Pluripotente induzido
Células-tronco
Banco de células e tecidos da Progeria Research Foundation
Células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC)
- iPSCs de Progéria Informações básicas para o não cientista
- Propósito de Geração e distribuição de células-tronco pluripotentes induzidas pela The Progeria Research Foundation
- Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria (iPSCs)
- Controle de Qualidade: Validação e Caracterização
- Material inicial original do qual os iPSCs foram derivados
- Junte-se à nossa lista de e-mail para atualizações futuras do iPSC e novas linhas de células
- Dúvidas? Entre em contato conosco.
- Encomendando linhas iPSC
- Preparação de meios de cultura HGPS e iPSC de controle
- Preparando placas de Matrigel
- Descongelamento de células hESCs e iPSCs (por crio-frasco)
- Colheita e cuidados com hESC/iPSC
- Passagem hESC/iPSC
- Congelamento de hESC/iPSC
1. Informações básicas do iPSC para o não cientista
Células-tronco são células “imaturas” que ainda não se comprometeram a se tornar nenhum tipo de célula. Elas são flexíveis porque têm o potencial de se desenvolver em muitos tipos diferentes de células maduras no corpo, como células que compõem o coração ou os vasos sanguíneos, e outros tecidos e órgãos. Em 2007, pesquisadores descobriram uma estratégia para criar células-tronco em laboratório reprogramando células adultas maduras que normalmente cultivamos para fins de pesquisa.1, 2 . Essas células-tronco criadas artificialmente são chamadas de Células-tronco Pluripotentes Induzidas (“iPSCs”). Para o campo da Progeria, este é um grande avanço. Pela primeira vez, os cientistas agora podem fazer células-tronco de Progeria e fazer perguntas sobre como as células-tronco funcionam e se desenvolvem na Progeria. Anteriormente, não havia nenhuma fonte de células-tronco humanas de Progeria e, portanto, havia um vazio de informações sobre como as células-tronco de Progeria funcionam em comparação com células-tronco de pessoas sem Progeria. Além disso, os cientistas podem reprogramar as células-tronco de Progeria para criar, pela primeira vez, vasos sanguíneos maduros de Progeria, células cardíacas e outros tipos de células. Até agora, não havia nenhuma fonte de células cardíacas ou de vasos sanguíneos de Progeria humana. Agora podemos pedir a chave perguntas sobre a doença cardíaca que leva à morte precoce na Progéria por ataques cardíacos e derrames. Podemos comparar essas descobertas com a doença cardíaca e o envelhecimento na população em geral e descobrir mais sobre o que influencia o envelhecimento em todos nós. Já houve vários estudos excelentes publicados usando células-tronco da Progéria.3-5 Nosso objetivo na The Progeria Research Foundation é facilitar muito mais descobertas usando esta ferramenta inestimável. Para uma cartilha sobre células-tronco, consulte este site do governo dos EUA: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm
-
- Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Indução de células-tronco pluripotentes de fibroblastos humanos adultos por fatores definidos. Célula. 2007;131:861-872.
- Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. Linhas de células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de células somáticas humanas. Ciência. 2007;318:1917-1920.
- Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3rd, Izpisua Belmonte JC. Recapitulação do envelhecimento prematuro com iPSCs da síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford. Natureza. 2011;472:221-225.
- Misteli T. iPSCs derivados de HGPS para todas as eras. Célula Célula-tronco. 2011;8:4-6.
2. Objetivo da geração e distribuição de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) pela The Progeria Research Foundation
A missão da The Progeria Research Foundation é descobrir tratamentos e a cura para a Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford e seus distúrbios relacionados ao envelhecimento. Em 2009, a PRF entrou em colaboração com uma equipe de cientistas especialistas da Universidade de Toronto, Canadá, sob a direção de William Stanford, PhD, para gerar iPSCs de Progeria de alta qualidade. O Dr. Stanford é o Canada Research Chair em Biologia Integrativa de Células-Tronco. A partir de 2011, a PRF continua a colaborar com o Dr. Stanford na Universidade de Ottawa, Canadá, onde ele é Professor de Medicina Celular e Molecular, Faculdade de Medicina e Cientista Sênior no Sprott Centre for Stem Cell Research do Ottawa Hospital Research Institute.
