1. Informações básicas do iPSC para não-cientista

As células-tronco são células “imaturas” que ainda não se comprometeram a se tornar um tipo de célula. Eles são flexíveis porque têm o potencial de se desenvolver em muitos tipos diferentes de células maduras no corpo, como as células que constituem o coração ou os vasos sanguíneos e outros tecidos e órgãos. Em 2007, os pesquisadores descobriram uma estratégia para criar células-tronco em laboratório, reprogramando células adultas maduras que normalmente cultivamos para fins de pesquisa.^{1, 2} . Essas células-tronco criadas artificialmente são chamadas de células-tronco pluripotentes induzidas (“iPSCs”). Para o campo da Progéria, este é um grande avanço. Pela primeira vez, os cientistas agora podem fazer células-tronco da Progéria e fazer perguntas sobre como as células-tronco funcionam e se desenvolvem na Progéria. Anteriormente, não havia nenhuma fonte de células-tronco da Progéria humana e, portanto, havia um vazio de informações sobre como as células-tronco da Progéria funcionam em comparação com as células-tronco de pessoas sem Progéria. Além disso, os cientistas podem reprogramar as células-tronco da Progéria para criar, pela primeira vez, vasos sanguíneos da Progéria maduros, células cardíacas e outros tipos de células. Até agora, não havia nenhuma fonte de células do coração ou dos vasos sanguíneos de Progéria humana.  Agora podemos pedir chave perguntas sobre a doença cardíaca que leva à morte prematura na Progéria por ataques cardíacos e derrames. Podemos comparar essas descobertas com as doenças cardíacas e o envelhecimento na população em geral e descobrir mais sobre o que influencia o envelhecimento em todos nós. Já houve vários estudos excelentes publicados usando células-tronco Progeria.^3-5  Nosso objetivo na Progeria Research Foundation é facilitar muitas outras descobertas usando esta ferramenta inestimável. Para obter uma cartilha sobre células-tronco, consulte este site do governo dos EUA: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Objetivo da geração e distribuição de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) pela The Progeria Research Foundation

A missão da Fundação Progeria de Pesquisa é descobrir tratamentos e a cura para a Síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria e seus distúrbios relacionados ao envelhecimento. No 2009, a PRF iniciou uma colaboração com uma equipe de cientistas da Universidade de Toronto, Canadá, sob a direção de William Stanford, PhD, para gerar iPSCs Progeria de alta qualidade. Dr. Stanford é o Presidente de Pesquisa do Canadá em Biologia Integrativa de Células-Tronco. A partir do 2011, o PRF continua a colaborar com o Dr. Stanford na Universidade de Ottawa, Canadá, onde é professor de medicina celular e molecular, Faculdade de Medicina e cientista sênior do Sprott Center for Stem Cell Research do Ottawa Hospital Research Institute.

Nosso objetivo é fornecer esta ferramenta inestimável para pesquisadores em todo o mundo. Esta nova ferramenta de pesquisa será usada para gerar pesquisas novas e inovadoras em Progeria, bem como sua relação com doenças cardíacas e envelhecimento.  

3. Geração de Células Estaminais Pluripotentes Induzidas pela Síndrome de Progresso de Hutchinson-Gilford (iPSCs)

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram derivadas usando transdução retroviral pseudotipada VSVG de quatro fatores humanos, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc em fibroblastos. As colônias de iPSC foram derivadas de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs). O procedimento usado foi essencialmente conforme descrito anteriormente, mas sem o uso do repórter EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Controle de Qualidade: Validação e Caracterização

As linhas atualmente disponíveis foram submetidas a várias etapas de validação (consulte os PDFs para download abaixo):

5. Material de partida original do qual essas células iPS foram derivadas

As iPSCs foram derivadas de linhas de células de fibroblastos não transformadas PRF Cell & Tissue Bank.

O método de transdução usado para todas as linhas iPS foi o Retrovirus MKOS.

