Induced Pluripotent
תאי גזע
קרן מחקר פרוג'ריה לתא ורקמות
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (iPSC)
- Progeria iPSCs מידע רקע למי שאינו מדען
- מטרה של יצירת והפצה של תאי גזע פלוריפוטנטיים על ידי קרן המחקר פרוג'ריה
- יצירת תאי גזע בעלי תסמונת האצ'ינסון-גילפורד פרוגריה המושרים-פלוריפוטנטיים (iPSCs)
- בקרת איכות: אימות ואפיון
- חומר מוצא מקורי שממנו נגזרו iPSCs
- הצטרף לרשימת הדוא"ל שלנו לעדכוני iPSC עתידיים וקווי סלולרי חדשים
- שאלות? צור איתנו קשר.
- הזמנת קווי iPSC
- הכנת HGPS ו-Control iPSC Culture Media
- הכנת צלחות מטריג'ל
- הפשרת תאי hESCs ו-iPSCs (לכל בקבוקון קריו)
- קציר וטיפול ב-hESC/iPSC
- מעבר hESC/iPSC
- הקפאת hESC/iPSC
1. מידע רקע של iPSC למי שאינו מדען
תאי גזע הם תאים "בוסרים" שעדיין לא התחייבו להפוך לסוג תא אחד. הם גמישים מכיוון שיש להם פוטנציאל להתפתח לסוגים רבים ושונים של תאים בוגרים בגוף, כגון תאים המרכיבים את הלב או כלי הדם, ורקמות ואיברים אחרים. בשנת 2007, חוקרים גילו אסטרטגיה ליצירת תאי גזע במעבדה על ידי תכנות מחדש של תאים בוגרים בוגרים שאנו נוהגים לגדל למטרות מחקר.1, 2 . תאי גזע אלה שנוצרו באופן מלאכותי נקראים תאי גזע מושרים פלוריפוטנטיים ("iPSCs"). עבור תחום פרוגריה מדובר בפריצת דרך ענקית. בפעם הראשונה, מדענים יכולים כעת לייצר תאי גזע של פרוגריה ולשאול שאלות על איך תאי גזע מתפקדים ומתפתחים בפרוגריה. בעבר לא היה מקור לתאי גזע פרוגריה אנושיים, ולכן היה ריק של מידע על אופן פעולת תאי הגזע של פרוגריה בהשוואה לתאי גזע של אנשים ללא פרוגריה. בנוסף, מדענים יכולים לתכנת מחדש את תאי הגזע של פרוגריה ליצור, בפעם הראשונה, כלי דם בוגרים של פרוגריה, תאי לב וסוגי תאים אחרים. עד כה, לא היה מקור לתאי לב פרוגריה אנושיים או כלי דם. עכשיו אנחנו יכולים לשאול מפתח שאלות על מחלת הלב שמובילה למוות מוקדם בפרוג'ריה מהתקפי לב ושבץ מוחי. אנו יכולים להשוות את התגליות הללו למחלות לב והזדקנות באוכלוסיה הכללית ולגלות עוד מה משפיע על ההזדקנות בכולנו. כבר פורסמו כמה מחקרים מצוינים באמצעות תאי גזע פרוגריה.3-5 המטרה שלנו ב-Progeria Research Foundation היא להקל על תגליות רבות נוספות באמצעות כלי חשוב זה. לפריימר על תאי גזע, ראה אתר זה של ממשלת ארה"ב: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm
-
- Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. אינדוקציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מפיברובלסטים אנושיים בוגרים על ידי גורמים מוגדרים. תָא. 2007;131:861-872.
- יו J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים מתאי גזע אנושיים. מַדָע. 2007;318:1917-1920.
- Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3, Izpisua Belmonte JC. סיכום של הזדקנות מוקדמת עם iPSCs מתסמונת פרוגריה של Hutchinson-Gilford. טֶבַע. 2011;472:221-225.
- iPSCs שמקורם ב-Misteli T. HGPS לעידנים. תא גזע של תא. 2011;8:4-6.
