Pluripotent induit
Cellules souches
La Banque de cellules et de tissus de la Fondation de recherche sur la progéria
Cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC)
- Cellules iPSC de la progéria Informations générales pour les non-scientifiques
- Objectif de Génération et distribution de cellules souches pluripotentes induites par la Progeria Research Foundation
- Génération de cellules souches pluripotentes induites par le syndrome de Hutchinson-Gilford-Progeria (iPSC)
- Contrôle qualité : validation et caractérisation
- Matériau de départ d'origine à partir duquel les iPSC ont été dérivées
- Rejoignez notre liste de diffusion pour les futures mises à jour sur les iPSC et les nouvelles lignées cellulaires
- Des questions ? Contactez-nous.
- Commande de lignes iPSC
- Préparation des milieux de culture HGPS et iPSC de contrôle
- Préparation des plaques de Matrigel
- Décongélation des cellules hESC et iPSC (par cryo-flacon)
- Récolte et entretien des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et cellules souches embryonnaires pluripotentes induites (iPSC)
- Passage hESC/iPSC
- Congélation des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et cellules souches embryonnaires in vitro (iPSC)
1. Informations générales sur les iPSC pour les non-scientifiques
Les cellules souches sont des cellules « immatures » qui n’ont pas encore pris l’engagement de devenir un type cellulaire particulier. Elles sont malléables car elles ont le potentiel de se développer en de nombreux types différents de cellules matures dans le corps, comme les cellules qui composent le cœur ou les vaisseaux sanguins, ainsi que d’autres tissus et organes. En 2007, des chercheurs ont découvert une stratégie pour créer des cellules souches en laboratoire en reprogrammant des cellules adultes matures que nous cultivons généralement à des fins de recherche.1, 2 Ces cellules souches artificiellement créées sont appelées cellules souches pluripotentes induites (« iPSC »). Pour le domaine de la progéria, il s’agit d’une avancée majeure. Pour la première fois, les scientifiques peuvent désormais fabriquer des cellules souches de la progéria et se demander comment les cellules souches fonctionnent et se développent dans la progéria. Jusqu’à présent, il n’existait aucune source de cellules souches humaines de la progéria, et il y avait donc un manque d’informations sur le fonctionnement des cellules souches de la progéria par rapport aux cellules souches de personnes non atteintes de la progéria. En outre, les scientifiques peuvent reprogrammer les cellules souches de la progéria pour créer, pour la première fois, des cellules vasculaires, cardiaques et d’autres types de cellules matures de la progéria. Jusqu’à présent, il n’existait aucune source de cellules cardiaques ou vasculaires humaines de la progéria. Nous pouvons maintenant demander la clé Des questions se posent sur la maladie cardiaque qui entraîne une mort prématurée chez les personnes atteintes de progéria, par crise cardiaque ou accident vasculaire cérébral. Nous pouvons comparer ces découvertes avec les maladies cardiaques et le vieillissement dans la population générale et en savoir plus sur ce qui influence le vieillissement chez nous tous. Plusieurs excellentes études ont déjà été publiées sur les cellules souches de la progéria.3-5 Notre objectif à la Progeria Research Foundation est de faciliter de nombreuses autres découvertes grâce à cet outil précieux. Pour une introduction aux cellules souches, veuillez consulter ce site Web du gouvernement américain : https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm
-
- Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Induction de cellules souches pluripotentes à partir de fibroblastes humains adultes par des facteurs définis. Cellule. 2007;131:861-872.
- Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. Lignées de cellules souches pluripotentes induites dérivées de cellules somatiques humaines. Science. 2007;318:1917-1920.
- Liu GH, Barkho BZ, Ruiz S, Diep D, Qu J, Yang SL, Panopoulos AD, Suzuki K, Kurian L, Walsh C, Thompson J, Boue S, Fung HL, Sancho-Martinez I, Zhang K, Yates J, 3rd, Izpisua Belmonte JC. Récapitulation du vieillissement prématuré avec les iPSC du syndrome de progéria de Hutchinson-Gilford. Nature. 2011;472:221-225.