Nosso objetivo é fornecer esta ferramenta inestimável para pesquisadores em todo o mundo. Esta nova ferramenta de pesquisa será usada para gerar pesquisas novas e inovadoras em Progeria, bem como sua relação com doenças cardíacas e envelhecimento.
3. Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria (iPSCs)
Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram derivadas usando transdução retroviral pseudotipada por VSVG de quatro fatores humanos, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc em fibroblastos. Colônias de iPSC foram derivadas em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs). O procedimento usado foi essencialmente como descrito anteriormente, mas sem o uso do repórter EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009).
4. Controle de Qualidade: Validação e Caracterização
As linhas atualmente disponíveis passaram por diversas etapas de validação (veja os PDFs para download abaixo):
-
- Teste de Mycoplasma para cada linha: O laboratório do Dr. Stanford realizou análise de micoplasma por PCR para cada linha celular. Além disso, após a expansão e antes do envio das células, as linhas serão testadas novamente para micoplasma.
- Imunocoloração para marcadores de pluripotência Tra-1-60, Tra-1-81 e SSEA4.
- Coloração de fosfatase alcalina como indicador de pluripotência
- Formação do corpo embrionário e subsequente imunocoloração para marcadores das três camadas germinativas. Os marcadores testados foram βIII-Tubulina (Ectoderma), Actina de Músculo Liso (Mesoderma) e Gata4 ou AFP (Endoderma)
- Análise de cariótipo.
- Reexpressão da lâmina A em células diferenciadas
- Ensaios de teratoma
Validação adicional em andamento:
Algumas linhas concluíram ensaios de teratoma, conforme mostrado nos dados de suporte. Para todas as outras linhas, os ensaios de teratoma estão em andamento e o status será atualizado conforme esses ensaios forem concluídos.
5. Material inicial original do qual essas células iPS foram derivadas
As iPSCs foram derivadas de linhas celulares de fibroblastos não transformadas do PRF Cell & Tissue Bank.
O método de transdução usado para todas as linhas iPS foi o Retrovirus MKOS.
ID da linha iPSC | Mutação | Gênero e DoaçãoIdade | Tipo de célula de origem Clique aqui. | Dados de suporte |
---|---|---|---|---|
HGADFN003 iPS 1B | LMNAExon 11, 1824 C>T | Masculino 2 anos 0 meses | Fibroblastos Dérmicos HGADFN003 | 003 iPS1B |
HGADFN003 iPS 1C | Exão 11 do LMNA, 1824 C>T | Masculino 2 anos 0 meses | Fibroblastos Dérmicos HGADFN003 | 003 iPS1C |
HGDFN003 iPS 1D | Exão 11 do LMNA, 1824 C>T | Masculino 2 anos 0 meses | Fibroblastos Dérmicos HGADFN003 | 003 iPS1D |
HGADFN167 iPS 1J | LMNA Exon 11, 1824 C>T | Masculino 8 anos e 5 meses | Fibroblastos Dérmicos HGADFN167 | 167 PS 1J |
HGADFN167 iPS 1Q | LMNA Exon 11, 1824 C>T | Masculino 8 anos e 5 meses | Fibroblastos Dérmicos HGADFN167 | 167 iPS1Q |
HGMDFN090 iPS 1B | Mãe de HGADFN167 (não afetado) | Mulher 37 anos 10 meses | Fibroblastos Dérmicos HGMDFN090 | 090 iPS1B |
HGMDFN090 iPS 1C | Mãe de HGADFN167 (não afetado) | Mulher 37 anos 10 meses | Fibroblastos Dérmicos HGMDFN090 | 090 iPS1C |
HGFDFN168 iPS1 D2 | Pai de HGADFN167 (não afetado) | Masculino 40 anos 5 meses | Fibroblastos Dérmicos HGFDFN168 | 168 iPS1 D2 |
HGFDFN168 iPS1P | Pai de HGADFN167 (não afetado) | Masculino 40 anos 5 meses | Fibroblastos Dérmicos HGFDFN168 | 168 iPS1P |
6. Junte-se à nossa lista de e-mail para futuras atualizações do iPSC e novas linhas de células
Continuamos a gerar linhas de iPSC. Se você quiser atualizações periódicas sobre iPSCs mantidas no PRF Cell & Tissue Bank, inscreva-se em nossa lista de e-mail clicando em aqui
7. Dúvidas?
Entre em contato com Leslie Gordon, MD, PhD, Diretora Médica, para quaisquer dúvidas ou necessidades, em lgordon@progeriaresearch.org ou 978-535-2594
8. Solicitação de linhas de células iPS
Em 2014, a PRF instituiu uma política de não fazer alterações em nosso MTA. Este é o resultado de 12 anos de acordos contratuais com 70 equipes de pesquisa trabalhando em instituições em 14 países. A PRF e seu advogado levaram em consideração as questões que surgiram naquele período e editaram o acordo de acordo, resultando no que consideramos termos justos e razoáveis.