2. מטרת ייצור והפצה של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) על ידי The Progeria Research Foundation
המשימה של קרן המחקר פרוגריה היא לגלות את הטיפולים ואת התרופה לתסמונת האצ'ינסון-גילפורד פרוגריה ולהפרעות הקשורות להזדקנות שלה. בשנת 2009, PRF נכנס לשיתוף פעולה עם צוות מומחים של מדענים מאוניברסיטת טורונטו, קנדה, בהנחייתו של ויליאם סטנפורד, דוקטורט, כדי ליצור Progeria iPSCs באיכות גבוהה. ד"ר סטנפורד הוא יו"ר קנדה למחקר בביולוגיה אינטגרטיבית של תאי גזע. החל משנת 2011, PRF ממשיך לשתף פעולה עם ד"ר סטנפורד באוניברסיטת אוטווה, קנדה, שם הוא פרופסור לרפואה סלולרית ומולקולרית, הפקולטה לרפואה, ומדען בכיר במרכז Sprott לחקר תאי גזע של בית החולים אוטווה.
המטרה שלנו היא לספק כלי יקר ערך זה לחוקרים ברחבי העולם. כלי מחקר חדש זה ישמש ליצירת מחקר חדש וחדשני בפרוגריה, כמו גם את הקשר שלו למחלות לב ולהזדקנות.
3. יצירת תאי גזע בעלי תסמונת האצ'ינסון-גילפורד פרוגריה המושרים-פלוריפוטנטיים (iPSCs)
תאי גזע מושרים-פלוריפוטנטיים (iPSCs) נגזרו באמצעות התמרה רטרו-ויראלית בעלת פסאודוטייפ VSVG של ארבעה גורמים אנושיים, Oct4, Sox2, Klf4 ו-c-Myc לתוך פיברובלסטים. מושבות iPSC נגזרו על פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs). ההליך בו נעשה שימוש היה בעיקרו כפי שתואר קודם לכן, אך ללא שימוש בכתב ה-EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009).
4. בקרת איכות: אימות ואפיון
השורות הזמינות כעת עברו מספר שלבי אימות (ראה קובצי PDF להורדה למטה):
-
- בדיקת מיקופלזמה עבור כל קו: המעבדה של ד"ר סטנפורד ביצעה ניתוח מיקופלזמה על ידי PCR עבור כל שורת תאים. בנוסף, לאחר הרחבה ולפני שילוח תאים, הקווים ייבדקו מחדש לאיתור מיקופלזמה.
- צביעת אימונו עבור סמני פלריפוטנטיות Tra-1-60, Tra-1-81 ו-SSEA4.
- צביעת פוספטאז אלקליין כאינדיקטור לפלוריפוטנטיות
- היווצרות גוף עוברי ולאחר מכן צביעה חיסונית עבור סמנים של שלוש שכבות הנבט. הסמנים שנבדקו היו βIII-Tubulin (Ectoderm), Actin-Smooth Muscle (Mesoderm) ו-Gata4 או AFP (Endoderm)
- ניתוח קריוטיפ.
- ביטוי מחדש של lamin A בתאים מובחנים
- מבחני טרטומה
אימות נוסף בתהליך:
קווים מסוימים השלימו מבחני טרטומה כפי שמוצג בנתונים התומכים. עבור כל שאר הקווים, מבחני טרטומה נמצאים בתהליך והסטטוס יתעדכן עם השלמת מבחני אלה.
5. חומר מוצא מקורי שממנו נגזרו תאי iPS אלו
iPSCs נגזרו משורות תאים פיברובלסטים ללא טרנספורמציה של PRF Cell & Tissue Bank.
שיטת ההמרה ששימשה עבור כל קווי ה-iPS הייתה Retrovirus MKOS.
