1. ИПСК Справочная информация для не-ученых

Стволовые клетки - это «незрелые» клетки, которые еще не готовы стать клетками какого-либо одного типа. Они податливы, потому что могут развиваться во многие различные типы зрелых клеток в организме, например, клетки, составляющие сердце или кровеносные сосуды, а также другие ткани и органы. В 2007 году исследователи открыли стратегию создания стволовых клеток в лаборатории путем перепрограммирования зрелых взрослых клеток, которые мы обычно выращиваем для исследовательских целей.^{1, 2} . Эти искусственно созданные стволовые клетки называются индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками («ИПСК»). Для прогерии это огромный прорыв. Впервые ученые могут создавать стволовые клетки прогерии и задавать вопросы о том, как стволовые клетки функционируют и развиваются в прогерии. Ранее не было источника стволовых клеток прогерии человека, и поэтому отсутствовала информация о том, как функционируют стволовые клетки прогерии по сравнению со стволовыми клетками людей без прогерии. Кроме того, ученые могут перепрограммировать стволовые клетки прогерии, чтобы впервые создать зрелые кровеносные сосуды прогерии, клетки сердца и другие типы клеток. До сих пор не было источника человеческих клеток сердца или кровеносных сосудов прогерии.  Теперь мы можем спросить ключ вопросы о сердечном заболевании, которое приводит к ранней смерти прогерии от сердечных приступов и инсультов. Мы можем сравнить эти открытия с сердечными заболеваниями и старением среди населения в целом и узнать больше о том, что влияет на старение у всех нас. Уже было опубликовано несколько отличных исследований с использованием стволовых клеток прогерии.^3-5  Наша цель в The Progeria Research Foundation - способствовать большему количеству открытий с помощью этого бесценного инструмента. Праймеры по стволовым клеткам можно найти на веб-сайте правительства США: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Цель создания и распространения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) Исследовательским фондом Прогерии.

Миссия Исследовательского фонда Progeria состоит в том, чтобы найти способы лечения и лечения синдрома Хатчинсона-Гилфорда и его расстройств, связанных со старением. В 2009 PRF начал сотрудничество с группой экспертов из Университета Торонто, Канада, под руководством доктора наук Уильяма Стэнфорда, для создания высококачественных ИПСК Progeria. Доктор Стэнфорд является канадским научным руководителем в области интегративной биологии стволовых клеток. Что касается 2011, PRF продолжает сотрудничать с доктором Стэнфордом в Университете Оттавы, Канада, где он является профессором клеточной и молекулярной медицины, медицинского факультета, а также старшим научным сотрудником в Центре исследований стволовых клеток в Спротте Исследовательского института Оттавской больницы.

Наша цель - предоставить этот бесценный инструмент исследователям во всем мире. Этот новый исследовательский инструмент будет использоваться для проведения новых и инновационных исследований прогерии, а также ее связи с сердечными заболеваниями и старением.  

3. Поколение индуцированных плюрипотентными стволовыми клетками синдрома Хатчинсона-Гилфорда (ИПСК)

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) были получены с использованием VSVG-псевдотипированной ретровирусной трансдукции четырех факторов человека, Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc в фибробласты. Колонии ИПСК были получены на эмбриональных фибробластах мыши (MEF). Используемая процедура была по существу такой же, как описано ранее, но без использования репортера EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Контроль качества: валидация и характеристика

Строки, которые в настоящее время доступны, прошли несколько этапов проверки (см. Загружаемые PDF-файлы ниже):

5. Исходный исходный материал, из которого были получены эти iPS-клетки.

ИПСК были получены из нетрансформированных клеточных линий фибробластов PRF Cell & Tissue Bank.

Методом трансдукции, использованным для всех линий iPS, был ретровирус MKOS.

идентификатор линии iPSC	Мутация	Пол и пожертвование	Исходный тип клетки Открыть.	Вспомогательные данные
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Кобель 2yr 0mo	Дермальные фибробласты HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Кобель 2yr 0mo	Дермальные фибробласты HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Кобель 2yr 0mo	Дермальные фибробласты HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Кобель 8yr 5mo	Дермальные фибробласты HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Кобель 8yr 5mo	Дермальные фибробласты HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Мать HGADFN167 (без изменений)	Женский 37yr 10mo	Дермальные фибробласты HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Мать HGADFN167 (без изменений)	Женский 37yr 10mo	Дермальные фибробласты HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Отец HGADFN167 (без изменений)	Мужской 40yr 5mo	Дермальные фибробласты HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Отец HGADFN167 (без изменений)	Мужской 40yr 5mo	Дермальные фибробласты HGFDFN168	168 iPS1P

6. Присоединяйтесь к нашему списку адресов электронной почты для будущих обновлений iPSC и новых линий клеток

Мы продолжаем создавать линии ИПСК. Если вы хотите получать периодические обновления по iPSC, хранящимся в PRF Cell & Tissue Bank, присоединяйтесь к нашему списку рассылки, нажав здесь

7. Вопросы?