- Misteli T. iPSCs dérivées de HGPS pour les âges. Cellule souche. 2011;8:4-6.
2. Objectif de la génération et de la distribution de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) par la Progeria Research Foundation
La mission de la Fondation de recherche sur la Progéria est de découvrir des traitements et des remèdes contre le syndrome de Hutchinson-Gilford de la Progéria et les troubles liés au vieillissement. En 2009, la PRF a conclu une collaboration avec une équipe d'experts scientifiques de l'Université de Toronto, au Canada, sous la direction du Dr William Stanford, afin de générer des cellules souches embryonnaires pluripotentes induites (iPSC) de la Progéria de haute qualité. Le Dr Stanford est titulaire de la chaire de recherche du Canada en biologie intégrative des cellules souches. Depuis 2011, la PRF continue de collaborer avec le Dr Stanford à l'Université d'Ottawa, au Canada, où il est professeur de médecine cellulaire et moléculaire à la Faculté de médecine et chercheur principal au Centre Sprott de recherche sur les cellules souches de l'Institut de recherche de l'hôpital d'Ottawa.
Notre objectif est de fournir cet outil précieux aux chercheurs du monde entier. Ce nouvel outil de recherche servira à générer de nouvelles recherches innovantes sur la progéria, ainsi que sur sa relation avec les maladies cardiaques et le vieillissement.
3. Génération de cellules souches pluripotentes induites par le syndrome de Hutchinson-Gilford-Progeria (iPSC)
Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont été dérivées à l'aide de la transduction rétrovirale pseudotypée VSVG de quatre facteurs humains, Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc dans des fibroblastes. Les colonies d'iPSC ont été dérivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). La procédure utilisée était essentiellement celle décrite précédemment, mais sans l'utilisation du rapporteur EOS (Nature Protocols 4 : 1828-1844, 2009).
4. Contrôle qualité : validation et caractérisation
Les lignes actuellement disponibles ont subi plusieurs étapes de validation (voir PDF téléchargeables ci-dessous) :
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- Test de mycoplasme pour chaque lignée : le laboratoire du Dr Stanford a effectué une analyse de mycoplasme par PCR pour chaque lignée cellulaire. De plus, après l'expansion et avant l'expédition des cellules, les lignées seront à nouveau testées pour détecter les mycoplasmes.
- Immunocoloration pour les marqueurs de pluripotence Tra-1-60, Tra-1-81 et SSEA4.
- La coloration à la phosphatase alcaline comme indicateur de pluripotence
- Formation du corps embryonnaire et immunocoloration ultérieure pour les marqueurs des trois feuillets germinaux. Les marqueurs testés étaient la βIII-tubuline (ectoderme), l'actine des muscles lisses (mésoderme) et Gata4 ou AFP (endoderme)
- Analyse du caryotype.
- Réexpression de la lamine A dans les cellules différenciées
- Essais de tératome
Validation supplémentaire en cours :
Certaines lignées ont réalisé des tests de tératome, comme le montrent les données justificatives. Pour toutes les autres lignées, des tests de tératome sont en cours et le statut sera mis à jour au fur et à mesure que ces tests seront terminés.
5. Matériau de départ original à partir duquel ces cellules iPS ont été dérivées
Les iPSC proviennent de lignées cellulaires de fibroblastes non transformés de la PRF Cell & Tissue Bank.
La méthode de transduction utilisée pour toutes les lignées iPS était le Retrovirus MKOS.
