1. Informations de base du CPSI pour le non-scientifique

Les cellules souches sont des cellules «immatures» qui ne se sont pas encore engagées à devenir un seul type de cellule. Ils sont flexibles car ils ont le potentiel de se développer en de nombreux types différents de cellules matures dans le corps, telles que les cellules qui composent le cœur ou les vaisseaux sanguins, et d'autres tissus et organes. En 2007, des chercheurs ont découvert une stratégie de création de cellules souches en laboratoire en reprogrammant des cellules adultes matures que nous cultivons couramment à des fins de recherche.^{1, 2} . Ces cellules souches créées artificiellement sont appelées cellules souches pluripotentes induites («iPSC»). Pour le domaine de la Progeria, c'est une énorme avancée. Pour la première fois, les scientifiques peuvent désormais fabriquer des cellules souches de Progeria et poser des questions sur le fonctionnement et le développement des cellules souches dans Progeria. Auparavant, il n'y avait aucune source de cellules souches humaines de Progeria, et il y avait donc un manque d'informations sur le fonctionnement des cellules souches de Progeria par rapport aux cellules souches de personnes sans Progeria. En outre, les scientifiques peuvent reprogrammer les cellules souches Progeria pour créer, pour la première fois, des vaisseaux sanguins Progeria matures, des cellules cardiaques et d'autres types de cellules. Jusqu'à présent, il n'y avait aucune source de cellules de cœur ou de vaisseaux sanguins Progeria humaine.  Nous pouvons maintenant demander à la clé questions sur les maladies cardiaques qui mènent à la mort prématurée de Progeria par crise cardiaque et accident vasculaire cérébral. Nous pouvons comparer ces découvertes avec les maladies cardiaques et le vieillissement de la population générale et en savoir plus sur ce qui influence le vieillissement en chacun de nous. Plusieurs excellentes études ont déjà été publiées sur les cellules souches Progeria.^3-5  Notre objectif à la Progeria Research Foundation est de faciliter de nombreuses autres découvertes en utilisant cet outil inestimable. Pour une introduction sur les cellules souches, veuillez consulter ce site Web du gouvernement américain: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Objectif de la production et de la distribution de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) par la Progeria Research Foundation

La fondation de recherche Progeria a pour mission de découvrir des traitements et le traitement curatif du syndrome de Hutchinson-Gilford Progeria et de ses troubles liés au vieillissement. Dans 2009, PRF a noué une collaboration avec une équipe d'experts scientifiques de l'Université de Toronto, au Canada, sous la direction de William Stanford, Ph.D., afin de générer des CSPi Progeria de haute qualité. Le Dr Stanford est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en biologie intégrative des cellules souches. Depuis 2011, PRF continue de collaborer avec le Dr Stanford de l'Université d'Ottawa, au Canada, où il est professeur de médecine cellulaire et moléculaire à la Faculté de médecine et chercheur principal au Centre de recherche sur les cellules souches Sprott de l'Institut de recherche de l'Hôpital d'Ottawa.

Notre objectif est de fournir cet outil précieux aux chercheurs du monde entier. Ce nouvel outil de recherche sera utilisé pour générer de nouvelles recherches innovantes sur Progeria, ainsi que sur sa relation avec les maladies cardiaques et le vieillissement.  

3. Génération de cellules souches pluripotentes induites par le syndrome de Hutchinson-Gilford (CSPI)

Les cellules souches induites pluripotentes (iPSC) ont été dérivées en utilisant la transduction rétrovirale pseudotypée VSVG de quatre facteurs humains, Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc en fibroblastes. Les colonies iPSC ont été dérivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). La procédure utilisée était essentiellement celle décrite précédemment mais sans l'utilisation du rapporteur EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Contrôle qualité: validation et caractérisation

Les lignes actuellement disponibles ont subi plusieurs étapes de validation (voir les fichiers PDF téléchargeables ci-dessous):

5. Matériel de départ original à partir duquel ces cellules iPS ont été dérivées

Les iPSC sont dérivées de lignées cellulaires de fibroblastes non transformées PRF Cell & Tissue Bank.