Пожалуйста, свяжитесь с Лесли Гордон, MD, PhD, Медицинский директор, с любыми вопросами или потребностями, по адресу lgordon@progeriaresearch.org или 978-535-2594

8. Заказ клеточных линий iPS.

В 2014 PRF ввела политику без изменений в нашем MTA. Это результат многолетних договоренностей 12 с исследовательскими группами 70, работающими в учреждениях в странах 14. PRF и ее адвокат приняли во внимание проблемы, возникшие в тот период времени, и соответствующим образом отредактировали соглашение, в результате чего мы считаем справедливые и разумные условия

По вопросам, связанным с учреждениями федерального правительства США, обращайтесь к Венди Норрис по адресу: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Шаг 1: заполнить заявку и соглашение о передаче материала

Заявка и соглашение для негосударственных учреждений

Соглашение о передаче материала для неправительственных учреждений

Шаг 2: Верните заполненное заявление и соглашение о передаче материалов Венди Норрис по адресу: wnorris@lifespan.org. После подтверждения вы получите электронное письмо с подтверждением вашего заказа и предполагаемой даты доставки. 

Шаг 3: Лаборатория доктора Стэнфорда в настоящее время распределяет линии по замороженным криопробиркам. Его лаборатория отправит вам электронное письмо, когда культура будет отправлена, с информацией о доставке и отслеживании. Неопытным исследователям рекомендуется пройти обучение на специализированных курсах, необходимых для работы с человеческими эмбриональными стволовыми клетками / ИПСК.

Центр плюрипотентных стволовых клеток человека (под руководством доктора Стэнфорда) в Научно-исследовательском институте больницы Оттавы предлагает виртуальное индивидуальное обучение основам методов культивирования иПСК, специфичных для клеточных линий иПСК Progeria. Варианты и формат обучения являются гибкими в зависимости от уровня опыта ученых.  Для получения дополнительной информации, пожалуйста, напишите по адресу hpscf@ohri.ca.

Шаг 4: Университет Оттавы выставит вам счет напрямую за каждую линию iPSC плюс расходы на курьера, если таковые имеются.

9. Приготовление сред для культур клеток HGPS и контрольных iPS.

iPSC и ESC должны получать mTeSR Plus от Stem Cell Technologies (каталожный номер 5825). Пожалуйста, следуйте рекомендациям поставщика по хранению.

10. Подготовка пластин матригеля.

Внимание: Все шаги с участием матригеля должны быть выполнены как можно быстрее и оставаться максимально холодными.

1. Разморозить бутылку матригеля на 4°C. Проверьте сертификат анализа на эту партию, чтобы определить концентрацию белка.
2. Добавьте достаточное количество холодной среды DMEM/F12 в размороженный матригель, чтобы достичь конечной концентрации 5 мг/мл.
3. Сделайте аликвоты 1 мл подготовленного матригеля из шага 2 в предварительно охлажденных 15 мл пробирках сокола.
4. Заморозить и хранить все аликвоты при -20°C.
5. Чтобы сделать планшеты с матригелем, возьмите одну аликвоту матригеля (1 мл) из -20°C и добавьте 10 мл холодной DMEM/F12. Хорошо перемешайте, пока гранулы не оттают (без образования пузырьков, и всегда держите раствор холодным).
6. Перенесите в пробирку на 50 мл, затем добавьте 20 мл холодной DMEM/F12 (1 мл аликвоты матригеля разводят в 30 мл DMEM/F12), хорошо перемешайте.
7. Планшет (1 мл/лунку для 6-луночного планшета, 0.5 мл/лунку для 12-луночного планшета, 0.25 мл/лунку для 24-луночного планшета). Аккуратно встряхнув планшет, убедитесь, что раствор покрывает всю поверхность. Не замораживайте повторно остатки матригеля.
8. При немедленном использовании планшета оставьте его при комнатной температуре на 1 час (или 30 минут при 37°С).°C), наблюдайте матригель под микроскопом. Матригель должен быть хорошо диспергирован и не «комковат».
9. Если вы используете пластины в другое время, оберните край пластины парафильмом и храните при температуре 4°С до 2 недель.

