Technologies (cat# 5825). Harap ikuti rekomendasi pemasok untuk penyimpanan.

10. Mempersiapkan Pelat Matrigel

Catatan: Semua langkah yang melibatkan matrigel harus dilakukan secepat mungkin dan tetap sedingin mungkin.

  1. Cairkan botol matrigel pada suhu 4°C. Periksa sertifikat analisis pada lot tersebut untuk mengetahui konsentrasi proteinnya.
  2. Tambahkan media DMEM/F12 dingin secukupnya ke matrigel yang telah dicairkan hingga mencapai konsentrasi akhir 5 mg/mL.
  3. Buat alikuot 1 mL dari matrigel yang telah disiapkan dari langkah 2 dalam tabung falcon 15 mL yang telah didinginkan sebelumnya.
  4. Bekukan dan simpan semua alikuot pada suhu -20°C.
  5. Untuk membuat pelat matrigel, keluarkan satu bagian matrigel (1mL) dari -20°C dan tambahkan 10 mL DMEM/F12 dingin. Aduk rata hingga pelet mencair (tanpa menimbulkan gelembung, dan selalu jaga agar larutan tetap dingin).
  6. Pindahkan ke tabung 50mL, lalu tambahkan 20mL DMEM/F12 dingin (1mL alikuot matrigel diencerkan dalam 30mL DMEM/F12), aduk rata.
  7. Plat (1 mL/sumur untuk plat 6 sumur, 0,5 mL/sumur untuk plat 12 sumur, 0,25 mL/sumur untuk plat 24 sumur). Pastikan larutan menutupi seluruh permukaan dengan mengocok plat secara perlahan. Jangan bekukan kembali matrigel yang tersisa.
  8. Jika akan menggunakan plat segera, biarkan plat pada suhu ruangan selama 1 jam (atau 30 menit pada suhu 37°C), amati matrigel di bawah mikroskop. Matrigel harus tersebar dengan baik dan tidak "menggumpal".
  9. Jika menggunakan piring di lain waktu, bungkus tepi piring dengan parafilm dan simpan pada suhu 4°C hingga 2 minggu.

Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Teknologi Kehidupan, cat#11330-057

Dr. William Stanford-2022

11. Mencairkan sel ES atau iPS (per cryo-vial)

  1. Keluarkan pelat matrigel dari suhu 4°C dan hangatkan pada suhu ruangan selama satu jam, atau buat pelat matrigel baru (lihat protokol persiapan pelat matrigel).
  2. Hangatkan 4mL mTeSR Plus dalam tabung falcon 15mL.
  3. Keluarkan sel dari tangki nitrogen cair dan aduk dalam air bersuhu 37°C hingga hanya tersisa bongkahan es kecil. Botol akan mencair dalam 1-2 menit. Langkah ini harus dilakukan dengan cepat.
  4. Tabung sel etanol dan tabung media falcon lalu tempatkan dalam sungkup.
  5. Gunakan 1mL ujung mulut lebar perlahan tambahkan sel ke 4mL media yang telah dihangatkan sebelumnya (hindari pencampuran suspensi sel).
  6. Putar pada 130 rcf selama 5 menit.
  7. Buang cairan supernatan.
  8. Tambahkan 2mL media PSC, dan dengan ujung mulut lebar hancurkan gumpalan dengan lembut. Pindahkan media ke satu sumur dari pelat 6 sumur, tambahkan 2uL inhibitor ROCK (Y27632, konsentrasi akhir 10uM). Masukkan pelat ke dalam satu sumur berlapis matrigel (dari pelat 6 sumur).
  9. Goyangkan sel dengan lembut untuk mendistribusikan sel secara merata, dan tempatkan dalam inkubator hipoksia (5%O2, 10% Perusahaan2). Hindari gangguan pada pelat selama 24 jam setelah penyemaian.

    CATATAN: Sangat penting untuk menghindari pemecahan gumpalan yang berlebihan atau pemipetan yang agresif. Hal ini dapat mengurangi tingkat kelangsungan hidup secara signifikan. Sel-sel harus tetap dalam potongan-potongan yang besarnya 100-300 sel pada saat penyemaian. Meskipun berhati-hati, cobalah bekerja dengan cepat setelah sel-sel dicairkan untuk meminimalkan waktu kontak dengan krioprotektan.