Para perguntas ou informações sobre instituições do governo federal dos EUA, entre em contato com Wendy Norris em: wnorris@brownhealth.org ou 401
Etapa 1: Preencha um requerimento e um acordo de transferência de material
Aplicação e Acordo para Instituições Não Governamentais
Acordo de Transferência de Material para Instituições Não Governamentais
Passo 2: Devolva o requerimento preenchido e o acordo de transferência de material para Wendy Norris em wnorris@brownhealth.org. Após a aprovação, você receberá um e-mail confirmando seu pedido e a data prevista de envio.
Etapa 3: O laboratório do Dr. Stanford está atualmente distribuindo linhas em criotubos congelados. Seu laboratório enviará um e-mail quando a cultura for enviada, com informações de envio e rastreamento. Pesquisadores inexperientes são direcionados a obter treinamento em cursos especializados essenciais para o trabalho com células-tronco embrionárias humanas/iPSCs.
O Human Pluripotent Stem Cell Facility (dirigido pelo Dr. Stanford) no Ottawa Hospital Research Institute oferece treinamento virtual individual sobre os fundamentos das técnicas de cultura de iPSC específicas para as linhas de células iPSC Progeria. As opções de treinamento e o formato são flexíveis, dependendo do nível de experiência dos cientistas. Para mais informações, envie um e-mail para hpscf@ohri.ca.
Etapa 4: A Universidade de Ottawa cobrará diretamente de você cada linha iPSC, além dos custos de entrega, se houver.
9. Preparação do meio de cultura de células HGPS e iPS de controle
iPSC e ESCs precisam ser alimentados com mTeSR Plus da Stem Cell Technologies (cat# 5825). Siga as recomendações do fornecedor para armazenamento.
10. Preparando placas de Matrigel
Observação:Todas as etapas que envolvem o matrigel devem ser realizadas o mais rápido possível e mantidas o mais frias possível.
- Descongele a garrafa de matrigel às 4°C. Verifique o certificado de análise desse lote para encontrar sua concentração de proteína.
- Adicione meio DMEM/F12 frio suficiente ao matrigel descongelado para atingir uma concentração final de 5 mg/mL.
- Faça alíquotas de 1 mL do matrigel preparado na etapa 2 em tubos Falcon de 15 mL pré-refrigerados.
- Congele e armazene todas as alíquotas a -20°C.
- Para fazer placas de matrigel, remova uma alíquota de matrigel (1 mL) de -20°C e adicione 10mL de DMEM/F12 frio. Misture bem até que o pellet descongele (sem criar bolhas, e sempre mantenha a solução fria).
- Transfira para um tubo de 50 mL e adicione 20 mL de DMEM/F12 frio (1 mL de alíquota de matrigel é diluída em 30 mL de DMEM/F12) e misture bem.
- Placa (1 mL/poço para placa de 6 poços, 0,5 mL/poço para placa de 12 poços, 0,25 mL/poço para placa de 24 poços). Certifique-se de que a solução esteja cobrindo toda a área da superfície agitando a placa suavemente. Não recongele nenhum matrigel restante.
- Se usar o prato imediatamente, deixe-o em temperatura ambiente por 1 hora (ou 30 minutos a 37°C), observe matrigel sob o microscópio. Matrigel deve estar bem disperso e não “grumoso”.
- Se usar os pratos em outro momento, envolva a borda do prato com parafilme e guarde a 4°C por até 2 semanas.
Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230
DMEM/F12 – Tecnologias da Vida, cat#11330-057
Dr. William Stanford-2022
11. Descongelamento de células ES ou iPS (por crio-frasco)
- Retire uma placa de matrigel de 4°C e aqueça em temperatura ambiente por uma hora, ou faça uma nova placa de matrigel (veja o protocolo de preparação da placa de matrigel).