ID da linha iPSC	Mutação	Gênero e Doação	Tipo de célula de origem Clique aqui.	Dados de suporte
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Homem 2yr 0mo	Fibroblastos dérmicos HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Homem 2yr 0mo	Fibroblastos dérmicos HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Homem 2yr 0mo	Fibroblastos dérmicos HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Homem 8yr 5mo	Fibroblastos dérmicos HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Homem 8yr 5mo	Fibroblastos dérmicos HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Mãe de HGADFN167 (não afetada)	Feminino 37yr 10mo	Fibroblastos dérmicos HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Mãe de HGADFN167 (não afetada)	Feminino 37yr 10mo	Fibroblastos dérmicos HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Pai de HGADFN167 (não afetado)	Homem 40yr 5mo	Fibroblastos dérmicos HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Pai de HGADFN167 (não afetado)	Homem 40yr 5mo	Fibroblastos dérmicos HGFDFN168	168 iPS1P

6. Participe da nossa lista de e-mails para futuras atualizações do iPSC e novas linhas de células

Continuamos gerando linhas iPSC. Se você quiser atualizações periódicas sobre iPSCs realizadas no Banco de Células e Tecidos PRF, inscreva-se em nossa lista de e-mail clicando em SUA PARTICIPAÇÃO FAZ A DIFERENÇA

7. Perguntas?

Entre em contato com Leslie Gordon, MD, PhD, Diretor Médico, com qualquer dúvida ou necessidade, em lgordon@progeriaresearch.org ou 978-535-2594

8. Pedido de linhas de células iPS

No 2014, a PRF instituiu uma política de nenhuma alteração no nosso MTA. Esse é o resultado de anos de acordos contratuais da 12 com equipes de pesquisa da 70 que trabalham em instituições nos países da 14. A PRF e seus advogados levaram em consideração os problemas que surgiram nesse período e editaram o contrato de acordo, resultando no que consideramos termos justos e razoáveis.

Para questões ou instituições do governo federal dos EUA, entre em contato com Wendy Norris em: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Etapa 1: concluir um contrato de aplicação e transferência de material

Solicitação e Contrato para Instituições Não Governamentais

Contrato de transferência de material para instituições não-governamentais

- Devolva o formulário preenchido e o contrato de transferência de material para Wendy Norris em wnorris@lifespan.org. Depois de aprovado, você receberá um e-mail confirmando seu pedido e a data de envio prevista. 

- O laboratório do Dr. Stanford está atualmente distribuindo linhas de criotubos congelados. O laboratório dele enviará um e-mail quando a cultura for enviada, com informações de envio e rastreamento. Pesquisadores inexperientes são direcionados para obter treinamento em cursos especializados essenciais para o trabalho com células-tronco embrionárias humanas / CEPi.

O Human Pluripottent Stem Cell Facility (dirigido pelo Dr. Stanford) no Ottawa Hospital Research Institute oferece treinamento virtual individualizado sobre noções básicas de técnicas de cultura iPSC específicas para as linhagens celulares Progeria iPSC. As opções e o formato de treinamento são flexíveis, dependendo do nível de experiência dos cientistas.  Para obter mais informações, envie um e-mail para hpscf@ohri.ca.

Etapa 4: A Universidade de Ottawa enviará uma fatura direta para cada linha iPSC mais os custos de correio, se houver.

9. Preparação de meio de cultura de células HGPS e controle iPS

iPSC e ESCs precisam ser alimentados com mTeSR Plus da Stem Cell Technologies (cat # 5825). Siga as recomendações do fornecedor para armazenamento.

10. Preparação de placas de Matrigel

Note: Todas as etapas que envolvem o matrigel devem ser executadas o mais rápido possível e permanecer o mais frio possível.

1. Descongele a garrafa matrigel em 4°C. Verifique o certificado de análise desse lote para encontrar sua concentração de proteína.
2. Adicione meio DMEM/F12 frio suficiente ao matrigel descongelado para atingir uma concentração final de 5mg/mL.
3. Faça alíquotas de 1mL do matrigel preparado da etapa 2 em tubos falcon de 15mL pré-refrigerados.
4. Congele e armazene todas as alíquotas em -20°C.
5. Para fazer placas de matrigel, remova uma alíquota de matrigel (1mL) de -20°C e adicione 10mL de DMEM/F12 frio. Misture bem até que o pellet descongele (sem criar bolhas e mantenha sempre a solução fria).
6. Transferir para um tubo de 50mL, depois adicionar 20mL de DMEM/F12 frio (1mL de alíquota de matrigel é diluído em 30mL de DMEM/F12), misturar bem.
7. Placa (1 mL/poço para placa de 6 poços, 0.5 mL/poço para placa de 12 poços, 0.25 mL/poço para placa de 24 poços). Certifique-se de que a solução está cobrindo toda a área da superfície agitando suavemente a placa. Não volte a congelar qualquer matrigel restante.
8. Se estiver usando a placa imediatamente, deixe a placa descansar em temperatura ambiente por 1 hora (ou 30 minutos a 37°C), observar matrigel ao microscópio. Matrigel deve ser bem disperso e não “grumoso”.
9. Se usar placas em outro momento, enrole a borda da placa com parafilme e armazene a 4°C por até 2 semanas.