מזהה קו iPSC | מוּטָצִיָה | מגדר וגיל תרומות | סוג תא מקורי לחץ כאן. | נתונים תומכים |
---|---|---|---|---|
HGADFN003 iPS 1B | LMNAExon 11, 1824 C>T | זכר בן שנתיים 0 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGADFN003 | 003 iPS1B |
HGADFN003 iPS 1C | LMNA Exon 11, 1824 C>T | זכר בן שנתיים 0 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGADFN003 | 003 iPS1C |
HGDFN003 iPS 1D | LMNA Exon 11, 1824 C>T | זכר בן שנתיים 0 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGADFN003 | 003 iPS1D |
HGADFN167 iPS 1J | LMNA Exon 11, 1824 C>T | זכר בן 8 שנים 5 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGADFN167 | 167 PS 1J |
HGADFN167 iPS 1Q | LMNA Exon 11, 1824 C>T | זכר בן 8 שנים 5 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGADFN167 | 167 iPS1Q |
HGMDFN090 iPS 1B | אמא של HGADFN167 (לא מושפעת) | נקבה בת 37, 10 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGMDFN090 | 090 iPS1B |
HGMDFN090 iPS 1C | אמא של HGADFN167 (לא מושפעת) | נקבה בת 37, 10 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGMDFN090 | 090 iPS1C |
HGFDFN168 iPS1 D2 | אביו של HGADFN167 (לא מושפע) | זכר בן 40 5 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGFDFN168 | 168 iPS1 D2 |
HGFDFN168 iPS1P | אביו של HGADFN167 (לא מושפע) | זכר בן 40 5 חודשים | פיברובלסטים דרמליים HGFDFN168 | 168 iPS1P |
6. הצטרף לרשימת הדוא"ל שלנו לעדכוני iPSC עתידיים וקווי סלולרי חדשים
אנו ממשיכים לייצר קווי iPSC. אם תרצה עדכונים תקופתיים על iPSCs המוחזקים ב-PRF Cell & Tissue Bank, אנא הצטרף לרשימת הדוא"ל שלנו על ידי לחיצה כָּאן
7. שאלות?
אנא צור קשר עם לסלי גורדון, MD, PhD, מנהל רפואי, בכל שאלה או צורך, בכתובת lgordon@progeriaresearch.org או 978-535-2594
8. הזמנת קווי סלולרי iPS
בשנת 2014, PRF הנהיג מדיניות ללא שינויים ב-MTA שלנו. זוהי תוצאה של 12 שנים של הסדרים חוזיים עם 70 צוותי מחקר העובדים במוסדות ב-14 מדינות. PRF ויועציו לקחו בחשבון את הסוגיות שעלו באותה פרק זמן וערכו את ההסכם בהתאם, והביאו למה שאנו חושבים שהם תנאים הוגנים והגיוניים.
למוסדות ממשלתיים פדרליים בארה"ב או לשאלות, אנא צור קשר עם וונדי נוריס בכתובת: wnorris@brownhealth.org אוֹ 401
שלב 1: השלם יישום והסכם העברת חומרים
בקשה והסכם למוסדות לא ממשלתיים
הסכם העברת חומר למוסדות לא ממשלתיים
שלב 2: החזר את הבקשה המלאה ואת הסכם העברת החומר לוונדי נוריס בכתובת wnorris@brownhealth.org. לאחר האישור, תקבל אימייל המאשר את הזמנתך ותאריך המשלוח הצפוי.
שלב 3: המעבדה של ד"ר סטנפורד מפיצה כיום קווים בקוביות קפואות. המעבדה שלו תשלח לך דוא"ל כאשר התרבית נשלחה, עם מידע על משלוח ומעקב. חוקרים חסרי ניסיון מופנים לקבל הכשרה בקורסים מיוחדים החיוניים לעבודת תאי גזע עובריים/iPSCs אנושיים.
מתקן תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים (בהנהלת ד"ר סטנפורד) במכון המחקר של בית החולים אוטווה מציע הכשרה וירטואלית אחד על אחד על יסודות של טכניקות תרבות iPSC הספציפיות לקווי התאים Progeria iPSC. אפשרויות ההדרכה והפורמט גמישים בהתאם לרמת הניסיון של המדענים. למידע נוסף, אנא שלח דוא"ל לhpscf@ohri.ca.
שלב 4: אוניברסיטת אוטווה תחייב אותך ישירות עבור כל קו iPSC בתוספת עלויות שליח, אם יש כאלה.
9. HGPS ו-Control iPS Cell Culture Media הכנת מדיה
יש להזין את iPSC ו-ESC עם mTeSR Plus מ-Stem Cell Technologies (cat# 5825). אנא עקבו אחר המלצות הספק לאחסון.