- Aqueça 4 mL de mTeSR Plus em um tubo Falcon de 15 mL.
- Remova as células do tanque de nitrogênio líquido e gire em um banho de 37°C até que reste apenas um pequeno pedaço de gelo. O frasco deve descongelar em 1-2 minutos. Esta etapa deve ser feita rapidamente.
- Tubo de célula de etanol e tubo de meio Falcon e coloque na capela.
- Use um 1mL ponta da boca larga para lentamente adicione células a 4 mL de meio pré-aquecido (evite misturar a suspensão de células).
- Centrifugue a 130 rcf por 5 minutos.
- Remova o sobrenadante.
- Adicione 2 mL de meio PSC e com uma ponta de boca larga quebre os aglomerados suavemente. Transfira a mídia para um poço de uma placa de 6 poços e adicione 2uL de inibidor ROCK (Y27632, concentração final de 10uM). Coloque na placa em um poço revestido de matrigel (de uma placa de 6 poços).
- Balance as células suavemente para distribuir uniformemente as células e coloque-as em uma incubadora hipóxica (5%O2, 10% CO2). Evite perturbar a placa por 24 horas após a semeadura.
OBSERVAÇÃO: É muito importante evitar a quebra excessiva de aglomerados ou pipetagem agressiva. Isso pode reduzir significativamente a taxa de sobrevivência. As células devem permanecer em pedaços de 100-300 células grandes no momento da semeadura. Embora seja gentil, tente trabalhar rapidamente assim que as células forem descongeladas para minimizar o tempo em que elas ficam em contato com o crioprotetor.
- Remova a mídia após 24 horas e adicione 2 mL de mídia PSC (para uma placa de 6 poços, 1 mL para 12 poços e 0,5 mL para uma placa de 24 poços). Veja o protocolo Harvesting and Caring for hESC/iPSC.
Mídia PSC
mTeSR Plus da Stem Cell Technologies (cat# 5825). Siga as recomendações do fornecedor para armazenamento.
O que é o inibidor ROCK Y27632?
O inibidor ROCK Y27632 é um inibidor seletivo da cinase p160 ROCK associada a Rho. O tratamento com o inibidor ROCK Y27632 previne a apoptose induzida por dissociação de células-tronco embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC), aumentando a taxa de sobrevivência e mantendo a pluripotência durante o subcultivo e descongelamento de hESCs e hiPSCs. O inibidor ROCK Y27632 também demonstrou aumentar a taxa de sobrevivência de células-tronco durante a criopreservação. Observe que as alíquotas do inibidor Rock são sensíveis à luz e aos ciclos repetitivos de congelamento e descongelamento. Certifique-se de usar essas alíquotas dentro do prazo de validade recomendado pelo fornecedor.
Dr. William Stanford-2022
12. Colheita e cuidados com hESC/iPSC
- No dia seguinte ao descongelamento das células, observe-as no microscópio para determinar a taxa de sobrevivência. NOTA: é normal observar um alto número de células soltas. Enquanto algumas células estiverem presas, colônias podem surgir delas dentro de 3 a 7 dias.
- Remova a mídia dos poços e pipete 2 mL (para uma placa de 6 poços, 1 mL para 12 poços e 0,5 mL para uma placa de 24 poços) de meio PSC fresco e morno por poço. Retorne a placa para a incubadora.
- As células são alimentadas até a confluência de 60-70% (siga as recomendações do fornecedor).
- A partir do segundo dia, as células devem ser observadas e limpas de quaisquer células diferenciadas que possam estar crescendo.
- Para limpar as células, use a tampa de coleta e raspe as células diferenciadas com a ponta de uma pipeta.
- Depois que as células estiverem limpas, troque o meio conforme feito nas etapas acima.
(Veja Congelando hESC/iPSC ou Passando hESC/iPSC)
OBSERVAÇÃO:
A mídia PSC foi determinada como mais eficiente em um ambiente hipóxico. Também observamos que ocorre menos diferenciação quando as células são cultivadas em incubadoras hipóxicas versus normóxicas. Por fim, as células semeadas têm uma melhor taxa de sobrevivência ao usar uma incubadora hipóxica.