Matrigel - BD / Fisher, gato # CB-40230

DMEM / F12 - Tecnologias da vida, gato # 11330-057

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11. Descongelamento de células ES ou iPS (por frasco de crioquina)

1. Retire uma placa matrigel de 4 ° C e aqueça à temperatura ambiente por uma hora, ou faça uma placa matrigel fresca (consulte o protocolo de preparação da placa matrigel).
2. Aqueça 4mL de mTeSR Plus em um tubo Falcon de 15mL.
3. Remova as células do tanque de nitrogênio líquido e agite em um banho de 37 ° C até que reste apenas um pequeno pedaço de gelo. O frasco deve descongelar em 1-2 minutos. Esta etapa deve ser feita rapidamente.
4. Tubo de célula de etanol e tubo de mídia de falcão e coloque no capô.
5. Use 1ml ponta da boca larga para devagar adicione células a 4mL de meio pré-aquecido (evite misturar a suspensão de células).
6. Gire a 130 rcf por 5 minutos.
7. Remova o sobrenadante.
8. Adicione 2mL de mídia PSC e com uma ponta de boca larga quebrar os aglomerados suavemente. Transferir o meio para um poço de uma placa de 6 poços adicionar 2 uL de inibidor ROCK (Y27632, concentração final de 10 uM). Placa em um poço revestido com matrigel (de uma placa de 6 poços).
9. Células rochosas suavemente para distribuir as células uniformemente e coloque em uma incubadora hipóxica (5%O₂, 10% CO₂). Evite a perturbação da placa por 24 horas após a semeadura.

   NOTA: É muito importante evitar a quebra excessiva de aglomerados ou pipetagem agressiva. Isso pode reduzir significativamente a taxa de sobrevivência. As células devem permanecer em pedaços de 100-300 células grandes no momento da semeadura. Embora seja gentil, tente trabalhar rapidamente quando as células estiverem descongeladas para minimizar o tempo em que estão em contato com o crioprotetor.

10. Remova a mídia após 24 horas e adicione 2mL de mídia PSC (para uma placa de 6 poços, 1mL para 12 poços e 0.5mL para 24 poços). Consulte Colhendo e cuidando do protocolo hESC/iPSC.

Mídia PSC

mTeSR Plus da Stem Cell Technologies (cat # 5825). Siga as recomendações do fornecedor para armazenamento.

O que é o inibidor de rocha Y27632?

O inibidor de ROCK Y27632 é um inibidor seletivo da quinase p160 ROCK associada a Rho. O tratamento com o inibidor de ROCK Y27632 previne a apoptose induzida por dissociação de células-tronco embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC), aumentando a taxa de sobrevivência e mantendo a pluripotência durante o subcultivo e descongelamento de hESCs e hiPSCs. O inibidor de ROCK Y27632 também demonstrou aumentar a taxa de sobrevivência das células-tronco durante a criopreservação. Observe que as alíquotas de inibidores de rocha são sensíveis à luz e a ciclos de congelamento e descongelamento repetitivos. Certifique-se de usar essas alíquotas dentro do prazo de validade recomendado pelo fornecedor.

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12. Colhendo e Cuidando de hESC/iPSC

1. No dia seguinte ao descongelamento das células, observe-as ao microscópio para determinar a taxa de sobrevivência. NOTA: é normal observar um número elevado de células desvinculadas. Desde que algumas células estejam aderidas, as colônias podem surgir delas dentro de 3 a 7 dias.
2. Remova a mídia dos poços e pipete 2 mL (para uma placa de 6 poços, 1 mL para 12 poços e 0.5 mL para 24 poços) de mídia PSC fresca e quente por poço. Devolva a placa à incubadora.
3. As células são alimentadas até 60-70% confluentes (siga as recomendações do fornecedor).
4. A partir do dia 2, as células devem ser observadas e limpas de quaisquer células diferenciadas que possam estar crescendo.
5. Para limpar as células, use a coifa e raspe as células diferenciadas com uma ponta de pipeta.
6. Depois que as células estiverem limpas, troque a mídia conforme feito nas etapas acima.

(Consulte Congelando hESC/iPSC ou Passando hESC/iPSC)

NOTA:

A mídia PSC foi determinada como sendo mais eficiente em um ambiente hipóxico. Também observamos que ocorre menos diferenciação quando as células são cultivadas em incubadoras hipóxicas versus normóxicas. Por fim, as células semeadas têm uma melhor taxa de sobrevivência ao usar uma incubadora hipóxica.