ID de ligne iPSC | Mutation | Sexe et âge du don | Type de cellule d'origine Cliquez ici. | Données à l'appui |
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HGADFN003 iPS 1B | LMNAExon 11, 1824 C>T | Homme 2 ans 0 mois | Fibroblastes dermiques HGADFN003 | 003 iPS1B |
HGADFN003 iPS 1C | Exon 11 de l'ARNm, 1824 C>T | Homme 2 ans 0 mois | Fibroblastes dermiques HGADFN003 | 003 iPS1C |
HGDFN003 iPS 1D | Exon 11 de l'ARNm, 1824 C>T | Homme 2 ans 0 mois | Fibroblastes dermiques HGADFN003 | 003 iPS1D |
HGADFN167 iPS 1J | Exon 11 de LMNA, 1824 C>T | Homme 8 ans 5 mois | Fibroblastes dermiques HGADFN167 | 167 PS 1J |
HGADFN167 iPS 1Q | Exon 11 de LMNA, 1824 C>T | Homme 8 ans 5 mois | Fibroblastes dermiques HGADFN167 | 167 iPS1Q |
HGMDFN090 iPS 1B | Mère de HGADFN167 (non affectée) | Femme 37 ans 10 mois | Fibroblastes dermiques HGMDFN090 | 090 iPS1B |
HGMDFN090 iPS 1C | Mère de HGADFN167 (non affectée) | Femme 37 ans 10 mois | Fibroblastes dermiques HGMDFN090 | 090 iPS1C |
HGFDFN168 iPS1 D2 | Père de HGADFN167 (non affecté) | Homme 40 ans 5 mois | Fibroblastes dermiques HGFDFN168 | 168 iPS1 D2 |
HGFDFN168 iPS1P | Père de HGADFN167 (non affecté) | Homme 40 ans 5 mois | Fibroblastes dermiques HGFDFN168 | 168 iPS1P |
6. Rejoignez notre liste de diffusion pour les futures mises à jour sur les iPSC et les nouvelles lignées cellulaires
Nous continuons à générer des lignées iPSC. Si vous souhaitez recevoir des mises à jour périodiques sur les iPSC conservées dans la PRF Cell & Tissue Bank, veuillez vous inscrire à notre liste de diffusion en cliquant sur ici
7. Des questions ?
Veuillez contacter Leslie Gordon, MD, PhD, directrice médicale, pour toute question ou besoin, au lgordon@progeriaresearch.org ou 978-535-2594
8. Commande de lignées cellulaires iPS
En 2014, la PRF a instauré une politique de non-modification de son MTA. C'est le résultat de 12 années d'accords contractuels avec 70 équipes de recherche travaillant dans des institutions de 14 pays. La PRF et ses conseillers juridiques ont pris en considération les problèmes survenus au cours de cette période et ont modifié l'accord en conséquence, ce qui nous semble être des conditions justes et raisonnables.
Pour les institutions du gouvernement fédéral américain ou pour toute question, veuillez contacter Wendy Norris à : wnorris@brownhealth.org ou 401
Étape 1 : Remplir une demande et un accord de transfert de matériel
Demande et accord pour les institutions non gouvernementales
Accord de transfert de matériel pour les institutions non gouvernementales
Étape 2 : Renvoyez la demande complétée et l'accord de transfert de matériel à Wendy Norris à wnorris@brownhealth.orgUne fois approuvée, vous recevrez un e-mail confirmant votre commande et la date d'expédition prévue.
Étape 3 : Le laboratoire du Dr Stanford distribue actuellement des lignées dans des cryotubes congelés. Son laboratoire vous enverra un e-mail lorsque la culture aura été expédiée, avec les informations d'expédition et de suivi. Les chercheurs inexpérimentés sont invités à suivre des cours spécialisés essentiels au travail sur les cellules souches embryonnaires humaines/iPSC.
Le Centre de cellules souches pluripotentes humaines (dirigé par le Dr Stanford) de l'Institut de recherche de l'hôpital d'Ottawa offre une formation individuelle virtuelle sur les bases des techniques de culture des cellules souches pluripotentes humaines (iPSC) spécifiques aux lignées cellulaires iPSC de Progeria. Les options et le format de formation sont flexibles en fonction du niveau d'expérience des scientifiques. Pour plus d'informations, veuillez envoyer un courriel à hpscf@ohri.ca.
Étape 4 : L’Université d’Ottawa vous facturera directement pour chaque ligne iPSC plus les frais de messagerie, le cas échéant.