Normóxico: 37°C, 21%O2, 5% CO2
Hipóxico: 37°C, 5%O2, 10% CO2
Dr. William Stanford-2022
13. Passando hESC/iPSC
- Adicione 2 mL de meio PSC a uma placa revestida com matrigel de 6 poços e reserve.
- Pegue a placa a ser passada e remova o meio do poço e lave uma vez com 1 mL de PBS(-/-).
- Adicione 1 mL da solução de EDTA ao poço e deixe por 3-4 minutos em temperatura ambiente. Não mova a placa, pois as células podem começar a se desprender.
- Remova a solução de EDTA e adicione 1 mL de meio PSC. Não deixe o EDTA nas células por mais de 4 minutos, pois isso fará com que as células se soltem.
- Raspe as células usando um raspador de células e divida as células entre os 6 poços da sua placa contendo meio PSC. Evite a quebra excessiva dos pedaços da colônia e tente ser gentil com a raspagem. Tente manter as células em pedaços grandes. Use uma ponta de pipeta de boca larga para quebrar os aglomerados, se necessário. A quebra excessiva de células pode causar morte celular ou diferenciação espontânea excessiva após a passagem.
- Incubar a 37°C após distribuir uniformemente as células em cada poço (agitação em forma de 8 ou L). Evite perturbar a placa por 24 horas após a passagem.
OBSERVAÇÃO: Depois que as células forem raspadas, você deve transferi-las para a nova placa o mais rápido possível, pois elas se reconectarão rapidamente (em 5 minutos).
Se o EDTA for deixado nas células por mais de 4 minutos, elas podem começar a se desprender. Se isso acontecer, simplesmente colete as células em um Falcon de 15 mL com 4 mL de meio PSC. Centrifugue as células a 130 rcf por 5 minutos. Ressuspenda o pellet com 1 mL de meio e divida uniformemente entre uma placa revestida de matrigel de 6 poços (160 uL por poço).
Solução de EDTA: Adicione 500 uL de EDTA 0,5 M (pH 8,0) em 500 mL de DPBS (-/-). Adicione 0,9 g de NaCl. Filtre a solução para esterilizar e armazene a 4 °C por até 6 meses.
Do artigo:
Passagem e expansão de colônias de células-tronco pluripotentes humanas por dissociação livre de enzimas em condições de cultura quimicamente definidas
Cervejas Jeanette,1 Daniel R. Gulbranson,2,3 Nicole George,4Lauren I. Siniscalchi,1 Jeffrey Jones,4,5 James A. Thomson,2,3,6 e Guokai Chen1,2
14. Congelamento de hESC/iPSC
- Ligue o Bio-Cool (congelador de taxa controlada) e ajuste a temperatura para -7°C.
- Remova as células da incubadora e observe a confluência e a morfologia no microscópio.
- Se os poços forem confluentes com 70%, remova o meio antigo e lave uma vez com PBS(-/-) e adicione 1 mL de solução de EDTA (veja passagem com solução de EDTA) por poço.
- Incube em temperatura ambiente por 3-4 minutos.
- Aspire a solução de EDTA e adicione 1 mL de meio mFreSR frio (cat#05855, Stem Cell Technologies).
- Use um raspador de células para levantar as células gentilmente. Mantenha as células em pedaços grandes o máximo possível e evite pipetar para cima e para baixo.
- Transfira células/mFreSR para um criotubo usando uma ponta de boca larga. Mantenha os frascos no gelo até que estejam prontos para a etapa 8.
- Coloque os tubos no Bio-Cool e incubar por 10 minutos.
- Obtenha nitrogênio líquido.
- Após 10 minutos, semeie as células mergulhando uma espátula em nitrogênio líquido e tocando na lateral do frasco criogênico por aproximadamente 10 a 30 segundos ou até ver um cristal se formar na lateral do frasco criogênico.
- Inicie o programa 1 pressionando o botão “PROG” e prossiga com o programa pressionando o botão novamente e você deverá ver a taxa de 0,5°C/min., então pressione “RUN”.
- Quando a temperatura atinge -65°C, os criotubos podem ser transferidos e armazenados em nitrogênio líquido.
Alternativas
Outra opção é colocar os criotubos em um recipiente de congelamento (Biocision-CoolCell) e armazenar a -80°C durante a noite. Mova os criotubos para nitrogênio líquido (fase líquida ou vapor) no dia seguinte.
Dr. William Stanford-2022