Матригель - BD / Fisher, кошка № CB-40230

DMEM / F12 - Life Technologies, кат. № 11330-057

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

11. Оттаивание клеток ES или iPS (в одном флаконе)

1. Возьмите пластину с матригелем при температуре 4°C и прогрейте при комнатной температуре в течение часа или сделайте новую пластину с матригелем (см. протокол подготовки пластины с матригелем).
2. Подогрейте 4 мл mTeSR Plus в пробирке Falcon объемом 15 мл.
3. Удалите клетки из резервуара с жидким азотом и вращайте в ванне с температурой 37 ° C, пока не останется только небольшой кусок льда. Флакон должен оттаять в течение 1-2 минут. Этот шаг нужно сделать быстро.
4. Этаноловую пробирку с ячейками и сокольную пробирку поместите в колпак.
5. Используйте 1 мл широкий кончик рта, чтобы медленно добавить клетки в 4 мл предварительно нагретой среды (избегайте смешивания клеточной суспензии).
6. Вращение при 130 rcf в течение 5 минут.
7. Удалить супернатант.
8. Добавьте 2 мл среды PSC и используйте широкий наконечник. аккуратно разбивайте комки. Среду для переноса в одну лунку 6-луночного планшета добавляют 2 мкл ингибитора ROCK (Y27632, конечная концентрация 10 мкМ). Пластина в одну лунку, покрытую матригелем (6-луночную пластину).
9. Аккуратно встряхните клетки, чтобы равномерно распределить их, и поместите в гипоксический инкубатор (5% O₂, 10% CO₂). Избегайте нарушения чашек в течение 24 часов после посева.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать чрезмерного разрушения комков или агрессивного пипетирования. Это может значительно снизить выживаемость. Клетки должны оставаться кусками по 100-300 клеток на момент посева. Соблюдая осторожность, постарайтесь работать быстро после оттаивания клеток, чтобы свести к минимуму время, в течение которого они находятся в контакте с криопротектором.​

10. Удалите среду через 24 часа и добавьте 2 мл среды PSC (для 6-луночного, 1 мл для 12-луночного и 0.5 мл для 24-луночного планшета). См. Сбор и уход для протокола hESC/iPSC.

PSC media

mTeSR Plus от Stem Cell Technologies (каталожный № 5825). Пожалуйста, следуйте рекомендациям поставщика по хранению.

Что такое ингибитор ROCK Y27632?

Ингибитор ROCK Y27632 представляет собой селективный ингибитор Rho-ассоциированной киназы p160 ROCK. Лечение ингибитором ROCK Y27632 предотвращает индуцированный диссоциацией апоптоз эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), повышая выживаемость и сохраняя плюрипотентность во время субкультивирования и размораживания hESC и hiPSC. Также было показано, что ингибитор ROCK Y27632 повышает выживаемость стволовых клеток во время криоконсервации. Обратите внимание, что аликвоты ингибитора горных пород чувствительны к свету и повторяющимся циклам замораживания-оттаивания. Обязательно используйте эти аликвоты в течение срока годности, рекомендованного поставщиком.

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

12. Сбор и уход за чЭСК/ИПСК

1. На следующий день после оттаивания клеток посмотрите на них под микроскопом, чтобы определить выживаемость. ПРИМЕЧАНИЕ: нормально наблюдать большое количество неприкрепленных ячеек. Пока некоторые клетки прикреплены, из них могут возникнуть колонии в течение 3-7 дней.
2. Удалите носители из лунок и пипеткой по 2 мл (для 6-луночного, 1 мл для 12-луночного и 0.5 мл для 24-луночного планшета) свежей и теплой среды PSC на лунку. Верните пластину в инкубатор.
3. Клетки подпитывают до 60-70% конфлюэнтности (следуйте рекомендациям поставщика).
4. Начиная со 2-го дня за клетками следует наблюдать и очищать их от любых дифференцированных клеток, которые могут расти.
5. Чтобы очистить клетки, используйте колпак и соскребите дифференцированные клетки с наконечником пипетки.
6. После очистки клеток измените средства массовой информации, как описано выше.

(См. Замораживание чЭСК/ИПСК или Передача чЭСК/ИПСК)

ПРИМЕЧАНИЕ:

Было установлено, что среда PSC более эффективна в гипоксической среде. Мы также заметили, что при выращивании клеток в гипоксических инкубаторах происходит меньшая дифференциация по сравнению с нормоксическими. Наконец, засеянные клетки имеют лучшую выживаемость при использовании гипоксического инкубатора.

