淋巴母细胞培养方案

生长培养基

RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% 胎牛血清 (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) 青霉素-链霉素（可选）– ThermoFisher #15140-122

一般说明

• 生长培养基应始终在 37°C、5% CO 的培养箱中保持平衡₂ 使用前 30 分钟
• 务必使用带通风盖的烧瓶
• 始终将烧瓶直立放置
• T25 烧瓶中的用量不应超过 20 毫升

解冻冷冻细胞

冷冻细胞将以 1 毫升等分试样的形式存放在干冰上。如果不立即开始培养，请将细胞冷冻直至解冻用于细胞培养或放入液氮储存中。但是，如果您要储存细胞以备后用，建议您培养新鲜细胞并冷冻多个安瓿瓶。细胞冷冻保存在 45% RPMI-1640、50% FBS 和 5% DMSO（组织培养级）中。

1. 1. 将 10 毫升 RPMI-1640、15% 胎牛血清 (FBS) 和±抗生素放入带有通气盖的 T-25 烧瓶中。
   2. 让培养基在 37°C 加湿培养箱中与 5% CO₂ 将培养瓶置于空气中 30 分钟。培养瓶应直立放置。
   3. 将每个安瓿瓶或小瓶冷冻细胞逐一放入 37°C 水浴中或烧杯中温水中解冻。
   4. 使用 70% 乙醇快速清洁安瓿瓶或小瓶的外部。如果细胞装在玻璃安瓿瓶中，请小心打破安瓿瓶，确保手指不被碎玻璃划伤。
   5. 用无菌吸管取出 1 ml 冷冻细胞，放入装有 10 ml 培养基的 T-25 培养瓶中。清晰标记培养瓶以识别每个细胞系。
   6. 将培养瓶放入 37°C 加湿培养箱中，加入 5% CO₂ 在空气中。培养瓶应直立放置。
   7. 24 小时后，从顶部除去 5 毫升培养基（不要打扰沉淀在烧瓶底部的淋巴细胞），并用 5 毫升预热的培养基替换。
   8. 继续进行淋巴母细胞培养方案。

淋巴母细胞培养

1. 1. 解冻后三至四天计数细胞。细胞不粘附且成团生长。轻轻移液即可打散团块。
   2. 计数细胞。
   3. 理想情况下，细胞浓度不应超过 2 x 10⁶ 细胞/毫升
   4. 根据细胞浓度重新补料、分裂或冷冻细胞。
   5. 通过添加 5-6 毫升平衡生长培养基进行重新喂养。
   6. 接种新培养物，接种量不少于 2 x 10⁵ 细胞/毫升
   7. 细胞应冷冻在约 5 x 10⁶ 细胞/毫升。遵循细胞冷冻方案。

冷冻淋巴母细胞

1. 1. 细胞应冷冻在约 5 x 10⁶ 细胞/毫升
   2. 将适量细胞转移至15或50毫升锥形管中。
   3. 在 4°C 下以 100 xg 的速度离心 10 分钟。
   4. 除去培养基并重新悬浮于适当体积的冷冷冻培养基中。
   5. 将每个 1 毫升细胞转移至冷冻管中。
   6. 将冷冻管放入冷冻室，并将冷冻室放入-80°C 冰箱中冷冻过夜。
   7. 第二天将冷冻小管转移到液氮中。

温迪·诺里斯