10. הכנת צלחות מטריג'ל
פֶּתֶק: כל השלבים הכרוכים במטריג'ל צריכים להיעשות מהר ככל האפשר ולהישאר קר ככל האפשר.
- להפשיר בקבוק מטריגל ב-4°ג. בדוק את תעודת הניתוח על אותו מגרש כדי למצוא את ריכוז החלבון שלו.
- הוסף מספיק מדיית DMEM/F12 קרה למטריג'ל המופשר כדי להגיע לריכוז סופי של 5mg/mL.
- הכינו מנות של 1 מ"ל של המטריגל המוכן משלב 2 בצינורות בז 15 מ"ל מצוננים מראש.
- הקפיאו ואחסנו את כל המנות ב-20-°ג.
- להכנת צלחות מטריגל, הסר מנה אחת של מטריגל (1 מ"ל) מ-20°C והוסיפו 10 מ"ל של DMEM/F12 קר. מערבבים היטב עד שהגלולה מפשירה (מבלי ליצור בועות, ותמיד שומרים על התמיסה קרה).
- העבירו לצינור של 50 מ"ל, ולאחר מכן הוסיפו 20 מ"ל של DMEM/F12 קר (1 מ"ל של מנת מטריגל מדולל ב-30 מ"ל של DMEM/F12), מערבבים היטב.
- צלחת (1 מ"ל/באר עבור צלחת 6 באר, 0.5 מ"ל/באר עבור צלחת 12 באר, 0.25 מ"ל/באר עבור צלחת 24 באר). ודא שהתמיסה מכסה את כל שטח הפנים על ידי ניעור הצלחת בעדינות. אין להקפיא מחדש את שאריות המטריגל.
- אם משתמשים בצלחת מיד, הניחו לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת (או 30 דקות ב-37°ג), התבונן במטריג'ל מתחת למיקרוסקופ. מטריג'ל צריך להיות מפוזר היטב ולא "גושי".
- אם משתמשים בצלחות במועד אחר, עטפו את קצה הצלחת בפרפילם ואחסנו ב-4°C עד שבועיים.
מטריגל – BD/Fisher, cat#CB-40230
DMEM/F12 – Life Technologies, cat#11330-057
ד"ר וויליאם סטנפורד-2022
11. הפשרת תאי ES או iPS (לכל בקבוקון קריו)
- קחו צלחת מטריגל מ-4 מעלות צלזיוס וחממו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, או הכינו צלחת מטריגל טרייה (ראה פרוטוקול הכנת צלחת מטריגל).
- מחממים 4 מ"ל של mTeSR Plus בשפופרת פלקון של 15 מ"ל.
- הסר תאים ממיכל החנקן הנוזלי וסובב באמבט 37 מעלות צלזיוס עד שנותר רק גוש קרח קטן. הבקבוקון אמור להפשיר תוך 1-2 דקות. שלב זה חייב להיעשות במהירות.
- צינור תא אתנול וצינור מדיה בז ומניחים במכסה המנוע.
- השתמש ב-1 מ"ל קצה פה רחב עד לאט הוסף תאים ל-4 מ"ל של מדיה שחוממת מראש (הימנע מערבוב תרחיף תאים).
- סובב ב-130 rcf למשך 5 דקות.
- הסר את הסופרנטנט.
- הוסף 2 מ"ל של מדיה PSC, ועם קצה פה רחב לפרק גושים בעדינות. העברת מדיה לבאר אחת של צלחת 6 היטב להוסיף 2uL של מעכב ROCK (Y27632, ריכוז סופי של 10uM). צלחת לתוך מטריגל אחד מצופה היטב (של צלחת 6 באר).
- סלעים את התאים בעדינות לפיזור שווה של התאים, ומניחים באינקובטור היפוקסי (5%O2, 10% CO2). הימנע מהפרעה בצלחת במשך 24 שעות לאחר הזרעה.