Le procédé de transduction utilisé pour toutes les lignées iPS était le retrovirus MKOS.

ID de ligne iPSC	Mutation	Genre et DonationAge	Type de cellule d'origine Cliquez ici.	Données à l'appui
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C> T	Homme 2yr 0mo	Fibroblastes dermiques HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Homme 2yr 0mo	Fibroblastes dermiques HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Homme 2yr 0mo	Fibroblastes dermiques HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Homme 8yr 5mo	Fibroblastes dermiques HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C> T	Homme 8yr 5mo	Fibroblastes dermiques HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Mère de HGADFN167 (non affectée)	37yr femelle 10mo	Fibroblastes dermiques HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Mère de HGADFN167 (non affectée)	37yr femelle 10mo	Fibroblastes dermiques HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Père de HGADFN167 (non affecté)	40yr mâle 5mo	Fibroblastes dermiques HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Père de HGADFN167 (non affecté)	40yr mâle 5mo	Fibroblastes dermiques HGFDFN168	168 iPS1P

6. Rejoignez notre liste de diffusion pour les futures mises à jour iPSC et les nouvelles lignées cellulaires

Nous continuons à générer des lignes iPSC. Si vous souhaitez des mises à jour périodiques sur les iPSC détenus dans la banque de cellules et de tissus PRF, veuillez vous inscrire à notre liste de diffusion en cliquant sur ici

7. Des questions?

S'il vous plaît contacter Leslie Gordon, MD, PhD, directeur médical, pour toute question ou besoin, à lgordon@progeriaresearch.org ou 978-535-2594

8. Commande de lignées cellulaires iPS

Dans 2014, PRF a mis en place une politique de non-modification de notre MTA. C’est le résultat de nombreuses années d’ententes contractuelles conclues avec 12 avec des équipes de recherche 70 travaillant dans des institutions situées dans des pays 14. PRF et son conseil ont pris en compte les problèmes qui se sont posés au cours de cette période et ont modifié l'accord en conséquence, donnant lieu à ce que nous considérons comme des conditions équitables et raisonnables.

Pour les institutions du gouvernement fédéral américain ou des questions, veuillez contacter Wendy Norris à: wnorris@lifespan.org or 401-274-1122 x 48063.

Étape 1: Remplir un contrat d’application et de transfert de matériel.

Application et accord pour les institutions non gouvernementales

Accord de transfert de matériel pour les institutions non gouvernementales

Étape 2: Renvoyez la demande remplie et l'accord de transfert de matériel à Wendy Norris à wnorris@lifespan.org. Une fois approuvé, vous recevrez un e-mail confirmant votre commande et la date d'expédition prévue. 

Étape 3: Le laboratoire du Dr Stanford distribue actuellement des lignes dans des cryotubes congelés. Son laboratoire vous enverra un e-mail lorsque la culture aura été expédiée, avec des informations d'expédition et de suivi. Les chercheurs inexpérimentés doivent suivre une formation dans le cadre de cours spécialisés essentiels au travail sur les cellules souches embryonnaires humaines / CSPi.

L'installation de cellules souches pluripotentes humaines (dirigée par le Dr Stanford) de l'Institut de recherche de l'Hôpital d'Ottawa offre une formation virtuelle individuelle sur les bases des techniques de culture iPSC spécifiques aux lignées cellulaires Progeria iPSC. Les options et le format de la formation sont flexibles en fonction du niveau d'expérience des scientifiques.  Pour plus d'informations, veuillez envoyer un courriel à hpscf@ohri.ca.

Étape 4: L'Université d'Ottawa vous facturera directement pour chaque ligne iPSC plus les frais de messagerie, le cas échéant.