  10. Buang media setelah 24 jam dan tambahkan 2 mL media PSC (untuk 6 sumur, 1 mL untuk 12 sumur, dan 0,5 mL untuk pelat 24 sumur). Lihat Pemanenan dan Perawatan untuk protokol hESC/iPSC.

    media PSC

    mTeSR Plus dari Stem Cell Technologies (cat# 5825). Harap ikuti rekomendasi dari pemasok untuk penyimpanan.

    Apa itu ROCK Inhibitor Y27632?

    Inhibitor ROCK Y27632 merupakan inhibitor selektif dari Rho associated kinase p160 ROCK. Pengobatan dengan Inhibitor ROCK Y27632 mencegah apoptosis yang diinduksi oleh disosiasi pada sel punca embrionik manusia (hESC) dan sel punca pluripoten yang diinduksi manusia (iPSC), meningkatkan tingkat kelangsungan hidup dan mempertahankan pluripotensi selama subkultur dan pencairan hESC dan hiPSC. Inhibitor ROCK Y27632 juga telah terbukti meningkatkan tingkat kelangsungan hidup sel punca selama kriopreservasi. Perhatikan bahwa alikuot inhibitor Rock sensitif terhadap cahaya dan siklus pembekuan-pencairan yang berulang. Pastikan untuk menggunakan alikuot ini dalam masa simpan yang direkomendasikan oleh pemasok.

    Dr. William Stanford-2022

    12. Pemanenan dan Perawatan hESC/iPSC

    1. Sehari setelah sel dicairkan, amati sel-sel tersebut di bawah mikroskop untuk menentukan tingkat kelangsungan hidup. CATATAN: adalah normal untuk mengamati sejumlah besar sel yang tidak menempel. Selama beberapa sel menempel, koloni dapat muncul dari sel-sel tersebut dalam waktu 3 – 7 hari.
    2. Keluarkan media dari sumur dan pipet 2 mL (untuk 6 sumur, 1 mL untuk 12 sumur dan 0,5 mL untuk pelat 24 sumur) media PSC segar dan hangat per sumur. Kembalikan pelat ke inkubator.
    3. Sel diberi makan hingga konfluen 60-70% (ikuti rekomendasi pemasok).
    4. Pada hari ke-2, sel harus diamati dan dibersihkan dari sel-sel berdiferensiasi yang mungkin tumbuh.
    5. Untuk membersihkan sel, gunakan penutup pengambil dan kikis sel-sel yang telah berdiferensiasi dengan ujung pipet.
    6. Setelah sel dibersihkan, ganti media seperti yang dilakukan pada langkah di atas.

    (Lihat Pembekuan hESC/iPSC atau Melewatkan hESC/iPSC)

    CATATAN:

    Media PSC terbukti lebih efisien dalam lingkungan hipoksia. Kami juga mengamati bahwa diferensiasi yang terjadi lebih sedikit ketika sel ditumbuhkan dalam inkubator hipoksia dibandingkan dengan inkubator normoksik. Terakhir, sel yang disemai memiliki tingkat kelangsungan hidup yang lebih baik saat menggunakan inkubator hipoksia.

    Normoksik: 37°C, 21% O2, 5% Perusahaan2

    Hipoksia: 37°C, 5%O2, 10% Perusahaan2

    Dr. William Stanford-2022

    13. Lulus hESC/iPSC

    1. Tambahkan 2 mL media PSC ke dalam pelat berlapis matrigel 6 sumur dan sisihkan.
    2. Ambil pelat yang akan disalurkan dan keluarkan media dari sumur lalu cuci sekali dengan 1 mL PBS(-/-).
    3. Tambahkan 1 mL larutan EDTA ke dalam sumur dan biarkan selama 3-4 menit pada suhu ruangan. Jangan menggerakkan pelat karena sel-sel dapat mulai terlepas.
    4. Buang larutan EDTA dan tambahkan 1 mL media PSC. Jangan biarkan EDTA pada sel selama lebih dari 4 menit karena ini akan menyebabkan sel terangkat.
    5. Kikis sel menggunakan pengikis sel dan bagi sel di antara 6 sumuran pelat yang berisi media PSC. Hindari pemecahan berlebihan pada potongan koloni, dan cobalah untuk berhati-hati saat mengikis. Cobalah untuk menjaga sel dalam potongan besar. Gunakan ujung pipet bermulut lebar untuk memecah gumpalan jika perlu. Pemecahan sel yang berlebihan dapat menyebabkan kematian sel atau diferensiasi spontan yang berlebihan setelah melewati lintasan.
    6. Inkubasi pada suhu 37°C setelah mendistribusikan sel secara merata di setiap sumur (pengocokan berbentuk 8 angka atau L). Hindari gangguan pada pelat selama 24 jam setelah pengoperan.