9. Préparation des milieux de culture cellulaire HGPS et iPS de contrôle
Les cellules iPSC et les cellules souches embryonnaires doivent être alimentées avec le mTeSR Plus de Stem Cell Technologies (cat# 5825). Veuillez suivre les recommandations du fournisseur pour le stockage.
10. Préparation des plaques de Matrigel
Note:Toutes les étapes impliquant le matrigel doivent être effectuées le plus rapidement possible et rester aussi froides que possible.
- Décongeler la bouteille de matrigel à 4°C. Vérifiez le certificat d’analyse de ce lot pour connaître sa concentration en protéines.
- Ajoutez suffisamment de milieu DMEM/F12 froid au matrigel décongelé pour atteindre une concentration finale de 5 mg/mL.
- Préparez des aliquotes de 1 ml du matrigel préparé à l’étape 2 dans des tubes Falcon pré-refroidis de 15 ml.
- Congeler et conserver tous les aliquots à -20°C.
- Pour fabriquer des plaques de matrigel, prélevez une aliquote de matrigel (1 ml) de -20°C et ajouter 10 ml de DMEM/F12 froid. Bien mélanger jusqu'à ce que le culot décongèle (sans créer de bulles et toujours garder la solution froide).
- Transférer dans un tube de 50 ml, puis ajouter 20 ml de DMEM/F12 froid (1 ml d'aliquote de matrigel est dilué dans 30 ml de DMEM/F12), bien mélanger.
- Plaque (1 ml/puits pour une plaque à 6 puits, 0,5 ml/puits pour une plaque à 12 puits, 0,25 ml/puits pour une plaque à 24 puits). Assurez-vous que la solution recouvre toute la surface en secouant doucement la plaque. Ne recongelez pas les restes de matrigel.
- Si vous utilisez la plaque immédiatement, laissez-la reposer à température ambiante pendant 1 heure (ou 30 minutes à 37°C), observer le matrigel au microscope. Le matrigel doit être bien dispersé et non « grumeleux ».
- Si vous utilisez les plaques à un autre moment, enveloppez le bord de la plaque avec du parafilm et conservez-la à 4°C pendant 2 semaines maximum.
Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230
DMEM/F12 – Technologies du vivant, cat#11330-057
Dr William Stanford-2022
11. Décongélation des cellules ES ou iPS (par cryo-flacon)
- Sortez une plaque de matrigel de 4°C et réchauffez-la à température ambiante pendant une heure, ou préparez une nouvelle plaque de matrigel (voir le protocole de préparation de la plaque de matrigel).
- Réchauffez 4 ml de mTeSR Plus dans un tube Falcon de 15 ml.
- Retirez les cellules du réservoir d'azote liquide et faites-les tourner dans un bain à 37°C jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un petit morceau de glace. Le flacon devrait décongeler en 1 à 2 minutes. Cette étape doit être effectuée rapidement.
- Tube de cellule d'éthanol et tube de milieu Falcon et placer dans la hotte.
- Utilisez 1 ml pointe de bouche large pour lentement ajouter les cellules à 4 ml de milieu préchauffé (éviter de mélanger la suspension cellulaire).
- Essorer à 130 rcf pendant 5 minutes.
- Retirer le surnageant.
- Ajoutez 2 ml de milieu PSC et, avec une pointe à large ouverture, briser les mottes doucement. Transférer le milieu dans un puits d'une plaque à 6 puits, ajouter 2 µl d'inhibiteur ROCK (Y27632, concentration finale de 10 µM). Placer dans un puits recouvert de matrigel (d'une plaque à 6 puits).
- Secouez doucement les cellules pour les répartir uniformément et placez-les dans un incubateur hypoxique (5%O2, 10% CO2). Évitez de perturber les plaques pendant 24 heures après le semis.