9. Préparation des milieux de culture cellulaire HGPS et iPS de contrôle

Les iPSC et les ESC doivent être alimentés avec mTeSR Plus de Stem Cell Technologies (cat# 5825). Veuillez suivre les recommandations du fournisseur pour le stockage.

10. Préparation des plaques de Matrigel

Notes: Toutes les étapes impliquant du matrigel doivent être effectuées le plus rapidement possible et rester aussi froides que possible.

1. Décongeler la bouteille de matrigel à 4°C. Vérifiez le certificat d'analyse de ce lot pour connaître sa concentration en protéines.
2. Ajouter suffisamment de médias DMEM/F12 froids au matrigel décongelé pour atteindre une concentration finale de 5 mg/mL.
3. Faire des aliquotes de 1 ml du matrigel préparé à partir de l'étape 2 dans des tubes Falcon de 15 ml pré-réfrigérés.
4. Congeler et stocker toutes les aliquotes à -20°C.
5. Pour faire des plaques de matrigel, prélevez une aliquote de matrigel (1mL) de -20°C et ajouter 10 ml de DMEM/F12 froid. Bien mélanger jusqu'à ce que le culot dégèle (sans créer de bulles et toujours garder la solution froide).
6. Transférer dans un tube de 50 ml, puis ajouter 20 ml de DMEM/F12 froid (1 ml d'aliquote de matrigel est dilué dans 30 ml de DMEM/F12), bien mélanger.
7. Plaque (1 mL/puits pour une plaque à 6 puits, 0.5 mL/puits pour une plaque à 12 puits, 0.25 mL/puits pour une plaque à 24 puits). Assurez-vous que la solution couvre toute la surface en secouant doucement la plaque. Ne pas recongeler les restes de matrigel.
8. Si vous utilisez la plaque immédiatement, laissez la plaque reposer à température ambiante pendant 1 heure (ou 30 minutes à 37°C), observer le matrigel au microscope. Matrigel doit être bien dispersé et non « grumeleux ».
9. Si vous utilisez des plaques à un autre moment, enveloppez le bord de la plaque avec du parafilm et stockez à 4°C jusqu'à 2 semaines.

Matrigel - BD / Fisher, chat # CB-40230

DMEM / F12 - Life Technologies, Cat # 11330-057

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11. Décongélation de cellules ES ou iPS (par cryo-flacon)

1. Sortir une plaque de matrigel de 4°C et la réchauffer à température ambiante pendant une heure, ou faire une plaque de matrigel fraîche (voir protocole de préparation de la plaque de matrigel).
2. Réchauffez 4 ml de mTeSR Plus dans un tube Falcon de 15 ml.
3. Retirez les cellules du réservoir d'azote liquide et agitez-les dans un bain à 37 ° C jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un petit morceau de glace. Le flacon devrait décongeler en 1 à 2 minutes. Cette étape doit être faite rapidement.
4. Tube de cellule éthanol et tube de milieu Falcon et placer dans la hotte.
5. Utilisez un 1mL bout de bouche large à lentement ajouter des cellules à 4 ml de milieu préchauffé (éviter de mélanger la suspension cellulaire).
6. Essorer à 130 rcf pendant 5 minutes.
7. Retirer le surnageant.
8. Ajouter 2 ml de milieu PSC et avec une pointe à large ouverture casser les touffes en douceur. Transférer le milieu dans un puits d'une plaque à 6 puits ajouter 2 uL d'inhibiteur ROCK (Y27632, concentration finale de 10 uM). Plaque dans un puits recouvert de matrigel (d'une plaque de 6 puits).
9. Rocher doucement les cellules pour répartir uniformément les cellules et les placer dans un incubateur hypoxique (5 % O₂, 10% CO₂). Éviter de perturber la plaque pendant 24 heures après l'ensemencement.