    CATATAN: Setelah sel dikikis, Anda ingin memindahkannya ke pelat baru sesegera mungkin karena sel akan menempel kembali dengan cepat (dalam waktu 5 menit).

    Jika EDTA dibiarkan pada sel selama lebih dari 4 menit, sel dapat mulai terlepas. Jika ini terjadi, cukup kumpulkan sel dalam falcon 15mL dengan 4mL media PSC. Putar sel pada 130 rcf selama 5 menit. Suspensikan kembali pelet dengan 1mL media dan bagi secara merata di antara pelat berlapis matrigel 6 sumur (160uL per sumur).

    Larutan EDTA: Tambahkan 500uL EDTA 0,5M (pH 8,0) ke dalam 500mL DPBS (-/-). Tambahkan 0,9g NaCl. Saring larutan untuk mensterilkannya dan simpan pada suhu 4°C hingga 6 bulan.

    Dari makalah:

    Pengalihan dan perluasan koloni sel induk pluripoten manusia melalui disosiasi bebas enzim dalam kondisi kultur yang ditentukan secara kimia

    Bir Jeanette,1 Daniel R. Gulbranson,2,3 Nicole George,4Lauren I. Siniscalchi,1 Jeffrey Jones,4,5 Penulis: James A. Thomson,2,3,6 Dan Guokai Chen1,2

    14. Membekukan hESC/iPSC

    1. Nyalakan Bio-Cool (Controlled Rate Freezer) dan atur suhu ke -7°C.
    2. Keluarkan sel dari inkubator dan amati konfluensi dan morfologi di bawah mikroskop.
    3. Bila sumurnya konfluen 70%, buang media lama dan cuci sekali dengan PBS(-/-), kemudian tambahkan 1 mL larutan EDTA (lihat melewatkan dengan larutan EDTA) per sumur.
    4. Inkubasi pada suhu ruangan selama 3-4 menit.
    5. Aspirasikan larutan EDTA dan tambahkan 1 mL media mFreSR dingin (cat#05855, Stem Cell Technologies).
    6. Gunakan pengikis sel untuk mengangkat sel dengan hati-hati. Sebisa mungkin, buat sel dalam potongan besar dan hindari pemipetan ke atas dan ke bawah.
    7. Pindahkan sel/mFreSR ke tabung krio menggunakan ujung bermulut lebar. Simpan botol dalam es hingga siap untuk langkah 8.
    8. Tempatkan tabung dalam Bio-Cool dan inkubasi selama 10 menit.
    9. Dapatkan nitrogen cair.
    10. Setelah 10 menit, taburkan sel dengan mencelupkan spatula ke dalam nitrogen cair dan menyentuh sisi botol kriogenik selama kurang lebih 10-30 detik atau sampai Anda melihat kristal terbentuk pada sisi botol kriogenik.
    11. Mulailah program 1 dengan menekan tombol “PROG” dan jalankan program dengan menekan tombol tersebut lagi dan Anda akan melihat laju 0,5°C/menit. , lalu tekan “RUN”.
    12. Setelah suhu mencapai -65°C, tabung kriogenik dapat dipindahkan dan disimpan dalam nitrogen cair.

    Alternatif

    Pilihan lainnya adalah dengan menempatkan tabung krio dalam wadah pembeku (Biocision-CoolCell) dan menyimpannya pada suhu -80°C semalaman. Pindahkan tabung krio ke nitrogen cair (fase cair atau uap) pada hari berikutnya.

    Dr. William Stanford-2022

    id_IDIndonesian