NOTE: Il est très important d'éviter une décomposition excessive des amas ou un pipetage agressif. Cela peut réduire considérablement le taux de survie. Les cellules doivent rester en morceaux de 100 à 300 cellules au moment de l'ensemencement. Tout en étant doux, essayez de travailler rapidement une fois les cellules décongelées pour minimiser le temps pendant lequel elles sont en contact avec le cryoprotecteur.
- Retirer le milieu après 24 heures et ajouter 2 ml de milieu PSC (pour une plaque à 6 puits, 1 ml pour une plaque à 12 puits et 0,5 ml pour une plaque à 24 puits). Voir le protocole de récolte et d'entretien des hESC/iPSC.
Médias PSC
mTeSR Plus de Stem Cell Technologies (cat# 5825). Veuillez suivre les recommandations du fournisseur pour le stockage.
Qu'est-ce que l'inhibiteur ROCK Y27632 ?
L'inhibiteur ROCK Y27632 est un inhibiteur sélectif de la kinase p160 ROCK associée à Rho. Le traitement avec l'inhibiteur ROCK Y27632 prévient l'apoptose induite par dissociation des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC), augmentant le taux de survie et maintenant la pluripotence pendant la sous-culture et la décongélation des hESC et des hiPSC. Il a également été démontré que l'inhibiteur ROCK Y27632 améliore le taux de survie des cellules souches pendant la cryoconservation. Notez que les aliquotes d'inhibiteur Rock sont sensibles à la lumière et aux cycles répétitifs de congélation-décongélation. Assurez-vous d'utiliser ces aliquotes pendant la durée de conservation recommandée par le fournisseur.
Dr William Stanford-2022
12. Récolte et entretien des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et cellules souches embryonnaires in vitro (iPSC)
- Le lendemain de la décongélation des cellules, examinez-les au microscope pour déterminer le taux de survie. REMARQUE : il est normal d'observer un nombre élevé de cellules non attachées. Tant que certaines cellules sont attachées, des colonies peuvent en émerger en 3 à 7 jours.
- Retirer le milieu des puits et pipeter 2 ml (pour une plaque à 6 puits, 1 ml pour une plaque à 12 puits et 0,5 ml pour une plaque à 24 puits) de milieu PSC frais et chaud par puits. Remettre la plaque dans l'incubateur.
- Les cellules sont nourries jusqu'à ce que 60-70% soit confluent (suivre les recommandations du fournisseur).
- À partir du deuxième jour, les cellules doivent être observées et nettoyées de toutes les cellules différenciées qui pourraient se développer.
- Pour nettoyer les cellules, utilisez la hotte de prélèvement et grattez les cellules différenciées avec une pointe de pipette.
- Une fois les cellules nettoyées, changez le support comme indiqué dans les étapes ci-dessus.
(Voir Congélation des hESC/iPSC ou Transfert des hESC/iPSC)
NOTE:
Il a été déterminé que le milieu PSC était plus efficace dans un environnement hypoxique. Nous avons également observé que la différenciation des cellules était moindre lorsque celles-ci étaient cultivées dans des incubateurs hypoxiques par rapport à des incubateurs normoxiques. Enfin, les cellules ensemencées ont un meilleur taux de survie lorsqu'elles sont cultivées dans un incubateur hypoxique.
Normoxique : 37°C, 21%O2, 5% CO2
Hypoxique : 37°C, 5%O2, 10% CO2
Dr William Stanford-2022
13. Passage des hESC/iPSC
- Ajoutez 2 ml de milieu PSC à une plaque revêtue de matrigel à 6 puits et réservez.
- Prenez la plaque à repiquer et retirez le milieu du puits et lavez une fois avec 1 ml de PBS (-/-).
- Ajoutez 1 ml de solution EDTA dans le puits et laissez reposer 3 à 4 minutes à température ambiante. Ne déplacez pas la plaque car les cellules peuvent commencer à se détacher.
- Retirez la solution EDTA et ajoutez 1 ml de milieu PSC. Ne laissez pas l'EDTA sur les cellules pendant plus de 4 minutes, car cela provoquerait le décollement des cellules.