   REMARQUE: Il est très important d'éviter une décomposition excessive des amas ou un pipetage agressif. Cela peut réduire considérablement le taux de survie. Les cellules doivent rester en morceaux de 100 à 300 cellules au moment de l'ensemencement. Tout en étant doux, essayez de travailler rapidement une fois les cellules décongelées pour minimiser le temps pendant lequel elles sont en contact avec le cryoprotecteur.​

10. Retirez le support après 24 heures et ajoutez 2 ml de support PSC (pour une plaque de 6 puits, 1 ml pour 12 puits et 0.5 ml pour une plaque de 24 puits). Voir Récolter et prendre soin du protocole hESC/iPSC.

PSC media

mTeSR Plus de Stem Cell Technologies (cat# 5825). Veuillez suivre les recommandations du fournisseur pour le stockage.

Qu'est-ce que l'inhibiteur de roche Y27632?

L'inhibiteur ROCK Y27632 est un inhibiteur sélectif de la kinase p160 ROCK associée à Rho. Le traitement avec l'inhibiteur ROCK Y27632 empêche l'apoptose induite par la dissociation des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et des cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC), augmentant le taux de survie et maintenant la pluripotence pendant la sous-culture et la décongélation des hESC et des hiPSC. Il a également été démontré que l'inhibiteur ROCK Y27632 améliore le taux de survie des cellules souches pendant la cryoconservation. Notez que les aliquotes d'inhibiteur de roche sont sensibles aux cycles de congélation-décongélation légers et répétitifs. Assurez-vous d'utiliser ces aliquotes dans la durée de conservation recommandée par le fournisseur.

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12. Récolter et prendre soin des hESC/iPSC

1. Le lendemain de la décongélation des cellules, examinez-les au microscope pour déterminer le taux de survie. REMARQUE : il est normal d'observer un nombre élevé de cellules non attachées. Tant que certaines cellules sont attachées, des colonies peuvent en résulter dans les 3 à 7 jours.
2. Retirez le support des puits et pipettez 2 ml (pour une plaque de 6 puits, 1 ml pour 12 puits et 0.5 ml pour une plaque de 24 puits) de support PSC frais et chaud par puits. Remettre la plaque dans l'incubateur.
3. Les cellules sont alimentées jusqu'à 60-70% de confluence (suivre les recommandations du fournisseur).
4. À partir du jour 2, les cellules doivent être observées et nettoyées de toutes les cellules différenciées qui pourraient se développer.
5. Pour nettoyer les cellules, utilisez le capot de prélèvement et grattez les cellules différenciées avec une pointe de pipette.
6. Une fois les cellules nettoyées, changez de support comme indiqué dans les étapes ci-dessus.

(Voir Congeler hESC/iPSC ou Passer hESC/iPSC)

REMARQUE:

Les médias PSC ont été déterminés comme étant plus efficaces dans un environnement hypoxique. Nous avons également observé que moins de différenciation se produit lorsque les cellules sont cultivées dans des incubateurs hypoxiques par rapport aux normoxiques. Enfin, les cellules ensemencées ont un meilleur taux de survie lors de l'utilisation d'un incubateur hypoxique.

Normoxique : 37°C, 21 % O₂, 5% CO₂

Hypoxique : 37°C, 5%O₂, 10% CO₂

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13. Réussir hESC/iPSC

1. Ajouter 2 ml de support PSC à une plaque enduite de matrigel de 6 puits et réserver.
2. Prendre la plaque à passer et retirer le support du puits et laver une fois avec 1 ml de PBS(-/-).
3. Ajouter 1 ml de la solution EDTA dans le puits et laisser reposer 3 à 4 minutes à température ambiante. Ne déplacez pas la plaque car les cellules peuvent commencer à se détacher.
4. Retirez la solution EDTA et ajoutez 1 ml de support PSC. Ne laissez pas l'EDTA sur les cellules pendant plus de 4 minutes car cela entraînerait le décollage des cellules.
5. Grattez les cellules à l'aide d'un grattoir à cellules et divisez les cellules entre les 6 puits de votre plaque contenant des supports PSC. Évitez de briser excessivement les morceaux de la colonie et essayez d'être doux avec le grattage. Essayez de garder les cellules en gros morceaux. Utilisez une pointe de pipette à large embouchure pour briser les amas si nécessaire. Une fragmentation excessive des cellules peut entraîner la mort cellulaire ou une différenciation spontanée excessive après le passage.
6. Incuber à 37 ans°C après avoir réparti uniformément les cellules dans chaque puits (agitation en 8 chiffres ou en forme de L). Éviter de déranger la plaque pendant 24 heures après le passage.