פֶּתֶק: חשוב מאוד להימנע מפירוק מוגזם של גושים או פיפטציה אגרסיבית. זה יכול להפחית משמעותית את שיעור ההישרדות. התאים צריכים להישאר בנתחים של 100-300 תאים גדולים בזמן הזריעה. בעודך עדין, נסה לעבוד במהירות לאחר שהתאים מופשרים כדי למזער את הזמן שהם במגע עם חומר מגן קריו.
- הסר את המדיה לאחר 24 שעות והוסף 2 מ"ל של מדיה PSC (עבור 6 באר, 1 מ"ל עבור 12 באר ו-0.5 מ"ל עבור צלחת 24 באר). ראה קציר וטיפול בפרוטוקול hESC/iPSC.
מדיה PSC
mTeSR Plus מבית Stem Cell Technologies (cat# 5825). אנא עקבו אחר המלצות הספק לאחסון.
מהו מעכב ROCK Y27632?
ROCK Inhibitor Y27632 הוא מעכב סלקטיבי של הקינאז p160 ROCK הקשור ל-Rho. טיפול עם ROCK Inhibitor Y27632 מונע אפופטוזיס המושרה על ידי דיסוציאציה של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC), מגביר את שיעור ההישרדות ושמירה על פלוריפוטנטיות במהלך תת-טיפוח והפשרה של hESCs ו-hiPSCs. מעכב ROCK Y27632 גם הוכח כמשפר את שיעור ההישרדות של תאי גזע במהלך שימור הקפאה. שימו לב כי מנות מעכבי סלע רגישות לאור ולמחזורי הפשרה חוזרים של הקפאה. הקפד להשתמש במנות אלה בתוך חיי המדף המומלצים של הספק.
ד"ר וויליאם סטנפורד-2022
12. קציר וטיפול ב-hESC/iPSC
- יום אחרי שהתאים הופשרו, תסתכל עליהם מתחת למיקרוסקופ כדי לקבוע את שיעור ההישרדות. הערה: זה נורמלי לראות מספר גבוה של תאים לא מחוברים. כל עוד כמה תאים מחוברים, מושבות יכולות להיווצר מהם תוך 3 - 7 ימים.
- הסר מדיה מהבארות ופפטט 2 מ"ל (עבור 6 באר, 1 מ"ל עבור 12 באר ו-0.5 מ"ל עבור צלחת 24 בארות) של מדיה PSC טרייה וחמה לכל באר. החזר את הצלחת לאינקובטור.
- תאים מוזנים עד לחיבור 60-70% (עקוב אחר המלצות הספק).
- החל מהיום השני, יש לצפות בתאים ולנקות אותם מכל תאים מובחנים שעלולים לגדול.
- כדי לנקות תאים, השתמש במנדף הקטיף וגרד תאים מובחנים בעזרת קצה פיפטה.
- לאחר ניקוי התאים, החלף מדיה כפי שנעשה בשלבים לעיל.
(ראה הקפאת hESC/iPSC או העברת hESC/iPSC)
פֶּתֶק:
מדיה PSC נקבעה כיעילה יותר בסביבה היפוקסית. ראינו גם שפחות התמיינות מתרחשת כאשר מגדלים תאים באינקובטורים היפוקסיים לעומת נורמוקסיים. לבסוף, לתאי זרע יש שיעור הישרדות טוב יותר בעת שימוש באינקובטור היפוקסי.
נורמוקסית: 37°C, 21% O2, 5% CO2
היפוקסי: 37°C, 5%O2, 10% CO2
ד"ר וויליאם סטנפורד-2022
13. עובר את hESC/iPSC
- הוסף 2 מ"ל של מדיה PSC לצלחת מצופה מטריגל 6 היטב והניח בצד.
- קח את הצלחת למעבר והסר את המדיה מהבאר ושטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS (-/-).
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת EDTA לבאר והשאיר למשך 3-4 דקות בטמפרטורת החדר. אל תזיז את הצלחת מכיוון שתאים יכולים להתחיל להתנתק.
- הסר תמיסת EDTA והוסף 1 מ"ל של מדיה PSC. אל תשאיר את EDTA על התאים במשך יותר מ-4 דקות מכיוון שהדבר יגרום לתאים להתרומם.