- Grattez les cellules à l'aide d'un grattoir à cellules et répartissez-les dans les 6 puits de votre plaque contenant le milieu PSC. Évitez de briser excessivement les morceaux de la colonie et essayez d'être doux avec le grattage. Essayez de conserver les cellules en gros morceaux. Utilisez une pointe de pipette à large ouverture pour briser les amas si nécessaire. Une fragmentation excessive des cellules peut entraîner la mort cellulaire ou une différenciation spontanée excessive après le passage.
- Incuber à 37°C après avoir réparti uniformément les cellules dans chaque puits (agitation en forme de 8 ou de L). Éviter de perturber la plaque pendant 24 heures après le passage.
NOTE:Une fois les cellules grattées, vous souhaitez les transférer sur la nouvelle plaque dès que possible car les cellules se rattacheront rapidement (dans les 5 minutes).
Si l'EDTA reste sur les cellules pendant plus de 4 minutes, les cellules peuvent commencer à se détacher. Si cela se produit, récupérez simplement les cellules dans un Falcon de 15 ml avec 4 ml de milieu PSC. Faites tourner les cellules à 130 rcf pendant 5 minutes. Remettez le culot en suspension avec 1 ml de milieu et répartissez-le uniformément dans une plaque revêtue de matrigel à 6 puits (160 µl par puits).
Solution EDTA : ajouter 500 µl d'EDTA 0,5 M (pH 8,0) dans 500 ml de DPBS (-/-). Ajouter 0,9 g de NaCl. Filtrer la solution pour la stériliser et la conserver à 4 °C jusqu'à 6 mois.
Extrait du journal :
Passage et expansion de colonies de cellules souches pluripotentes humaines par dissociation sans enzyme dans des conditions de culture chimiquement définies
Bières Jeanette,1 Daniel R. Gulbranson,2,3 Nicole George,4Lauren I. Siniscalchi,1 Jeffrey Jones,4,5 James A. Thomson,2,3,6 et Guokai Chen1,2
14. Congélation des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et cellules souches embryonnaires in vitro (iPSC)
- Allumez le Bio-Cool (congélateur à température contrôlée) et réglez la température à -7°C.
- Retirez les cellules de l’incubateur et observez la confluence et la morphologie au microscope.
- Si les puits sont confluents avec 70%, retirez l'ancien milieu et lavez une fois avec du PBS (-/-), puis ajoutez 1 ml de solution EDTA (voir passage avec la solution EDTA) par puits.
- Incuber à température ambiante pendant 3 à 4 minutes.
- Aspirez la solution EDTA et ajoutez 1 mL de milieu mFreSR froid (cat#05855, Stem Cell Technologies).
- Utilisez un grattoir à cellules pour soulever délicatement les cellules. Conservez les cellules en gros morceaux autant que possible et évitez de les pipeter de haut en bas.
- Transférez les cellules/mFreSR dans un cryotube à l'aide d'un embout à large ouverture. Conservez les flacons sur glace jusqu'à l'étape 8.
- Placer les tubes dans Bio-Cool et incuber pendant 10 minutes.
- Obtenez de l'azote liquide.
- Après 10 minutes, ensemencez les cellules en trempant une spatule dans de l'azote liquide et en touchant le côté du cryo-flacon pendant environ 10 à 30 secondes ou jusqu'à ce que vous voyiez un cristal se former sur le côté du cryo-flacon.
- Démarrez le programme 1 en appuyant sur le bouton « PROG » et parcourez le programme en appuyant à nouveau sur le bouton et vous devriez voir le taux de 0,5°C/min. , puis appuyez sur « RUN ».
- Une fois la température atteinte -65°C, les cryotubes peuvent être transférés et stockés dans de l'azote liquide.
Alternatives
Une autre option consiste à placer les cryotubes dans un récipient de congélation (Biocision-CoolCell) et à les conserver à -80°C pendant la nuit. Le lendemain, transférez les cryotubes dans l'azote liquide (en phase liquide ou vapeur).
Dr William Stanford-2022