Normóxico: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

Hipóxico: 37°C, 5% O₂, 10% CO₂

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13. Passando hESC/iPSC

1. Adicione 2mL de mídia PSC a uma placa de 6 poços revestida com matrigel e reserve.
2. Pegue a placa a ser passada e remova a mídia do poço e lave uma vez com 1mL de PBS(-/-).
3. Adicione 1 mL da solução de EDTA ao poço e deixe por 3-4 minutos em temperatura ambiente. Não mova a placa, pois as células podem começar a se desprender.
4. Remova a solução de EDTA e adicione 1mL de mídia PSC. Não deixe EDTA nas células por mais de 4 minutos, pois isso fará com que as células decolem.
5. Raspe as células usando um raspador de células e divida as células entre os 6 poços da sua placa contendo mídia PSC. Evite a quebra excessiva dos pedaços da colônia e tente ser gentil com a raspagem. Tente manter as células em grandes pedaços. Use uma ponta de pipeta de boca larga para quebrar os aglomerados, se necessário. A quebra excessiva de células pode causar morte celular ou diferenciação espontânea excessiva após a passagem.
6. Incubar a 37°C após distribuir as células uniformemente em cada poço (8 figuras ou agitação em forma de L). Evite a perturbação da placa por 24 horas após a passagem.

NOTA: Uma vez que as células tenham sido raspadas, você deseja transferi-las para a nova placa o mais rápido possível, porque as células se reconectarão rapidamente (dentro de 5 minutos).

Se o EDTA for deixado nas células por mais de 4 minutos, as células podem começar a se desprender. Se isso acontecer, basta coletar as células em um falcão de 15mL com 4mL de mídia PSC. Gire as células a 130 rcf por 5 minutos. Ressuspender o pellet com 1mL de meio e dividir uniformemente entre uma placa de 6 poços revestida com matrigel (160uL por poço).

Solução de EDTA: Adicione 500uL de 0.5M EDTA (pH 8.0) em 500mL de DPBS (-/-). Adicionar 0.9 g de NaCl. Filtre a solução para esterilizar e armazene a 4°C por até 6 meses.

Do papel:

Expansão de passagem e colônia de células-tronco pluripotentes humanas por dissociação sem enzimas em condições de cultura definidas quimicamente

Jeanette Beers,¹ Daniel R. Gulbranson,^2,3 Nicole George,⁴Lauren I. Siniscalchi,¹ Jeffrey Jones,^4,5 James A. Thomson,^2,3,6 e Guokai Chen^1,2

14. Congelando hESC/iPSC

1. Ligue o Bio-Cool (Congelador de Taxa Controlada) e ajuste a temperatura para -7°C.
2. Remova as células da incubadora e observe a confluência e a morfologia ao microscópio.
3. Se os poços estiverem 70% confluentes, remova a mídia antiga e lave uma vez com PBS(-/-) e adicione 1 mL de solução de EDTA (veja passagem com solução de EDTA) por poço.
4. Incubar à temperatura ambiente por minutos 3-4.
5. Aspire a solução de EDTA e adicione 1 mL de meio mFreSR frio (cat#05855, Stem Cell Technologies).
6. Use um raspador de células para levantar as células suavemente. Mantenha as células em grandes pedaços, tanto quanto possível e evite pipetar para cima e para baixo.
7. Transfira células/mFreSR para um criotubo usando uma ponta de boca larga. Mantenha os frascos no gelo até estar pronto para a etapa 8.
8. Coloque os tubos em Bio-Cool e incubar por 10 minutos.
9. Obter nitrogênio líquido.
10. Após 10 minutos, semeie as células mergulhando uma espátula em nitrogênio líquido e tocando a lateral do frasco criogênico por aproximadamente 10-30 segundos ou até ver um cristal se formar na lateral do frasco criogênico.
11. Inicie o programa 1 pressionando o botão “PROG” e passe pelo programa pressionando o botão novamente e você deverá ver a taxa de 0.5°C/min. , depois pressione “RUN”.
12. Quando a temperatura atinge -65°C, os tubos criogênicos podem ser transferidos e armazenados em nitrogênio líquido.

Alternativas

Outra opção é colocar os tubos criogênicos em um recipiente de congelamento (Biocision-CoolCell) e armazenar a -80°C durante a noite. Mova os tubos criogênicos para nitrogênio líquido (fase líquida ou vapor) no dia seguinte.

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