- גרד תאים באמצעות מגרד תאים וחלק את התאים בין 6 בארות הצלחת שלך המכילה מדיה PSC. הימנע מפירוק מוגזם של חלקי המושבה, ונסו להיות עדינים עם גרידה. נסה לשמור על תאים בנתחים גדולים. השתמש בקצה פיפטה רחב כדי לשבור גושים במידת הצורך. פירוק מוגזם של תאים עלול לגרום למוות של תאים או להתמיינות ספונטנית מוגזמת בעקבות מעבר.
- דגירה בגיל 37°C לאחר פיזור שווה של תאים בכל באר (רועד בצורת 8 דמויות או L). הימנע מהפרעה בצלחת במשך 24 שעות לאחר המעבר.
פֶּתֶק: לאחר גירוד התאים אתה רוצה להעביר אותם לצלחת החדשה בהקדם האפשרי כי התאים יתחברו מחדש במהירות (תוך 5 דקות).
אם EDTA נשאר על התאים במשך יותר מ-4 דקות, התאים יכולים להתחיל להתנתק. אם זה קורה, פשוט אסוף את התאים בבז 15 מ"ל עם 4 מ"ל של מדיה PSC. סובב תאים ב-130 rcf למשך 5 דקות. השהה מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של מדיה וחלק באופן שווה בין צלחת מצופה מטריגל 6 באר (160uL לבאר).
פתרון EDTA: הוסף 500uL של 0.5M EDTA (pH 8.0) לתוך 500mL של DPBS (-/-). הוסף 0.9 גרם של NaCl. סנן את התמיסה לעיקור ואחסן אותה ב-4 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
מתוך העיתון:
מעבר והרחבת מושבה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי פירוק ללא אנזים בתנאי תרבות מוגדרים כימית
ג'נט בירס,1 דניאל ר' גולברנסון,2,3 ניקול ג'ורג',4לורן I. Siniscalchi,1 ג'פרי ג'ונס,4,5 ג'יימס א. תומסון,2,3,6 ו גווקאי צ'ן1,2
14. הקפאת hESC/iPSC
- הפעל את Bio-Cool (מקפיא קצב מבוקר) והתאם את הטמפרטורה ל-7°C.
- הסר תאים מהאינקובטור וצפה בריכוז ובמורפולוגיה מתחת למיקרוסקופ.
- אם בארות 70% מתכנסות, הסר חומר ישן ושטוף פעם אחת עם PBS(-/-) ואז הוסף 1 מ"ל של תמיסת EDTA (ראה מעבר עם תמיסת EDTA) לכל באר.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3-4 דקות.
- שאפו את תמיסת ה-EDTA והוסיפו 1 מ"ל של מדיה mFreSR קרה (cat#05855, Stem Cell Technologies).
- השתמש במגרד תאים כדי להרים את התאים בעדינות. שמור תאים בנתחים גדולים ככל האפשר והימנע מפיפטינג למעלה ולמטה.
- העברת תאים/mFreSR ל-criotube באמצעות קצה פה רחב. שמור את הבקבוקונים על קרח עד שאתה מוכן לשלב 8.
- מניחים צינורות ב-Bio-Cool ודגגרים במשך 10 דקות.
- קבל חנקן נוזלי.
- לאחר 10 דקות, זרעו את התאים על ידי טבילת מרית בחנקן נוזלי ונגיעה בצד בקבוקון ה-Cryo-Vial למשך כ 10-30 שניות או עד שתראה צורת גביש בצד ה-Cryo-Vial.
- התחל תוכנית 1 על ידי לחיצה על כפתור "PROG" ומעבר על התוכנית על ידי לחיצה נוספת על הלחצן ואתה אמור לראות את הקצב של 0.5°C/min. , ולאחר מכן הקש "RUN".
- ברגע שהטמפרטורה מגיעה ל-65 מעלות צלזיוס ניתן להעביר את צינורות הקריו ולאחסן אותם בחנקן נוזלי.
אלטרנטיבות
אפשרות נוספת היא להניח את ה-cryo-tubes במיכל הקפאה (Biocision-CoolCell) ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. העבר את צינורות הקריו לחנקן נוזלי (שלב נוזלי או אדים) ביום שלמחרת.
ד"ר וויליאם סטנפורד-2022