REMARQUE: Une fois les cellules grattées, vous souhaitez les transférer sur la nouvelle plaque dès que possible car les cellules se recolleront rapidement (dans les 5 minutes).

Si l'EDTA est laissé sur les cellules pendant plus de 4 minutes, les cellules peuvent commencer à se détacher. Si cela se produit, collectez simplement les cellules dans un Falcon de 15 ml avec 4 ml de milieu PSC. Faites tourner les cellules à 130 rcf pendant 5 minutes. Remettre en suspension le culot avec 1 ml de milieu et répartir uniformément sur une plaque revêtue de matrigel à 6 puits (160 uL par puits).

Solution EDTA : Ajouter 500 uL d'EDTA 0.5 M (pH 8.0) dans 500 mL de DPBS (-/-). Ajouter 0.9 g de NaCl. Filtrez la solution pour la stériliser et conservez-la à 4°C jusqu'à 6 mois.

Du papier:

Passage et expansion de colonies de cellules souches pluripotentes humaines par dissociation sans enzyme dans des conditions de culture définies chimiquement

Jeanette Beers,¹ Daniel R. Gulbranson,^2,3 Nicole George,⁴Lauren I. Siniscalchi,¹ Jeffrey Jones,^4,5 James A. Thomson,^2,3,6 et Guokai Chen^1,2

14. Congeler hESC/iPSC

1. Allumez le Bio-Cool (congélateur à taux contrôlé) et ajustez la température à -7°C.
2. Retirez les cellules de l'incubateur et observez la confluence et la morphologie au microscope.
3. Si les puits sont confluents à 70 %, retirez l'ancien support et lavez une fois avec du PBS(-/-) puis ajoutez 1 mL de solution EDTA (voir passage avec solution EDTA) par puits.
4. Incuber à température ambiante pendant minutes 3-4.
5. Aspirez la solution EDTA et ajoutez 1 ml de support mFreSR froid (cat # 05855, Stem Cell Technologies).
6. Utilisez un grattoir cellulaire pour soulever les cellules doucement. Gardez les cellules en gros morceaux autant que possible et évitez de pipeter de haut en bas.
7. Transférer les cellules/mFreSR dans un cryotube à l'aide d'une pointe à large bouche. Gardez les flacons sur la glace jusqu'à ce que vous soyez prêt pour l'étape 8.
8. Placer les tubes dans Bio-Cool et incuber pendant 10 minutes.
9. Obtenez de l'azote liquide.
10. Après 10 minutes, ensemencer les cellules en plongeant une spatule dans de l'azote liquide et en touchant le côté du cryo-flacon pendant environ 10 à 30 secondes ou jusqu'à ce que vous voyiez un cristal se former sur le côté du cryo-flacon.
11. Démarrez le programme 1 en appuyant sur le bouton "PROG" et parcourez le programme en appuyant à nouveau sur le bouton et vous devriez voir le taux de 0.5°C/min. , puis appuyez sur "EXÉCUTER".
12. Une fois que la température atteint -65°C, les cryo-tubes peuvent être transférés et stockés dans de l'azote liquide.

Alternatives

Une autre option consiste à placer les cryo-tubes dans un récipient de congélation (Biocision-CoolCell) et à les conserver à -80 °C pendant la nuit. Déplacer les cryo-tubes à l'azote liquide (phase liquide ou vapeur) le jour suivant.

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