Нормоксик: 37°С, 21% О₂, 5% CO₂

Гипоксия: 37°С, 5%О₂, 10% CO₂

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

13. Прохождение чЭСК/ИПСК

1. Добавьте 2 мл среды PSC в 6-луночный планшет, покрытый матригелем, и отложите в сторону.
2. Возьмите планшет для пассирования и удалите среду из лунки и промойте один раз 1 мл PBS (-/-).
3. Добавьте в лунку 1 мл раствора ЭДТА и оставьте на 3-4 минуты при комнатной температуре. Не перемещайте пластину, так как клетки могут начать отсоединяться.
4. Удалите раствор ЭДТА и добавьте 1 мл среды PSC. Не оставляйте ЭДТА на клетках более чем на 4 минуты, так как это приведет к отрыву клеток.
5. Соскоблите клетки с помощью клеточного скребка и разделите клетки между 6 лунками планшета, содержащими среду PSC. Избегайте чрезмерного разрушения частей колонии и старайтесь осторожно соскабливать. Старайтесь держать клетки большими кусками. При необходимости используйте наконечник пипетки с широким горлышком, чтобы разбить комки. Чрезмерное разрушение клеток может вызвать гибель клеток или чрезмерную спонтанную дифференцировку после пассирования.
6. Инкубировать в 37 лет°C после равномерного распределения клеток в каждой лунке (встряхивание в форме 8 или L). Избегайте нарушения планшета в течение 24 часов после пассирования.

ЗАМЕТКА: После того, как клетки были соскоблины, вы хотите перенести их на новый планшет как можно скорее, потому что клетки быстро прикрепятся (в течение 5 минут).

Если ЭДТА оставить на клетках более чем на 4 минуты, клетки могут начать отделяться. Если это произойдет, просто соберите клетки в 15 мл сокола с 4 мл среды PSC. Спиновые клетки при 130 rcf в течение 5 минут. Ресуспендируйте осадок с 1 мл среды и равномерно распределите по 6-луночному планшету, покрытому матригелем (160 мкл на лунку).

Раствор ЭДТА: добавьте 500 мкл 0.5 М ЭДТА (pH 8.0) в 500 мл DPBS (-/-). Добавьте 0.9 г NaCl. Отфильтруйте раствор для стерилизации и храните его при температуре 4°C до 6 месяцев.

Из статьи:

Пассирование и размножение колоний человеческих плюрипотентных стволовых клеток путем ферментативной диссоциации в химически определенных условиях культивирования

Жанетт Бирс,¹ Даниэль Р. Гулбрансон,^2,3 Николь Джордж,⁴Лорен И. Синискальки,¹ Джеффри Джонс,^4,5 Джеймс А. Томсон,^2,3,6 и Гуокай Чен^1,2

14. Замораживание чЭСК/ИПСК

1. Включите функцию Bio-Cool (морозильная камера с регулируемой скоростью) и отрегулируйте температуру до -7°C.
2. Удалите клетки из инкубатора и наблюдайте слияние и морфологию под микроскопом.
3. Если лунки конфлюэнтны на 70%, удалите старые среды и промойте один раз PBS (-/-), затем добавьте 1 мл раствора ЭДТА (см. переход с раствором ЭДТА) на лунку.
4. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3-4 минут.
5. Аспирируйте раствор ЭДТА и добавьте 1 мл холодной среды mFreSR (номер по каталогу 05855, Stem Cell Technologies).
6. Используйте скребок для клеток, чтобы осторожно поднять клетки. Держите клетки как можно больше большими кусками и избегайте пипетирования вверх и вниз.
7. Перенесите клетки/mFreSR в криотрубку с помощью широкого наконечника рта. Держите флаконы на льду, пока не будете готовы к шагу 8.
8. Поместите пробирки в Bio-Cool и инкубируйте в течение 10 минут.
9. Получите жидкий азот.
10. Через 10 минут посейте клетки, окунув шпатель в жидкий азот и прикасаясь к стенке криопробирки примерно на 10–30 секунд или пока не увидите кристаллическую форму на стенке криопробирки.
11. Запустите программу 1, нажав кнопку «PROG» и пройдя программу, снова нажав кнопку, и вы должны увидеть скорость 0.5°C/мин. , затем нажмите «ВЫПОЛНИТЬ».
12. Когда температура достигает -65°C, криопробирки можно переносить и хранить в жидком азоте.

альтернативы

Другой вариант — поместить криопробирки в контейнер для замораживания (Biocision-CoolCell) и хранить при температуре -80°C в течение ночи. Переместите криопробирки в жидкий азот (жидкую или паровую фазу) на следующий день.

Доктор Уильям Стэнфорд-2022